一种简单高效的扩增γδT细胞的方法与流程

本发明属于免疫学细胞培养技术领域，具体涉及一种扩增γδt细胞的方法。

背景技术：

γδt细胞是生物体内执行固有免疫功能的t细胞，其tcr(tcellreceptor)由γ和δ链组成。γδt细胞发挥生物学效应具有非hla限制性特点，其主要的效应是溶解靶细胞的细胞毒活性和分泌不同种类的细胞因子和趋化因子。此外，作为一种特殊的apc细胞，γδt细胞也可呈递抗原给αβt细胞，γδt细胞其他重要的生物学效应还有参与募集巨噬细胞、产生维持上皮组织完整性的生长因子等。通过这些生物效应，γδt细胞可产生抗感染、抗肿瘤、免疫调节、修复损伤等功能。vδ1、vδ2是γδt细胞的两个主要亚群，vδ1γδt细胞主要分布于胸腺和黏膜上皮组织，在外周血中也有少量存在，是黏膜表面最丰富的群落。vδ1γδt细胞被认为参与组成人体的第一道防线，在固有免疫抗感染中发挥重要作用。vδ2γδt细胞则是存在于外周血中的主要的γδt细胞，主要参与胞内病原体感染，抵抗细胞癌变发生等。目前，γδt细胞的体外诱导扩增培养方法有多种，有一些方法有效但复杂，增加了细胞培养感染的风险，有一些简便但扩增的细胞数量少，亚型单一，周期较长。培养中一些细胞分选仪器的使用以及胎牛血清等的使用也增加了临床应用安全性的风险。因此，为了更好的将γδt细胞用于临床治疗应用，如何在短时间内诱导扩增大量的γδt细胞，如何提高培养过程及使用药品的安全性，以及如何有效的扩增γδt细胞的多种亚群，提高γδt细胞免疫治疗效果，具有重要的临床应用意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种短期内高效诱导扩增大量γδt细胞的培养方法，并且此方法安全性高，所获γδt细胞亚型均衡，能为γδt细胞的临床治疗应用提供基础。

本发明的γδt细胞的诱导扩增培养方法，是在培养孔用tcr的pan-γ/δ单抗进行包被后，将外周血单个核细胞加入培养孔中，使用添加il-2因子(重组人白细胞介素2)的培养基进行培养，从培养第5d起，在培养基中添加壳寡糖(cos)，并在培养第9d时，在培养基中添加唑来膦酸(zol)，继续培养第15d时收获细胞。

其中是使用的培养基为无血清的淋巴细胞培养基；

其中il-2因子在培养基中的添加浓度为200u/ml；

其中壳寡糖、唑来膦酸的添加浓度分别为0.1mg/ml、10μm；

所述的壳寡糖，是分子量为1000，脱乙酰度不小于80％的壳寡糖。

本发明的培养方法是通过tcrpan-γ/δ单抗并联合因子il-2、cos、zol诱导人外周血来源的γδt细胞增殖，检测细胞生长状态，数量含量等。诱导培养过程简单易行，周期短，安全高效。增殖后细胞活力好，数量高，能为γδt细胞的临床应用提供基础。

附图说明

图1：细胞总体生长增殖曲线图，

图2：γδt细胞分泌tnf-a和ifn-r因子水平检测图，

图3：tcrpan-γ/δ联合il-2、cos、zol培养γδt细胞对其杀伤肿瘤细胞k562能力的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明

本发明实施例中所用流式细胞单克隆荧光抗体购自beckman公司，ldh细胞毒性检测试剂盒(碧云天牌)，pbs(takara)，淋巴细胞分离液(tbd)，elisa检测试剂盒(abcam)；无血清的淋巴细胞培养基(takara,gt-t551h3)；但本领域技术人员可以选用其它来源的同样功效的产品来替代实施例的具体产品。

实施例1:外周血单个核细胞的分离和γδt细胞的诱导培养

本实验重复了3名正常志愿者的外周血标本，

采集正常志愿者外周血15ml，加入一支50ml

离心管，肝素钠抗凝；

将含血液的离心管离心沉降，700g，12min。分为三层:上层为血浆层，中层为单个核细胞层，下层为红细胞层；

吸出上层血浆层，58℃，40min灭活，待用；

继续收集中间白膜状的单个核细胞层，加入pbs缓冲液调整体积为18ml，并平均分成2份，加入到预先加有5ml淋巴细胞分离液的15ml离心管中，离心700g，15min；

收集中间云雾层，用pbs缓冲液清洗2次，1200rpm离心7min，弃上清，用细胞培养液重悬，并计数细胞数量；

1200rpm离心7min后，弃上清，加入新鲜培养液，调整细胞密度为2×10⁶/ml，并添加il-2200u/ml，自体血浆5％；

单克隆抗体tcrpanγ/δ包被24孔板(1ug/ml)，每孔加入0.5ml，37℃培养箱内孵育3h；

将细胞接种于包被的24孔板，1.0ml/孔，每个志愿者分别设立4个复孔，其中一个孔为对照组，其余3孔再添加壳寡糖0.1mg/ml。起始培养记第1天；

培养第5、7、9、11、13天时，依据细胞生长状态补加适量新鲜培养基，并加入il-2200u/ml和自体血浆5％，实验组再补加适量cos(0.1mg/ml)，并且在第9天时加入zol10μm；

接种细胞在37℃，5％co2的细胞培养箱中持续培养15天。

在倒置相差显微镜下连续观察培养实验组细胞的生长状态，细胞在第5-9天时增殖速度快，细胞成团生长，增殖团大，增殖旺盛，第10天后增殖变慢，细胞形态多圆形，透亮度好，第13天后形态多样性开始增多，在第15天时，收获细胞，检测细胞总数量，细胞活率。第15天时，混匀细胞，每个样品取20μl，becmancounter检测其细胞浓度和活率。检测结果表明，第1天时，细胞总数为2×10⁶，培养第15天时，细胞总数达到5.8×10⁷，明显高于对照组。图1为细胞总体生长增殖曲线。

实施例2：流式细胞术检测γδt细胞的含量和亚群

分别收集实验组和对照组第1、15天的细胞，每管细胞10⁶，300g离心3min，用pbs洗涤二次，弃去上清后用滤纸吸干管口液体；

用pbs重悬细胞，加入pe-conjugatedanti-cd3单克隆抗体和fitc-conjugatedanti-γδtcr单克隆抗体各5ul，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；

另取两管15天的细胞，一管加入pe-conjugatedanti-cd3和fitc-conjugatedanti-tcrvδ2各5ul，另一管加入pe-conjugatedanti-cd3和fitc-conjugatedtcrvδ1各5ul，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；

用pbs洗涤，4℃，300g离心3min分钟，洗涤后倾倒用滤纸吸干管口液体，加入400ulpbs重悬细胞，流式细胞仪上机检测；

流式细胞仪检测：应用facsdiva软件，每管至少获取10000个细胞，以cd3和γδtcr双阳性作为γδt细胞的表型特征，计算γδt细胞占总细胞的比例；以cd3、tcrvδ1和cd3、tcrvδ2双阳性分别作为vδ1和vδ2细胞亚群的表型特征，计算γδt细胞两种亚群的含量。

流式细胞仪分析结果表明：培养第一天，分离得到的单个核细胞中，γδt细胞所占的比例为4.9％，培养第15天时，γδt细胞所占的比例已经达到92％，γδt细胞绝对数量扩增达500倍以上。γδt细胞亚型检测结果表明，γδt细胞的两个亚型vδ1和vδ2均能被有效扩增，vδ2亚群占有较大比例。表明，单克隆抗体tcrpanγ/δ联合il-2、cos和zol能有效的诱导扩增γδt细胞，并在短时间内获得大量γδt细胞，而且，γδt细胞的两个亚群可以同时被有效均衡的扩增。目前，利用tcrpanγ/δ或者利用ipp、zol等抗原扩增γδt细胞的技术，一般能使γδt细胞的绝对数量增加200～300倍左右，而本发明方法的效果可达到同类技术的2倍左右。

实施例3：γδt细胞分泌tnf-α和ifn-γ因子检测

分别收集实验组和对照组第15天的细胞，调整细胞密度2×10⁶，300g离心3min，取上清液待用；室温下平衡所有elisa试剂，准备倍比稀释标准品、空白对照；取96孔板，依次吸取50μl样品和标准品加入微孔中；依次吸取50μl抗体混合物加入微孔中，密封，室温下，轻轻摇晃混匀，孵育1h；

将微孔液体倒出，甩干，加350μl洗涤液/孔，洗板3次，最后一次甩干，倒置板子，用纸吸干残液；加100μltmb底物/孔，避光，摇晃混匀10min；加100μl终止液/孔，摇床混匀1min，酶标仪od450nm处检测读数。

结果表明，实验组相比对照组，联合zol和cos不仅能更加有效的诱导扩增γδt细胞的增殖，还可以显著提高tnf-α和ifn-γ因子的分泌，从而有助于提高培养γδt细胞对病原体的抵抗能力，促进γδt细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，提高细胞毒性。图2为γδt细胞分泌tnf-α和ifn-γ因子检测结果。

实施例4：诱导扩增γδt细胞毒性实验

将k562细胞作为靶细胞接种至96孔板中，5×10⁴/孔；将第15天收获的γδt细胞按不同的效靶比(5：1、10：1、20：1)直接加入k562细胞中，并设置对照，37℃培养箱中孵育4h；将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min，尽量吸除上清，加入150μl用pbs稀释10倍的试剂盒提供的ldh释放试剂，适当摇晃培养板混匀，继续在37℃培养箱中孵育1h；

将细胞培养板400g离心5min，分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定；各孔分别加入60μlldh检测工作液；混匀，室温避光孵育30min，然后在490nm处测定吸光度；测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度。

细胞毒性(％)＝(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100％。

实验结果表明，实验组相比对照组，联合zol和cos不仅能更加有效的诱导扩增γδt细胞的增殖，还可以提高t细胞的杀伤活性，在效靶比为5：1，10：1，20：1时，对照组杀伤率分别为15.21％，25.67％，41.03％，而实验组杀伤率则提高为20.36％，36.38％和57.36％(图3)，与对照组相比，anti-tcrpanγδ联合il-2、zol、cos因子能有效提高γδt细胞的溶瘤活性，提高γδt细胞的临床应用意义。