本发明属于生物技术领域，涉及叶片原生质体的制备，具体涉及一种千层塔(huperziaserrata(thunb.)trev.)叶片原生质体的制备方法。
背景技术：
植物原生质体培养是植物细胞和组织培养的组成部分，是随着组织培养的不断发展而发展起来的。植物原生质体培养是将除去细胞壁裸露的原生质体于无菌条件下，在合适的培养基中和条件下培养的一种技术，是开展转基因技术和体细胞杂交技术的基础。另外，原生质体作为一个单细胞系统，是研究细胞分裂与分化、细胞壁再生、信号转导机制、离子转运、细胞器摄入、病毒侵染机理等基础理论的优良实验体系。植物原生质体的研究始于1960年，当时cocking用酶法分离番茄根原生质体获得成功，随后，1971年nagata等首次以烟草叶片为材料分离原生质体，并培养获得再生植株，截至目前，至少有46个科160余属360多种植物(包括变种和亚种)的原生质体的再生体系得以建立。
千层塔(huperziaserrata(thunb.)trev.)为石松目(lycopodiales)石杉科(lycopodiaceae)石杉属(lycopodiuml.)多年生草本蕨类植物。千层塔始载于《植物名实图考》，性味辛苦、平。具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效。1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(ad，alzheimerdisease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。
但是，千层塔自然资源严重短缺。千层塔生长缓慢，野生状态下千层塔的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15年才能成熟。因此极大地限制了千层塔野生资源的再生。千层塔中的石杉碱甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉碱甲步骤繁琐、价格昂贵且有副作用。目前，石杉碱甲的提取主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006％-0.1％，因而大量的市场需求、受限的自然资源和自身生长繁殖的限制。因此，不论是石杉碱甲直接或者间接获得都是以千层塔的原植物为原料，这种自然界有限的资源将处于灭绝的边缘。千层塔在人工培育和繁殖方面最大的问题是：内生菌污染严重、生长缓慢和石杉碱甲的含量低，而通过原生质体的培养是解决这三类问题的重要途径。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种千层塔叶片原生质体的制备方法，可用于千层塔原生质体的制备和细胞融合。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种千层塔叶片原生质体的制备方法，包括：将千层塔叶片经含有抗坏血酸和甘露醇的ms固体培养基进行预培养，预培养后的千层塔叶片再经预酶解及低压再酶解即得千层塔原生质体。
具体的，ms固体培养基中抗坏血酸的含量是200～500mg/l。
具体的，ms固体培养基中甘露醇的含量是0.5～1.0mol/l。
更具体的，所述的低压再酶解是将叶片在压力为30～60kp的酶解液中进行酶解，酶解液的加入量为每克叶片添加10ml酶解液，酶解的时间是1-3小时。
最好的，所述的预酶解是将叶片在酶解液中酶解，酶解时间为2小时，酶解液的加入量为每克叶片添加10ml酶解液。
详细的，所述的预培养的时间为2天，预培养的温度为2℃，预培养的条件为黑暗条件。
还有，在千层塔叶片进行预培养之前，还需对千层塔叶片进行预处理，预处理包括：
将千层塔叶片依次经水、体积分数为75％的乙醇、体积分数为5％的naocl溶液及体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡后即可。
另外，所述的千层塔叶片在体积分数为75％的乙醇溶液中浸泡1min，千层塔叶片在体积分数为5％的naocl溶液浸泡15min，千层塔叶片在体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡10min。
与现有技术相比，本发明的优点为：
本发明的千层塔叶片原生质体制备的方法，通过将千层塔叶片经过含有vc和甘露醇的培养基上预处理之后，再经过酶解液体预培养，最后经过在低压环境的酶液处理，最终获得千层塔原生质体，和常规的单纯酶解方法相对比，显原生质体的得率和活力分别提高到3.5和2.3倍。该方法可用于千层塔原生质体的制备和细胞融合。
具体实施方式
本发明以获得并提高千层塔的原生质体的得率为目的，在传统的原生质体制备基础之上通过化学试剂和低压的合理结合，显著提高千层塔叶片原生质体的得率和活力。该方法为千层塔无菌培养体系的建立以及后期的体细胞杂交育种奠定基础。
一种千层塔叶片原生质体制备的方法，按以下步骤进行：
步骤一，千层塔叶片的表面消毒
取千层塔幼嫩叶片(生长旺盛，无卷曲，颜色无黄色或黑褐色斑点，理论上所有的千层塔叶片都可以，选取幼嫩叶片生长旺盛)，用流水冲洗干净，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡1分钟，倒掉乙醇，然后用体积分数为5％的naocl溶液浸泡15分钟后取出，倒掉naocl溶液，换用体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡，放置10分钟后取出，倒掉过氧化氢溶液，用无菌水冲洗干净，备用。
步骤二，千层塔叶片的预处理
取表面消毒的千层塔叶片，在无菌操作台上将叶片切割成1mm2的小片，再转接到含有200-500mg/l抗坏血酸和0.5-1.0mol/l甘露醇的ms固体培养基上，然后将其放入4℃和黑暗的条件下培养2天。
步骤三，千层塔叶片原生质体的制备
将预处理好的叶片转移到酶解液体中(酶解液的比例为每克叶片碎片添加10ml)，在室温下摇床中预酶解2小时，摇床转速为120转/分钟。将经过预酶解的千层塔叶片放置到低压容器中酶解，酶解的时间为1-3小时，酶解时的大气压力为30-60kp。
步骤四，千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。
千层塔叶片原生质体得率和活力的测定：
千层塔叶片原生质体得率测定：用血细胞计数板计数获取的原生质体数量。以每克鲜重叶片酶解分离得到原生质体的个数(个/g)来表示产量。
千层塔叶片原生质体活力测定：用荧光素双醋酸酯(fda)染色法来测定原生质体的活力率。用有活力的原生质体占全部观察原生质体的百分比(原生质体活力率)来衡量获取样品中原生质体的活力，即:
原生质体活力率＝被染色的原生质体数/原生质体总数×100％
这里的各成分是按照每升液体计算的，ms是组织培养中比较常规的培养基，固体ms培养基，在上述成分中添加琼脂粉；
酶解液体成分是：质量百分浓度1.5％onozukar-10、质量百分浓度2.5％macerozymer-10、0.4％葡聚糖硫酸钾、5.0mmol/lcacl2、0.65mol/l甘露醇，ph＝5.8，用微孔滤膜(0.22μl)过滤除菌。
原生质体洗剂液成分是：酶解液体成分中除去onozukar-10和macerozyme，其它成分和除菌方式不变。
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1(对照1)：
1、千层塔叶片的表面消毒
取千层塔幼嫩叶片，用流水冲洗干净，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡1分钟，倒掉乙醇，然后用体积分数为5％的naocl溶液浸泡15分钟后取出，倒掉naocl溶液，换用体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡，放置10分钟后取出，倒掉过氧化氢溶液，用无菌水冲洗干净，备用。
2、千层塔叶片的预处理
取表面消毒的千层塔叶片，在无菌操作台上将叶片切割成1mm2的小片，再转接到含有0.5mol/l甘露醇的ms固体培养基上，然后将其放入4℃和黑暗的条件下培养2天。
3、千层塔叶片原生质体的制备
将预处理好的叶片转移到酶解解液体中(酶解液的比例为每克叶片碎片添加10ml)，在室温下摇床中预酶解2小时，摇床转速为120转/分钟。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是2×105个/g、原生质体活力是55％。
实施例2(对照2)：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
取表面消毒的千层塔叶片，在无菌操作台上将叶片切割成1mm2的小片，再转接到含有0.75mol/l甘露醇的ms固体培养基上，然后将其放入4℃和黑暗的条件下培养2天。
3、千层塔叶片原生质体的制备
与实施例1相同。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是8×105个/g、原生质体活力是62％。
实施例3(对照3)：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
取表面消毒的千层塔叶片，在无菌操作台上将叶片切割成1mm2的小片，再转接到含有1.0mol/l甘露醇的ms固体培养基上，然后将其放入4℃和黑暗的条件下培养2天。
3、千层塔叶片原生质体的制备
与实施例1相同。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是3×105个/g、原生质体活力是39％。
实施例4：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
取表面消毒的千层塔叶片，在无菌操作台上将叶片切割成1mm2的小片，再转接到含有200mg/l抗坏血酸和0.75mol/l甘露醇的ms固体培养基上，然后将其放入4℃和黑暗的条件下培养2天。
3、千层塔叶片原生质体的制备
与实施例1相同。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是5×105个/g、原生质体活力是65％。
实施例5：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
取表面消毒的千层塔叶片，在无菌操作台上将叶片切割成1mm2的小片，再转接到含有350mg/l抗坏血酸和0.75mol/l甘露醇的ms固体培养基上，然后将其放入4℃和黑暗的条件下培养2天。
3、千层塔叶片原生质体的制备
与实施例1相同。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是8×105个/g、原生质体活力是82％。
实施例6：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
取表面消毒的千层塔叶片，在无菌操作台上将叶片切割成1mm2的小片，再转接到含有500mg/l抗坏血酸和0.75mol/l甘露醇的ms固体培养基上，然后将其放入4℃和黑暗的条件下培养2天。
3、千层塔叶片原生质体的制备
与实施例1相同。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是2×105个/g、原生质体活力是71％。
实施例7：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
与实施例6相同。。
3、千层塔叶片原生质体的制备
将预处理好的叶片转移到酶解解液体中(酶解液的比例为每克叶片碎片添加10ml)，在室温下摇床中预酶解2小时，摇床转速为120转/分钟。将经过预酶解的千层塔叶片放置到低压容器中酶解，酶解的时间为1小时，酶解时的大气压力为30kp。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是5×106个/g、原生质体活力是66％。
实施例8：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
与实施例6相同。。
3、千层塔叶片原生质体的制备
将预处理好的叶片转移到酶解解液体中(酶解液的比例为每克叶片碎片添加10ml)，在室温下摇床中预酶解2小时，摇床转速为120转/分钟。将经过预酶解的千层塔叶片放置到低压容器中酶解，酶解的时间为3小时，酶解时的大气压力为50kp。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是7×106个/g、原生质体活力是76％。
实施例9：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
与实施例6相同。。
3、千层塔叶片原生质体的制备
将预处理好的叶片转移到酶解解液体中(酶解液的比例为每克叶片碎片添加10ml)，在室温下摇床中预酶解2小时，摇床转速为120转/分钟。将经过预酶解的千层塔叶片放置到低压容器中酶解，酶解的时间为2小时，酶解时的大气压力为50kp。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是8×106个/g、原生质体活力是80％。
实施例10：
1、千层塔叶片的表面消毒
与实施例1相同。
2、千层塔叶片的预处理
与实施例6相同。
3、千层塔叶片原生质体的制备
将预处理好的叶片转移到酶解解液体中(酶解液的比例为每克叶片碎片添加10ml)，在室温下摇床中预酶解2小时，摇床转速为120转/分钟。将经过预酶解的千层塔叶片放置到低压容器中酶解，酶解的时间为2小时，酶解时的大气压力为60kp。
4、千层塔叶片原生质体的收集
将经过酶解的原生质体悬浮液用200目的筛网过滤，收集滤液，再用原生质体洗剂液悬浮，再在500转/分钟下离心，收集沉淀的底部的原生质体，如此收集，悬浮，离心，重复三次，最后获得较纯的原生质体。千层塔叶片原生质体得率是7×106个/g、原生质体活力是77％。