Th2细胞和细胞因子IL‑4作为脑卒中标志物的应用的制作方法

文档序号:12913728阅读:590来源:国知局
Th2细胞和细胞因子IL‑4作为脑卒中标志物的应用的制作方法与工艺

本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及th2细胞和细胞因子il-4作为脑卒中标志物的应用。



背景技术:

脑卒中(stroke)是当今世界危害人类生命健康的最主要疾病之一,其中缺血性脑卒中(ischemicstroke,is)是最常见的形式。缺血性脑卒中又可分为4种亚型,包括短暂性缺血性脑卒中(transientischaemicattack,tia)、可逆性缺血性神经功能障碍(reversibleischemicneurologicaldeficit,rind)、进展性卒中(strokeinprogression,sip)、完全性卒中(completestroke,cs)。

目前缺血性脑卒中发病越来越年轻化,最近的流行病学研究发现,缺血性脑卒中中年患者的百分比约43%,然而在贫穷国家百分比高达51%,发达国家为34%,这可能是由于贫穷国家存在较高的心血管危险因素。缺血性脑卒中年轻患者的发病逐年上涨,可能与吸烟、饮酒、肥胖、高血压的增加有关。因此,弄清缺血性脑卒中的发病机制、寻找有效的治疗手段至关重要。

生物标志物是指通过化学或生物方法检测血液或尿液来预测生理或病理状态与疾病危险程度的一类指示剂。生物标志物是药物研发过程中的有效工具,它提供了药物性能及疾病进程的相关信息,反映了具体的药物治疗效果。

目前,用于诊断和预测患者缺血性脑卒中预后的方法或手段主要依赖的是美国国立卫生研究院卒中量表(thenationalinstitutesofhealthstrokescale,nihss)、barthel指数以及梗死面积的检测来进行。缺乏可简单快速地易于检测的可用于反应缺血性脑卒中病情的生物标志物,这为弄清缺血性脑卒中的发病机制、寻找有效的治疗手段以及药物带来诸多不便。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供th2细胞作为脑卒中标志物的应用。

本发明的另一目的在于提供细胞因子il-4作为脑卒中标志物的应用。

本发明的另一目的在于提供细胞因子il-4抗体的应用。

本发明是这样实现的:

th2细胞作为标志物在制备脑卒中诊断试剂盒中的应用。

th2细胞作为标志物在制备预测脑卒中患者预后的试剂盒中的应用。

细胞因子il-4作为标志物在制备脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒中的应用。

细胞因子il-4抗体在制备脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒中的应用。

本发明具有以下有益效果:

本发明首次相对比较全面地独立地研究了临床病人外周血中th2细胞及其细胞因子与缺血性脑卒中的关系,结果显示,外周血th2细胞百分比及其细胞因子il-4均与nihss评分呈反比,与barthel指数呈正相关,与脑卒中病人大脑梗死面积呈反比,以上结果表明th2细胞百分比及其细胞因子il-4与脑卒中尤其是缺血性脑卒中具有明显的相关性,th2细胞及其细胞因子il-4可以作为脑卒中诊断和预后指示的生物标志物,是一种全新的脑卒中标志物;基于此,可将th2细胞或细胞因子il-4作为标志物应用于制备脑卒中诊断试剂盒或者在制备预测脑卒中患者预后的试剂盒中等领域,这为脑卒中诊断和预后提供了一种新的思路和手段,有利于加快脑卒中的发病机制研究进程,也为快速筛选出治疗脑卒中的药物提供帮助。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的不同组病人外周血中的th2细胞百分比含量的流式细胞检测结果图;

图2为本发明实施例1提供的th2细胞百分比与nihss评分、barthel指数、梗死面积的相关性分析结果;

图3为本发明实施例2提供的il-4水平与nihss评分、barthel指数、梗死面积的相关性分析结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的提供的th2细胞和细胞因子il-4作为脑卒中标志物的应用进行具体说明。

本发明的研究选取湖北省襄阳市中心医院神经内科2017年3月6日至2017年4月6日接收诊治的53例缺血性脑卒中病人为研究对象,其中男36例,女17例,年龄43岁~82岁(61.7±11.4岁);应用流式细胞仪检测各研究对象外周血中th2细胞百分比;elisa法检测th2细胞因子il-4的浓度;使用nihss评分评估缺血性脑卒中患者入院后24小时内的神经功能损伤;barthel指数被用来评估缺血性脑卒中患者日常生活自理能力;利用mri或ct计算了各研究对象大脑梗死面积;应用spass软件分析各研究对象th2细胞百分比及其细胞因子水平与nihss评分、barthel指数及大脑梗死面积的相关性。

结果显示:外周血th2细胞百分比及其细胞因子il-4均与nihss评分(评分分值越高,说明神经功能损伤越严重)呈负相关,与barthel指数(分值越高,生活自理能力越高)呈正相关,与脑卒中病人大脑梗死面积(梗死面积越大,病情越严重,预后越差)呈负相关。

以上结果表明th2细胞百分比及其细胞因子il-4与脑卒中尤其是缺血性脑卒中具有明显的相关性,th2细胞百分比及其细胞因子il-4可以作为脑卒中诊断和预后指示的生物标志物,是一种全新的脑卒中标志物,二者具有广泛的应用前景。

基于此,一方面,本发明提供了th2细胞作为标志物在制备脑卒中诊断试剂盒中的应用。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述th2细胞为外周血中的th2细胞。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述脑卒中为缺血性脑卒中。

另一方面,本发明提供了th2细胞作为标志物在制备预测脑卒中患者预后的试剂盒中的应用。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述th2细胞为外周血的th2细胞。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述脑卒中为缺血性脑卒中。

再一方面,本发明提供了细胞因子il-4作为标志物在制备脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒中的应用。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述脑卒中为缺血性脑卒中。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述细胞因子il-4为患者血清中的细胞因子il-4。

还有一方面,本发明提供了细胞因子il-4抗体在制备脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒中的应用。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒为elisa试剂盒,其含有用于检测细胞因子il-4的细胞因子il-4抗体。

还有一方面,本发明提供了cd4+抗体在制备脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒中的应用。

进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒为elisa试剂盒,其含有用于检测th2细胞的cd4+抗体。

容易理解,在基于本发明的研究结果的基础上,任何可以特异性或非特异性结合细胞因子il-4的抗体,均可以用于制备脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒,该试剂盒通过酶联免疫吸附法测定来自个体的样品中的细胞因子il-4的水平,根据细胞因子il-4的水平对个体脑卒中的病情进行诊断或预后判断。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

1.1研究对象

选取湖北省襄阳市中心医院神经内科2017年3月6日至2017年4月6日接收诊治的53例缺血性脑卒中病人为研究对象,其中男36例,女17例,年龄43岁至82岁(61.7±11.4岁)。根据1995年全国第四届脑血管疾病会议和2007年《中国脑血管病防治指南》的is诊断标准,经ct或mri检查确诊。该研究获襄阳市中心医院道德伦理委员会批准,并且依据国家卫生研究所机构审查委员会条例实施,所有参与该研究的病人均签署知情同意书。

美国国立卫生研究院卒中量表(thenationalinstitutesofhealthstrokescale,nihss)被用来评估缺血性脑卒中病人入院后24小时内的神经功能损伤。nihss评分包括15个向度:意识程度、回答问题能力、遵从指令的能力、眼球运动、视野、面部肌力、上肢运动功能、下肢运动功能、肢体协调、感觉功能、语言、构音,感觉忽视。各个向度计分为3个到5个等级,评分范围为0~42分,分数越高表示神经受损越严重。所有病人依据nihss评分划分为3组:第一组,nihss≤5(男14例,女3例,年龄60.2±13.1岁);第二组,5<nihss<15(男15例,女10例,年龄61.8±11.5岁);第三组,15≤nihss(男7例,女4例,63.9±8.4岁)

barthel指数:被用来评估缺血性脑卒中患者日常生活自理能力,检测项目包括大小便、进食、修饰、转移、活动、穿衣、上下楼等。评分值为:轻度依赖,大于60分,可独立完成部分日常活动,但需要部分帮助;中度依赖,60~41分,需要较多帮助才能完成日常生活活动;重度依赖,≤40分,绝大多数日常生活活动都无法完成或需他人照顾。

排除标准:严格地排除外伤性脑出血、动脉瘤或动脉硬化、蛛网膜下腔出血、自身免疫性疾病、糖尿病、手术、创伤或采血2周内任何形式的高烧(t>36.8℃)、急慢性感染性疾病史;冠心病、先天性心脏病、高血压性心脏病、心律失常等心脑血管疾病;甲状腺功能低下或亢进、血液系统疾病、神经异常疾病等。

研究期间,部分病人接受阿司匹林抗血小板治疗,另一部分病人接受噻氯匹啶或者氯吡格雷抗血小板治疗治疗,少部分病情轻微病人没有接受任何治疗。三组病人的基本情况如表1。

表1三组病人的基本情况

1.2材料

lymphocyteseparationmedium(淋巴细胞分离液)由mpbio公司生产;rpmi-1640培养基购买于antgene公司;cellstimulationcocktai(细胞刺激剂)购买于ebioscience公司;hucd4pe-cy5rpa-t4、huil-4pe8d4-8和cytofix/cytoperm(细胞固定/通透试剂盒)购买于bdpmg公司;humanil-4elisa试剂盒购买于neobioscience公司;phosphatebufferedsaline(pbs-20x)由cst公司生产;离心管、ep管、流式管由falcon公司生产;枪头由gpl公司生产;流式细胞仪产自beckmancoulter公司。

1.3pbmc的收集

每一个病人在接收入院后,清晨空腹状态下采集3ml外周血(peripheralblood;pb)到肝素抗凝管中,轻轻摇匀,血样采集应在症状出现后24小时内。在室温条件下加入等体积的pbs稀释,轻轻摇匀。取15ml离心管,吸取等体积的ficoll(淋巴细胞分离液)于离心管中,管倾斜45°,将稀释后的pb在ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至ficoll液上面。将处理好的血液放入4℃,2000r/min离心机中,离心30min后从管底到液面分四层,依次是红细胞层、分层液层、外周血单核细胞层(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)、血浆层。先吸取2ml血浆至ep管中,放入-80℃冰箱,以备后续elisa分析。将移液管直接插入云雾层(pbmc层),轻轻吸取云雾层,放入新的离心管中。

1.4统计学分析

计量资料以均数±标准差(x±s)表示;组间细胞因子浓度以及细胞百分比的差异采用t检验加以评估。p<0.05说明差异有显著统计学意义;组间显著地统计学差异用方差分析评估。

1.5th2细胞百分比与与nihss评分、barthel指数及梗死面积的相关性

1.5.1细胞染色及流式细胞检测th2细胞百分比

加入至少pbmc体积3倍的pbs于离心管中,4℃、2000r/min离心5min,弃上清,加入1mlrpmi-1640培养基(含10%胎牛血清),吹打混匀。再加入2ul细胞刺激剂于培养基中,将该培养基放入37℃、5%co2培养箱中培养。刺激培养4h之后,4℃、2000r/min离心5min,弃上清,再加每100ul体系10ul的cd4+抗体,4℃避光染色半小时,每10分钟轻弹一次。将充分反应后的体系用pbs洗涤,弃上清,cytofixbuffer固定。半小时后,加入2mlpbs,4℃、2000r/min离心5min,清洗2遍,弃上清,permeabilizationbuffer打孔。半小时后,加入2mlpbs,4℃、2000r/min离心5min,弃上清。再加每100ul体系10ul的il-4抗体染色,4℃避光染色半小时,每10分钟轻弹一次。pbs清洗后加250ul的pbs重悬。放入流式细胞仪中检测th2细胞百分比。

结果如图1所示(图中:a为各组病人代表性的流式细胞图,阳性细胞的百分比在各组图中均有显示;b为三组病人的th2细胞表达的比较结果,其中,***p<0.0001,*p<0.01),由第一组到第三组,总体观察发现th2细胞百分比逐渐减少。

1.5.2梗死面积的检测

所有观察对象均在入院后24h至48h内接受ct或者mri影像学检查,为了确保准确性,选取核磁共振弥散加权成像来测量梗死面积。当无法获得磁共振弥散加权成像时,采用增强ct来替代。人为地在每张ct或mri上画出梗死水肿区域,并且这些区域都用cm2表示。如果梗死区域出现出血改变,那么出血区域就包含到梗死带中。

1.5.3th2细胞百分比与nihss评分、barthel指数及梗死面积的相关性分析

对各个患者进行nihss评分,评估患者的神经功能损伤(评分分值越高说明神经功能损伤越严重),并分析th2细胞百分比与其的相关性,结果如图2所示(图中:a为th2百分比与nihss评分的相关性;b为th2百分比与barthel指数的相关性,c为th2细胞百分比与梗死面积的相关性分析)。

图2的结果显示:nihss评分随着th2百分比的增加而减小,说明th2细胞百分比与nihss评分呈负相关(图2-a,r=-0.599,p<0.0001);

barthel指数(分值越高生活自理能力越高)随着th2百分比的增加而增加,说明th2细胞百分比与barthel指数呈正相关(图2-b,r=0.646,p<0.0001);

缺血性脑卒中病人大脑梗死面积在一定程度上反映着病情的严重程度以及预后,使用ct或mri对脑卒中病人大脑梗死面积进行了测量,图2显示,梗死面积随着th2细胞百分比的增加而缩小,说明th2细胞百分比与梗死面积呈负相关性(图2-c,r=-0.593,p<0.0001),即th2细胞百分比越高,患者梗死面积越低。

实施例2

il-4水平与nihss评分、barthel指数及梗死面积的相关性

2.1elisa法检测th2细胞因子

酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)被用来检测血清中th2细胞因子il-4的水平。采用il-4elisa试剂盒,依照说明书稀释一支标准品,在标准孔中加入50ul标准品,待测孔中加40ul样品稀释液及10ul待测血清。封板膜封板后37℃温育,30min后弃液体,甩干,每孔加满洗涤液,30s后弃去,重复5次,拍干。除空白孔外,每孔加酶标试剂50ul,再如上温育、洗涤。每孔先加显色剂a50ul,再加显色剂b50ul,轻轻震荡混匀,37℃避光显色。15min后每孔加终止液。空白调零后,在450nm波长下依次测量各孔吸光度,并计算细胞因子il-4浓度。

2.2nihss评分、barthel指数及梗死面积的计算同实施例1

2.3il-4水平与nihss评分、barthel指数及梗死面积的相关性分析,结果见图3(图中:a为il-4水平与nihss评分的相关性;b为il-4水平与barthel指数的相关性,c为il-4水平与梗死面积的相关性分析)。

图3的结果显示:nihss评分随着il-4水平的增加而减小,说明il-4水平与nihss评分呈负相关(图3-a,r=-0.622,p<0.0001);

barthel指数随着il-4水平的增加而增加,说明il-4水平与barthel指数呈正相关(图3-b,r=0.611,p<0.0001);

梗死面积随着il-4水平的增加而缩小,说明il-4水平与梗死面积呈负相关性(图3-c,r=-0.599,p<0.0001)。

综上,本发明系统检测了各研究对象外周血单核细胞中th2细胞百分比,由于nihss评分是反映病人入院后24小时内的神经功能损伤程度的常用指标,而barthel指数是反映患者日常生活自理能力的常用指标,本发明又评估了各研究对象nihss评分及barthel指数,并且分析了th2细胞与二者的相关性。il-4是th2细胞主要的细胞因子,因此检测了各研究对象外周血血清中il-4的水平,并且分析了il-4水平与nihss评分及barthel指数的相关性,从细胞因子水平进一步验证th2细胞对脑卒中的保护作用。脑卒中病人大脑梗死面积能直接反应病情严重程度,故本研究利用mri或ct计算了各研究对象大脑梗死面积,分别分析了th2细胞、il-4水平与其相关性。结果显示,th2细胞百分比及其细胞因子il-4均与nihss评分(评分分值越高,说明神经功能损伤越严重)呈反比,与barthel指数(分值越高,生活自理能力越高)呈正相关,与脑卒中病人大脑梗死面积(梗死面积越大,病情越严重,预后越差)呈反比。

这就表明,th2细胞百分比及其细胞因子il-4与脑卒中尤其是缺血性脑卒中具有明显的相关性,th2细胞百分比及其细胞因子il-4可以作为脑卒中诊断和预后指示的生物标志物,是一种全新的脑卒中标志物;基于此,可将th2细胞或细胞因子il-4作为标志物应用于制备脑卒中诊断试剂盒或者在制备预测脑卒中患者预后的试剂盒中等领域,以及细胞因子il-4抗体和cd4+抗体也可用于脑卒中诊断试剂盒或预测脑卒中患者预后的试剂盒等领域,这为脑卒中诊断和预后提供了一种新的思路和手段,有利于加快脑卒中的发病机制研究进程,也为快速筛选出治疗脑卒中的药物提供帮助。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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