一种氨基转移酶、突变体及其制备西他列汀的应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种ω-氨基转移酶基因、编码酶、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌和重组酶、以及该ω-氨基转移酶及其突变体酶在制备手性药物西他列汀中的应用。

(二)

背景技术：

西他列汀(sitagliptin，mk-0431)是由美国merck公司和codexis公司研制和开发，是首个获得fda批准用于治疗ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶-iv(dpp-iv)抑制剂(2016年10月)。dpp-iv是一个以同型二聚体形式存在于细胞膜上的多功能酶，它可以裂解包括胰高血糖素样肽-1和抑胃肽在内的多种肽类激素，而这两者与ii型糖尿病有着密切联系。dpp-iv抑制剂通过抑制dpp-iv减少glp-1的降解，增加glp-1的血浆浓度，从而改善餐后血糖。此外，dpp-iv抑制剂还可抑制gip、垂体腺苷酸环化酶激活多肽和胃泌素释放肽等参与调节血糖的其他肽类的降解。西他列汀能够血糖依赖性地增加胰岛素的分泌，降糖作用较为适中，不会引发低血糖的发生，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。西他列汀的商品名为捷诺维(januvia)，目前已在全世界70多个国家批准使用，近年来销售额都在40亿美元左右，是国际上药物销售额前20强的药物。

西他列汀及其中间体的合成既有完全化学法合成，也有化学法与酶法相结合的。对于化学-酶法而言关键就是要获得一种ω-氨基转移酶，其能够催化西他列汀前体酮不对称转氨生成西他列汀。

美国专利us6699871公开了一种西他列汀的化学合成方法，采用手性源来诱导出手性的alpha-氨基酸，而后通过重氮化反应产生beta-氨基酸来构建所需的手性中心。该路线所需的原料成本相对较高，反应较为麻烦，且产业化过程中工艺过程和产品质量都难以控制。

国际专利w02005003135公开了以s-苯甘氨酰胺来诱导催化氢化而合成手性胺的合成方法(默克公司)。该路线需要两次催化氢化，第一次所用的铂催化剂价格昂贵，第二次脱保护时需要用大量的pd(oh)2-c催化剂，成本较高，ee值为96％，需要进一步重结晶。

国际专利w02004087650公开了默克公司关于西他列汀的合成路线，利用手性钌催化剂对酮进行不对称氢化构建手性醇，然后将手性醇转化成手性胺。该合成方法中，需要用到钌催化的不对称氢化，催化剂价格昂贵，总收率只有52％，工艺中用到高压氢气，立体选择性也不高。

国际专利w02007050485公开了默克公司关于西他列汀的合成方法，采用了手性锗催化剂对烯胺的不对称氢化来合成手性胺，产率达到84％，ee值94％，但该方法需要用昂贵的锗手性催化剂，去除与回收也较为困难。

美国专利us8293507公开了codexis公司对节杆菌来源的氨基转移酶(ata117)进行改造得到的生物催化剂代替上述工艺中的锗催化剂，转氨得到的产物ee值达到99％。

以下专利对于合成西他列汀中间体的生产方法，公开了工艺路线。

中国专利cn102838511公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体的生产方法，采用格式试剂对手性环氧氯丙烷进行亲核取代，而后用氰化物进行取代水解合成beta-羟基酸，该方法总收率仅40％，而且采用剧毒氰化物，应用受限。

中国专利cn102485718公开了浙江海翔药业关于西他列汀合成的路线，通过采用甲硫氨酸作为手性源进行合成，但是产率仅14％。

中国专利cn103014081公开了苏州汉酶公司利用氨基转移酶将3-碳基-4-(2，4，5-三氟苯基)-丁酸甲酯转氨化为(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，但是并没有公开具体氨基转移酶的序列以及克隆方法。

中国专利cn105018440公开了南京博优康远生物医药科技有限公司利用分支杆菌氨基转移酶的突变体将3-碳基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯转化为(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，boc保护，脱保护后得到西他列汀，收率为87％。该方法收率较高，但有boc保护，脱保护的步骤，且该氨基转移酶不能直接催化西他列汀前体酮得到西他列汀。

近年来，由于化学-酶法具有高选择性及环境优化的优势，逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的首选方案。ω-氨基转移酶是生产西他列汀的关键酶。许多ω-氨基转移酶基因已被克隆，其中部分氨基转移酶的基因已在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母等)中表达，获得了酶活和选择性都较高的基因工程菌。尽管如此，对于r-型选择性转氨的天然ω-氨基转移酶报道很少，且这些ω-氨基转移酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物催化剂，因此大大限制了其应用范围。随着定向进化技术的发展，蛋白质工程越来越多地被用于改造酶的底物特异性，筛选具有较宽底物谱的新型氨基转移酶，研究其可以高效高选择性催化的手性药物及其中间体，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种ω-氨基转移酶、突变体，包括编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及在手性药物西他列汀合成中的应用。针对已报道的不对称合成西他列汀及其中间体的立体选择性不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题，本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、与溶剂耐受性好的氨基转移酶进行酶催化直接合成西他列汀，或合成西他列汀中间体进而进一步合成西他列汀的酶-化学合成方法。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)zjb-1216的ω-氨基转移酶，所述氨基转移酶氨基酸序列为seqidno：2所示，核苷酸序列为seqidno：1所示。

本发明还提供一种所述氨基转移酶在生物催化合成西他列汀中的应用(反应式见反应式1)，所述的应用以含有氨基转移酶编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以西他列汀前体酮为底物，以二甲基亚砜(dmso)为助溶剂，以磷酸吡哆醛为辅酶，以异丙胺为辅底物，以ph8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30-45℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀；所述反应体系中，湿菌体用量为10～100g/l(优选50g/l)，底物终浓度为2～50g/l，二甲基亚砜体积终浓度为10-40％(v/v)，磷酸吡哆醛终浓度0.5g/l，异丙胺终浓度10g/l。

反应式1：

第二方面，本发明提供一种氨基转移酶突变体，所述突变体的氨基酸序列为seqidno：4或seqidno：6所示。所述seqidno：4所示突变体(核苷酸序列为seqidno：3所示)是将seqidno：2所示氨基酸序列第53位的组氨酸取代为苏氨酸、第113位的酪氨酸取代为甲硫氨酸、第115位的色氨酸取代为苏氨酸、第117位的半胱氨酸取代为苏氨酸、第127位的精氨酸取代为苯丙氨酸、第140位的天冬氨酸取代为丝氨酸、第142位的缬氨酸取代为半胱氨酸、第158位的天冬酰胺取代为组氨酸、第189位的亮氨酸取代为异亮氨酸，第199位的色氨酸取代为亮氨酸，第205位的谷氨酸取代为半胱氨酸，第207位的天冬氨酸取代为天冬酰胺，第213位的丙氨酸取代为天冬氨酸或第215位的丙氨酸取代为苯丙氨酸。

所述seqidno：6所示突变体(核苷酸序列为seqidno：5所示)是将seqidno：2所示氨基酸序列第52位的亮氨酸取代为酪氨酸、第53位的组氨酸取代为苏氨酸、第72位的天冬氨酸取代为甘氨酸、第85位的苯丙氨酸取代为异亮氨酸、第113位的酪氨酸取代为甲硫氨酸、第115位的色氨酸取代为苏氨酸、第117位的半胱氨酸取代为苏氨酸、第127位的精氨酸取代为苯丙氨酸、第140位的天冬氨酸取代为丝氨酸、第142位的缬氨酸取代为半胱氨酸、第158位的天冬酰胺取代为组氨酸、第189位的亮氨酸取代为异亮氨酸，第199位的色氨酸取代为亮氨酸，第205位的谷氨酸取代为半胱氨酸，第207位的天冬氨酸取代为天冬酰胺，第213位的丙氨酸取代为天冬氨酸，第215位的丙氨酸取代为苯丙氨酸，第259位的丙氨酸取代为脯氨酸，第263位的精氨酸取代为酪氨酸，第274位的丙氨酸取代为甘氨酸，第287位的脯氨酸取代为丝氨酸。

本发明还提供一种所述氨基转移酶突变体在生物催化合成西他列汀中的应用，所述的应用为：以含有氨基转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以西他列汀前体酮为底物，以二甲基亚砜为助溶剂，以磷酸吡哆醛为辅酶，以异丙胺为辅底物，以ph8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30-45℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀；所述反应体系中，湿菌体用量为10～100g/l，底物终浓度为2～50g/l，二甲基亚砜体积终浓度为10-40％(v/v)，磷酸吡哆醛终浓度0.5g/l，异丙胺终浓度10g/l。

进一步，本发明还提供一种所述氨基转移酶突变体在生物催化合成西他列汀中间体中的应用，当突变体的氨基酸序列为seqidno：6所示时，所述的应用为：以含有氨基转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以潜手性羰基化合物为底物，以二甲基亚砜为助溶剂，以磷酸吡哆醛为辅酶，以异丙胺为辅底物，以ph8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度25-35℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀中间体，对西他列汀中间体进行boc保护，然后用boc的转氨产物合成西他列汀；所述反应体系中，湿菌体用量为10～100g/l，底物终浓度为20～60g/l，二甲基亚砜体积终浓度为10-40％(v/v)，磷酸吡哆醛终浓度0.5g/l，异丙胺终浓度10g/l；所述底物为下列之一：3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。

反应式2：

其中，中间体的-r为：-och3,-och2ch3,-och2ch2ch3,-och(ch2)2,-oc(ch3)3,-och2c6h5。

本发明所述反应液分离纯化西他列汀的方法为：反应结束后，用浓盐酸将反应液ph调至1.5，加入硅藻土吸附细胞，搅拌20min，过滤，获得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入1m盐酸，搅拌20min，抽滤，获得滤液b和滤渣b；合并滤液a和滤液b，用二氯甲烷萃取一次，获得有机相a和水相a，有机相a用1m盐酸萃取，获得有机相b和水相b，合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节ph至12，再用二氯甲烷萃取，获得有机相c和水相c，水相c中再加入二氯甲烷萃取，获得有机相d和水相d，合并有机相c和有机相d并用饱和氯化钠水洗二次，加入无水硫酸钠干燥，抽滤去除硫酸钠，45℃下旋转蒸发，得到西他列汀；所述硅藻土用量以反应液体积计为0.18g/ml。(以400ml反应体系为例)，i.用浓盐酸(质量分数为36％-38％)将反应液ph调至1.5，加入72g硅藻土吸附细胞，搅拌20min，抽滤，获得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入600ml的1m盐酸，搅拌20min，抽滤，获得滤液b和滤渣b；ii.合并滤液a和滤液b总计共约1.0l，以500ml二氯甲烷萃取一次，获得水相a和有机相a，有机相a用100ml的1m盐酸萃取，获得水相b和有机相b，合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节ph至12再加入1.2l二氯甲烷萃取，获得有机相c和水相c，水相c中再加入800ml二氯甲烷萃取，获得有机相d和水相d，合并有机相c和有机相d；iii.有机相c和有机相d用饱和氯化钠(36g/l)水洗二次，加入无水硫酸钠干燥，抽滤去除硫酸钠，45℃下旋转蒸发，最后得到高纯度西他列汀白色粉末20.5g，(白色粉末状)纯化收率84％，西他列汀纯度大于99％。本发明所述滤液a-滤液c，滤渣a-滤渣c，有机相a-有机相d，水相a-水相d中的字母均无含义，为了便于表述而命名。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含有氨基转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体od600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得所述的湿菌体。

本发明所述西他列汀中间体合成西他列汀的方法主要分为三个步骤：(1)西他列汀中间体的boc保护；(2)boc保护的转氨产物合成boc保护的西他列汀；(3)boc保护的西他列汀的脱保护，具体为：将西他列汀中间体溶于体积浓度50％四氢呋喃水溶液中，加入naoh，冰浴下加入(boc)2o，室温(25℃)下反应12小时，加入碳酸钠调节ph为12，用二氯甲烷萃取，舍弃有机相，水相用1n盐酸调节ph为2，二氯甲烷萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，甲醇重结晶，得boc保护的中间体；所述中间体与naoh物质的量之比为1:2，所述中间体与(boc)2o的物质的量之比为1:1.1。第二步为boc保护的转氨产物合成boc保护的西他列汀：取boc保护的中间体和三氟甲基三氮唑并哌嗪盐酸盐至二氯甲烷中，冰盐浴下加入1-羟基苯并三氮唑与1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳酰亚胺盐酸盐，滴加三乙胺，25℃下(并搅拌)反应24小时，反应液用水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂得boc保护的西他列汀；所述boc保护的中间体与三氟甲基三氮唑并哌嗪盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳酰亚胺盐酸盐、三乙胺物质的量之比为1:1:1:1.2:3。第三步是boc保护的西他列汀的脱保护。取boc保护的西他列汀加入甲醇中，加入浓盐酸(质量浓度36-38％):甲醇体积比＝1:5的混合液，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去甲醇，用na2co3中和，用乙酸乙酯萃取，取有机相用无水硫酸镁干燥，除溶剂得油状物，加入体积比6:1的乙醇与水溶液，加热到80℃，加入浓磷酸，搅拌2小时降至室温搅拌12小时，析出固体，即西他列汀磷酸盐；所述甲醇、混合液、乙醇水溶液体积用量(以boc保护的西他列汀物质的量计)为5l/mol，5l/mol、7l/mol。

本发明所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有氨基转移酶活性的衍生的氨基酸序列具有至少95％同一性的蛋白质，均属于本发明的保护范围。seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质可以从唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)zjb-1216中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的同一性均可通过本领域常用的算法得到，优选采用ncbiblastp和blastn软件根据默认参数计算得到。

本领域技术人员所知，由于密码子的兼并性，编码seqidno:2、4、6的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于seqidno:1、3、5。本发明的氨基转移酶基因还可以是通过在seqidno:1、3、5适当引入替换、缺失、或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。

本发明还涉及含所述氨基转移酶、突变体基因的重组载体，利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明将氨基转移酶基因(或者突变体基因)同表达载体pet28b连接，构建了含有氨基转移酶基因的异源表达重组质粒pet28b-bgta。将表达重组质粒pet28b-bgta转化至大肠杆菌bl21(de3)中，获得含有重组质粒pet28b-bgta的重组大肠杆菌/pet28b-bgta。

本发明还涉及氨基转移酶基因在制备重组氨基转移酶中的应用，具体为：构建含有所述氨基转移酶基因的重组载体，将所示重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组氨基转移酶的菌体细胞，破碎后的氨基转移酶粗酶液以及纯化后氨基转移酶纯酶。

本发明所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)zjb-1216，该菌的保藏编号为cctccm2012379(中国武汉，中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年9月25日)，已在专利申请中(申请号cn201510026596.7)公开。

本发明所述催化剂包括氨基转移酶及其突变体纯酶、相应的重组基因工程菌湿菌体、粗酶液、粗酶粉、纯酶液(终浓度用量为66.7mg/l反应体系)、纯酶粉等其他形态。

本发明seqidno:2所示的ω-氨基转移酶和节杆菌来源的氨基转移酶ata117-rd11(目前唯一能直接转化西他列汀前体酮得到西他列汀的ω-氨基转移酶突变体，美国专利us8293507)的氨基酸序列一致性为33％，具有显著差异性。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：针对己报道的不对称合成西他列汀及其中间体的总收率不高(一般低于50％)，立体选择性偏低(产物e.e.值普遍低于90％)、金属催化剂昂贵、生物催化剂不能直接以西他列汀前体酮为底物的问题，本发明提供了来源于一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)zjb-1216的氨基转移酶及其突变体(生物催化剂)，直接以潜手性羰基化合物西他列汀前体酮为底物，同时异丙胺为氨基供体，磷酸吡多醛为辅酶，进行生物催化反应、分离纯化制备高光学纯度的西他列汀，即(3r)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，该方法的总收率达到76％(包括转化得率及分离纯化收率)，产物e.e.值达到99％(立体选择性高)。本发明还提供了该氨基转移酶及其突变体的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其制备方法，以及该氨基转移酶及其突变体在催化羰基底物不对称转氨合成西他列汀中间体的用途。

(四)附图说明

图1美国专利us6699871中西他列汀的化学合成路线。

图2国际专利w02005003135中西他列汀的化学合成路线。

图3国际专利w02004087650中默克公司关于西他列汀的合成路线。

图4国际专利w02007050485中西他列汀的合成方法。

图5中国专利cn102838511中西他列汀的合成方法。

图6中国专利cn105018440中西他列汀的合成路线。

图7为pmd18-t-bgta重组质粒物理图谱；

图8为pet28b-bgta重组质粒物理图谱；

图9为氨基转移酶基因pcr扩增琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为dl2000dnamarker；泳道2和3为利用引物1和引物2扩增得到的氨基转移酶基因片段；泳道4和5为利用引物3和引物4扩增得到的氨基转移酶基因片段；

图10为氨基转移酶纯化后的sds-page图：泳道1为蛋白质分子量marker，泳道2为纯化后的氨基转移酶bgta；

图11为大引物pcr琼脂糖凝胶电泳图megawhoppcr(大引物pcr)产物的凝胶电泳图。其中，泳道m为dl2000dnamarker；泳道1为大引物pcr产物。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：氨基转移酶基因bgta的扩增

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)zjb-1216是从土壤中分离得到的，保存在中国典型培养物保藏中心(保藏编号cctccno:2012379，已在专利申请中公开，申请号cn201510026596.7)。

根据genbank收录的来自伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)的氨基转移酶基因测序信息为依据，用核酸快速提取仪提取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)zjb-1216菌体的总基因组dna，以该基因组dna为模板，在引物1(atggctatcatccaggttcagcagatc)、引物2(agccggaacagaagagaagtattc)的作用下进行pcr扩增。pcr反应体系(总体积50μl)：10×pfudnapolymerasebuffer5μl，10mmdntpmixture(datp、dctp、dgtp和dttp各2.5mm)1μl，浓度均为50μm的克隆引物1、引物2各1μl，基因组dna1μl，pfudnapolymerase1μl，无核酸水40μl。

采用biorad的pcr仪，pcr反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

pcr反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用taqdna聚合酶向片段5’端引入碱基a。在t4dna连接酶作用下将该片段同pmd18-t载体进行连接，得到克隆重组质粒pmd18-t-bgta见图7。将该重组质粒转化至大肠杆菌jm109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为978bp(bgta基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示，编码蛋白的氨基酸序列为seqidno：2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。

实施例2：重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgta的构建

根据实施例1bgta基因序列设计引物3(ccgcatatggctatcatccag

gttcagc)、引物4(ttgctcgagtcaagccggaacagaagag)，并分别在引物3和引物4中引入了ndei和xhoi限制性酶切位点(下划线标记)。在引物3和引物4的引发下，利用高保真pfudna聚合酶进行扩增，以重组质粒pmd18-t-bgta为模板(实施例1中获得)，获bgta基因序列，测序后利用ndei和xhoi限制性内切酶(takara)对扩增片段进行处理，并利用t4dna连接酶(takara)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pet28b(invitrogen)进行连接，构建表达载体pet28b-bgta(图8)。将构建的表达载体pet28b-bgta转化至大肠杆菌bl21(de3)(invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pet28b-bgta的重组大肠杆菌bl21(de3)/pet28b-bgta。

实施例3：氨基转移酶(ω-bgta)的诱导表达

将实施例2获得的重组大肠杆菌bl21(de3)/pet28b-bgta接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体od600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgta湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。

实施例4：氨基转移酶(ω-bgta)的分离纯化

将实施例3中获得的湿菌体以结合缓冲液(50mm，ph8.0磷酸钠缓冲液，含300mmnacl，10mm咪唑)重悬后，经超声破碎(冰浴条件下，240w破碎10min，工作2s暂停2s)，12000rpm离心40min，上清与经上述结合液平衡过的ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mm，ph8.0磷酸钠缓冲液，含300mmnacl，20mm咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mm，ph8.0磷酸钠缓冲液，含300mmnacl，250mm咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mm，ph8.0磷酸钠缓冲液)透析48h(透析袋分子截留量14kd)。采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为1.8mg/ml，将酶液用50mm，ph8.0磷酸钠缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/ml分装，冻存于-80℃(氨基转移酶bgta蛋白电泳图见附图10)。

实施例5：bgta基因突变文库1的建立

以实施例2中构建质粒pet28b-bgta为模板，进行易错pcr。在引物1(5’-atggctatcatccaggttcagcagatc-3’)、引物2(5’-agccggaacagaagagaagtattc-3’)的作用下进行易错pcr。pcr反应体系(总体积50μl)：10×pfudnapolymerasebuffer5μl，10mmdntpmixture(datp、dctp、dgtp和dttp各2.5mm)1μl，浓度均为50μm的克隆引物1、引物2各0.5μm，质粒模板0.8ng/μl，taqdnapolymerase2.5u，mncl20.2mm，去离子水补足50μl。采用biorad的pcr仪，pcr反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。纯化易错pcr产物后，以该产物作为引物、实施例2中构建质粒pet28b-bgta为模板进行大引物pcr，获得大引物pcr产物(即突变体文库1)。pcr体系：大引物10ng/μl，质粒模板1ng/μl，pfudnapolymerase2.5u。pcr反应条件：去a尾72℃5min，预变性96℃2min，96℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸4min，共25个循环，最后72℃延伸10min。大引物pcr产物的凝胶电泳图(见图11)。

实施例6：bgta基因突变文库1的低底物浓度筛选获得突变体1

将实施例5基因文库1转入大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，在含有50μg/ml卡那霉素的lb抗性平板上挑取单克隆6681个，分别接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中进行诱导表达，诱导条件如实施例3，获得6681个含有突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体，即突变体湿菌体。

得到含有突变蛋白的大肠杆菌后，对2g/l低浓度西他列汀前体酮进行生物转化，催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：突变体1湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，2g/l底物西他列汀，dmso终浓度为10％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以含空载体的大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述突变体湿菌体作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)(50:50乙腈：水，10mm乙酸铵，0.8ml/min流速，268nm检测波长)，从6681个蛋白中挑选出底物的转化率最高的一个突变体pet28b-bgtamut1，转化率为为95％，ee>99％。突变体pet28b-bgtamut1的核苷酸序列与氨基酸序列如序列表中的seqidno:3和seqidno:4所示。突变体1是将seqidno：2所示氨基酸第53位的组氨酸取代为苏氨酸、第113位的酪氨酸取代为甲硫氨酸、第115位的色氨酸取代为苏氨酸、第117位的半胱氨酸取代为苏氨酸、第127位的精氨酸取代为苯丙氨酸、第140位的天冬氨酸取代为丝氨酸、第142位的缬氨酸取代为半胱氨酸、第158位的天冬酰胺取代为组氨酸、第189位的亮氨酸取代为异亮氨酸，第199位的色氨酸取代为亮氨酸，第205位的谷氨酸取代为半胱氨酸，第207位的天冬氨酸取代为天冬酰胺，第213位的丙氨酸取代为天冬氨酸或第215位的丙氨酸取代为苯丙氨酸。

实施例7：bgta基因突变文库2的建立

该实施例中易错pcr的溶液的配比，及pcr方案与实施例5中一致，唯一的区别就是模板为表达突变体1的质粒pet28b-bgtamut1，构建突变体文库2。

实施例8：bgta基因突变文库2的高底物浓度筛选获得突变体2

将实施例7基因文库2转入大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，在含有50μg/ml卡那霉素的lb抗性平板上挑取5814个单克隆，分别接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中进行诱导表达，诱导条件如实施例3，获得5814个含有突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体，即突变湿菌体。

对50g/l高浓度西他列汀前体酮的生物转化，催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：突变湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，50g/l底物西他列汀前体酮，dmso终浓度为40％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间12-36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述含突变湿菌体作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，挑选出底物的转化率最高的一个突变蛋白2，转化率为为95％，ee>99％。突变体pet28b-bgtamut2的核苷酸序列与氨基酸序列如序列表中的seqidno:5和seqidno:6所示。突变体pet28b-bgtamut2是将seqidno：2所示氨基酸第52位的亮氨酸取代为酪氨酸、第53位的组氨酸取代为苏氨酸、第72位的天冬氨酸取代为甘氨酸、第85位的苯丙氨酸取代为异亮氨酸、第113位的酪氨酸取代为甲硫氨酸、第115位的色氨酸取代为苏氨酸、第117位的半胱氨酸取代为苏氨酸、第127位的精氨酸取代为苯丙氨酸、第140位的天冬氨酸取代为丝氨酸、第142位的缬氨酸取代为半胱氨酸、第158位的天冬酰胺取代为组氨酸、第189位的亮氨酸取代为异亮氨酸，第199位的色氨酸取代为亮氨酸，第205位的谷氨酸取代为半胱氨酸，第207位的天冬氨酸取代为天冬酰胺，第213位的丙氨酸取代为天冬氨酸，第215位的丙氨酸取代为苯丙氨酸，第259位的丙氨酸取代为脯氨酸，第263位的精氨酸取代为酪氨酸，第274位的丙氨酸取代为甘氨酸，第287位的脯氨酸取代为丝氨酸。

实施例9：重组氨基转移酶bgta在制备西他列汀中的应用

以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgta湿菌体或通过实施例4的方法得到bgta纯酶作为生物催化剂，以西他列汀前体酮为底物，进行生物催化反应合成西他列汀：(3r)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

低底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或bgta酶蛋白1mg，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，底物西他列汀前体酮2g/l，dmso终浓度为10％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgta作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，反应体系的底物的转化率为2.1％，ee>99％。

高底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或bgta酶蛋白1mg，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，底物西他列汀前体酮50g/l，dmso终浓度为40％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgta作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，反应体系的底物的转化率为小于1％。

实施例10：重组氨基转移酶bgta突变体1在制备西他列汀中的应用

将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgtamut1湿菌体或通过实施例4的方法得到bgta突变体1纯酶作为生物催化剂，以西他列汀前体酮为底物，进行生物催化反应合成西他列汀：(3r)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

低底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或bgta突变体1酶蛋白1mg，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，2g/l底物西他列汀前体酮，dmso终浓度为10％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgtamut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)。最优地，反应体系的底物浓度为2g/l时，底物的转化率为95％，ee>99％。

高底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或bgta突变体1酶蛋白1mg，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，50g/l底物西他列汀前体酮，dmso终浓度为40％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgtamut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)。底物的转化率为59％，ee>99％。

实施例11：重组氨基转移酶bgta突变体2在制备西他列汀中的应用

将实施例8中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-tamut2湿菌体或通过实施例4的方法得到bgta突变体2纯酶作为生物催化剂，以西他列汀前体酮为底物，进行生物催化反应合成西他列汀：(3r)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

高底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或bgta突变体2酶蛋白1mg，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，50g/l底物西他列汀前体酮，dmso终浓度为40％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度40℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-tamut2作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，底物的转化率为91％，ee>99％。

表1.重组bgta及其突变体催化西他列挺前体酮不对称转氨的结果

进一步，实施例12-16介绍了重组氨基转移酶ω-bgta突变体2在制备西他列汀中间体中的应用

实施例12：重组氨基转移酶ω-bgta突变体2在制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯中的应用

将实施例8中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgtamut2湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯为底物，进行生物催化反应制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。

催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/l底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，dmso终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgtamut2作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，0.12mo1底物(3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯)约得到0.10mol产物(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(23.6g)，底物的转化率为90％，ee>99％。

实施例13：重组氨基转移酶ω-bgta突变体2在制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯中的应用

将实施例8中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgtamut2湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯为底物，进行生物催化反应制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯。

催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/l底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯，dmso终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-ta作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，底物的转化率为91％，ee>99％。

实施例14：重组氨基转移酶ω-bgta突变体2在制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯中的应用

将实施例8中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgtamut2湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯为底物，进行生物催化反应制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯。

催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/l底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯，dmso终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-ta作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，底物的转化率为92％，ee>99％。

实施例15：重组氨基转移酶ω-bgta突变体2在制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯中的应用

将实施例8中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-tamut2湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯为底物，进行生物催化反应制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯。

催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/l底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯，dmso终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-bgta作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，底物的转化率为92％，ee>99％。

实施例16：重组氨基转移酶ω-bgta突变体2在制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯中的应用

将实施例8中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-tamut2湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯为底物，进行生物催化反应制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯。

催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/l底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯，dmso终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。经验证该酶能够高选择性(ee>99％)转氨生成(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-ta作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，底物的转化率为90％，ee>99％。

实施例17：重组氨基转移酶ω-bgta突变体2在制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯中的应用

将实施例8中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-tamut2湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯为底物，进行生物催化反应制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。

催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，ph8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/l底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯，dmso终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/l，异丙胺10g/l。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌bl21/pet28b-ta作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(条件同实施例18)，底物的转化率为89％，ee>99％。

表2氨基转移酶突变体2催化羰基化合物不对称转氨反应的结果

实施例18：西他列汀前体酮、西他列汀以及西他列汀的(s)型对映体的液相检测方法。

高效液相色谱仪器：shimadzulc-16系统-spd-16紫外检测器和hitachi8dd-0801系统-1410紫外检测器。

检测转化率是色谱柱为unitaryc18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：水：乙腈＝50:50，水相加乙酸铵10mm，流速0.8ml/min，柱温40℃，检测波长：268nm。西他列汀前体酮的保留时间为7.79min。西他列汀的保留时间分别为4.84min。

检测ee手性色谱柱为chiralpakad-h(150×4.6mm,5μm)，流动相为乙醇/正庚烷/二乙胺＝60:40:0.1，流速0.8ml/min，柱温35℃，检测波长：268nm。西他列汀前体酮和西他列汀的保留时间为10.1(检测到时间是12min左右)和5.9min。西他列汀的(s)型对映体的保留时间为8.4min。(液相是shimadzulc-20ad系统-spd20a检测器)

产物eep计算公式：

eep＝(cr-cs)/(cr+cs)×100％

cr为西他列汀的峰面积，cs为s-对映体的峰面积。

实施例19：从反应体系中分离纯化得到高纯度西他列汀

取实施例11中的400ml反应液，用浓盐酸(质量分数为36％-38％)将ph调至1.5，加入72g硅藻土(中位粒径19.6μm)吸附细胞，搅拌20min。抽滤，获得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入600ml的1m盐酸，搅拌20min，抽滤，获得滤液b和滤渣b；合并滤液a和滤液b总计共约1.0l，以500ml二氯甲烷(纯度>99.5％)萃取一次，获得水相a和有机相a，有机相a用100ml的1m盐酸萃取，获得水相b和有机相b，合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节ph至12再加入1.2l二氯甲烷萃取，获得有机相c和水相c，水相c再加入800ml二氯甲烷萃取，获得水相d和有机相d，合并有机相c和有机相d用饱和氯化钠(36g/l)水洗二次，加入无水硫酸钠干燥，抽滤去除硫酸钠，45℃下旋转蒸发，最后得到白色粉末20.5g，经实施例18中的液相检测，收率为84％，西他列汀纯度为99.6％。西他列汀的总收率为76％。

实施例20：(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的boc保护

实施例12所得的0.10mo1(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(23.6g)，溶解于100ml水和100ml四氢呋喃的溶液中，加入0.20mo1naoh，冰浴下加入1g(boc)2o，室温(25℃)下反应12小时。加入碳酸钠调节ph为12，用50ml二氯甲烷萃取，舍弃有机相，水相用1n盐酸调节ph为2，50ml二氯甲烷萃取合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，甲醇重结晶，得20.3g白色固体，即boc保护的(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，产率86％。

实施例21：boc保护的转氨产物合成boc保护的西他列汀

称取0.01mol实施例20中得到的产物(3.32g)和2.28g三氟甲基三氮唑并哌嗪盐酸盐(0.01mo1)至20ml二氯甲烷中，冰盐浴下加入1.62g1-羟基苯并三氮唑(0.012mo1)与2.29g1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳酰亚胺盐酸盐(0.012mo1)，滴加3g三乙胺(0.03mol)，25℃下(并搅拌)反应24小时，反应液用20ml水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂得4.68g固体boc保护的西他列汀，产率92％。

实施例22：boc保护的西他列汀的脱保护

称取5g实施例20方法得到的boc保护的西他列汀(0.01mo1)至50ml甲醇中，加入50ml浓盐酸(质量浓度36-38％):甲醇(体积比1:5)的溶液，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去甲醇，用na2co3中和，用50ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，除溶剂得油状物。加入60ml乙醇与l0ml水，加热到80℃，加入1.5g浓磷酸，搅拌2小时降至室温搅拌12小时，析出4.1g固体即西他列汀磷酸盐。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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<110>浙江工业大学、浙江永太科技股份有限公司、浙江永太药业有限公司

<120>一种氨基转移酶、突变体及其制备西他列汀的应用

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