本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种以木瓜籽胶为载体制备的固定化酶，以该固定化酶酶解文冠果蛋白制备文冠果多肽的方法。
背景技术：
文冠果(xanthocerassorbifoliabunge)为无患子科文冠果属落叶乔木或大灌木，原产于黄土高原，现广泛分布于我国北方地区，其适应性强、耐寒耐旱耐瘠薄，可在荒山丘陵地带广泛种植。是中国特有的珍稀木本油料树种，也是中国北方地区很有发展前途的水土保持树种和珍稀观赏树木。我国作为文冠果原产国，文冠果资源开发经济效益和应用前景不可估量。文冠果种子不仅可以食用，也可以开发为保健品，文冠果种仁既含有大量的油脂又含有丰富的蛋白质，其蛋白质含量为25.75％，有18种氨基酸，必须氨基酸种类齐全，且氨基酸评分较高，具有较高的营养价值。但植物蛋白的一些不良特性，如含有毒或抗营养成分，溶解性等功能特性达不到食品加工所要求的水平，限制了其在食品加工业中的应用。鉴于此，近年来科学家们在食品蛋白质改性方面做了大量的研究工作，其中酶解蛋白质是一种效果良好的方法。蛋白质降解后获得的多肽是两个或两个以上氨基酸通过肽键连接成的蛋白质片段,它是机体组织细胞的基本组成成分，具有多种生物活性：对生物体内酶具有调节作用，改善和提高矿物质运输和吸收，具有抗菌、抗病毒、提高免疫力，抗氧化、抗衰老，抗高血压、高血脂等功能特性。自生物活性肽在食品与保健品中的重要性被认识以来，采用酶法从植物资源中提取生物活性肽的研究也越来越广泛。文冠果蛋白肽具有重要的生理功能，它能够清除体内自由基，达到抗氧化、延长细胞寿命的作用。同时它的消化吸收性好、食品安全性高，故可作为营养强化剂应用于婴儿和儿童配方食品、减肥食品、运动员食品和医疗食品中，被视为“新兴的营养保健源”和“极具发展潜力的功能因子”。
酶固定化技术是二十世纪六十年代后期迅速发展起来的一项新技术，其主要是通过吸附、包埋、交联、共价接合等手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在特定的区域内进行活跃的催化作用，并可回收及多次重复使用。与传统的游离态酶相比，固定化酶技术能够实现酶的反复利用，提高酶的稳定性，使得反应连续化，实现底物和产物的有效分离、提高了酶的使用效率，以及降低了成本。近年来，随着固定化酶技术的开发以及应用范围的不断拓展，固定化酶成为活跃的研究领域之一，国内外对该酶固定化的研究也越来越多，但真正投入工业化应用的固定化酶很少，主要原因是固定化成本高、效率低、稳定性比较差。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用天然的木瓜籽胶为载体的固定化酶酶解文冠果蛋白制备文冠果多肽的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、将生物酶、木瓜籽胶、三价铬可溶性盐分别溶于磷酸缓冲液中，配制成质量浓度为0.5％～6％的生物酶溶液、质量浓度为1.5％～5％的木瓜籽胶溶液、质量浓度为1％～4％的三价铬可溶性盐溶液；然后将质量浓度为1.5％～5％的木瓜籽胶溶液、质量浓度为0.5％～6％的生物酶溶液、质量浓度为1％～4％的三价铬可溶性盐溶液按体积比为1:(0.5～1):(1～3)混合均匀，在20～50℃下静置1～12小时，离心、干燥，得到木瓜籽胶固定化酶。
2、将质量浓度为2％～5％的文冠果蛋白水溶液调节至ph值为6～10，然后按照2000～8000u生物酶/g文冠果蛋白的比例，加入木瓜籽胶固定化酶，在40～60℃下酶解30～210分钟，离心分离，上清液经冷冻干燥即得文冠果多肽。
上述步骤1中，优选将质量浓度为2.5％～4％的木瓜籽胶溶液、质量浓度为1％～2.5％的生物酶溶液、质量浓度为2.5％～4％的三价铬可溶性盐溶液按体积比为1:(0.5～1):(1～3)混合均匀，在20～50℃下静置1～12小时，离心、干燥，得到木瓜籽胶固定化酶。
上述步骤1中，进一步优选在40～50℃下静置2～9小时。
上述步骤2中，优选将质量浓度为2％～5％的文冠果蛋白水溶液用磷酸盐调节ph值至6～10，然后按照3000～5000u生物酶/g文冠果蛋白的比例，加入木瓜籽胶固定化酶。
上述步骤2中，进一步优选在50～55℃下酶解60～120分钟。
上述的生物酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶中的至少一种，所述的三价铬可溶性盐为醋酸铬或丙酸铬。
本发明以木瓜籽胶为载体、三价铬盐为交联剂固定化生物酶，其中木瓜籽胶属于天然产物，环保健康，且廉价易得、机械性能好、化学性能稳定、可生物降解，采用其固定化酶效率高，固定化方法简单，所得固定化酶为物理凝胶，具有良好的稳定性。该固定化酶由于无需成本高昂的载体，因此大大降低了成本。本发明采用该固定化酶酶解文冠果蛋白提取多肽，工艺简单，操作方便，并且酶可以回收重复利用，大大减少了资源的浪费。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、将1g木瓜蛋白酶、3g木瓜籽胶、3.8g醋酸铬分别溶于100gph＝6.5的磷酸缓冲液中，配制成质量浓度为1％的木瓜蛋白酶溶液、质量浓度为3％的木瓜籽胶溶液、质量浓度为3.8％的醋酸铬溶液；将20ml质量浓度为3％的木瓜籽胶溶液与10ml质量浓度为1％的木瓜蛋白酶溶液混合均匀后，加入60ml质量浓度为3.8％的醋酸铬溶液，在40℃下静置6小时，然后在转速为5000rpm下离心分离，将沉淀进行冷冻干燥，得到木瓜籽胶固定化酶。
2、将质量浓度为2％的文冠果蛋白水溶液用磷酸盐调节ph值至6.5后，按照3300u木瓜蛋白酶/g文冠果蛋白的比例，加入木瓜籽胶固定化酶，在55℃下酶解60分钟，酶解结束后，在离心转速为5000rpm下进行离心分离，回收木瓜籽胶固定化酶，所得上清液经冷冻干燥即得文冠果多肽，此时，文冠果蛋白的水解度为17.78％。木瓜籽胶固定化酶重复使用6次，酶活力仍保持50％以上。
实施例2
1、将1.5g蛋白酶(胰蛋白酶和中性蛋白酶按活力比为1:1混合物)、2.5g木瓜籽胶、3g丙酸铬分别溶于100gph＝8.0的磷酸缓冲液中，配制成质量浓度为1.5％的蛋白酶溶液、质量浓度为2.5％的木瓜籽胶溶液、质量浓度为3％的丙酸铬溶液；将20ml质量浓度为2.5％的木瓜籽胶溶液与20ml质量浓度为1.5％的蛋白酶溶液混合均匀后，加入40ml质量浓度为3％的丙酸铬溶液，在50℃下静置3小时，然后在转速为5000rpm下离心分离，将沉淀进行冷冻干燥，得到木瓜籽胶固定化酶。
2、将质量浓度为4.5％的文冠果蛋白水溶液用磷酸盐调节ph值至8.0后，按照3300u蛋白酶/g文冠果蛋白的比例，加入木瓜籽胶固定化酶，在50℃下酶解180分钟，酶解结束后，在离心转速为4500rpm下进行离心分离，回收木瓜籽胶固定化酶，所得上清液经冷冻干燥即得文冠果多肽，其文冠果蛋白的水解度为16.98％。木瓜籽胶固定化酶重复使用8次，酶活力仍保持50％以上。
实施例3
1、将2.5g碱性蛋白酶、4g木瓜籽胶、2.5g醋酸铬分别溶于100gph＝9.0的磷酸缓冲液中，配制成质量浓度为2.5％的碱性蛋白酶溶液、质量浓度为4％的木瓜籽胶溶液、质量浓度为2.5％的醋酸铬溶液；将20ml质量浓度为4％的木瓜籽胶溶液与10ml质量浓度为2.5％的碱性蛋白酶溶液混合均匀后，加入24ml质量浓度为2.5％的醋酸铬溶液，在45℃下静置2.5小时，然后在转速为5000rpm下离心分离，将沉淀进行冷冻干燥，得到木瓜籽胶固定化酶。
2、将质量浓度为3％的文冠果蛋白水溶液用磷酸盐调节ph值至9.0后，按照4000u碱性蛋白酶/g文冠果蛋白的比例，加入木瓜籽胶固定化酶，在55℃下酶解120分钟，酶解结束后，在离心转速为3500rpm下进行离心分离，回收木瓜籽胶固定化酶，所得上清液经冷冻干燥即得文冠果多肽，其文冠果代蛋白的水解度为19.21％。木瓜籽胶固定化酶重复使用6次，酶活力仍保持55％以上。