一种荧光RT‑PCR技术检测意大利蜜蜂免疫基因defensin‑1表达的方法与流程

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测意大利蜜蜂免疫基因defensin-1表达的特异性引物，一种荧光rt-pcr技术检测意大利蜜蜂免疫基因defensin-1表达的方法。

背景技术：
：

防御素(defensin)是抗菌肽家族中最大的亚家族，从哺乳动物、昆虫、植物中分离出来并且充当天然免疫的效应分子，具有广谱抗菌作用，对g⁺的杀伤作用大于对g^-的杀伤作用，它也作用于真菌和部分真核细胞。它是机体有效抵抗病原感染的第一步，起到调节机体免疫系统的作用。

蜜蜂防御素1(beedefensin-1)是蜜蜂产生的一种对病原菌具有较强抵抗力的蛋白质，这种蛋白质是蜜蜂先天免疫系统的组成部分，能增强蜜蜂对病害的抵抗能力。张爱静等研究发现蜜蜂防御素具有51个氨基酸残基，6个半胱氨酸，在结构和功能上与其他物种的防御素具有一定的相似性，蜜蜂防御素1具有灭杀某些真菌、病毒及原虫的作用。美国科学家zaatj.研究表明：beedefensin-1蛋白对伤口的愈合、幽门螺旋杆菌的抑制以及对由耐抗生素细菌导致的感染治疗和预防都有很好的功效。majtan等研究发现，蜜蜂会将产生的defensin-1分泌到蜂蜜中，成为蜂蜜的主要抗菌因子，造就了蜂蜜的抗菌特性。研究蜜蜂防御素基因表达为进一步探索蜜蜂防御素的生物功能提供良好的理论基础。

近年来，由于由于农林生产中滥施农药、蜂病防治过程中抗生素的广泛使用、环境污染、人类活动的干扰、植被的破坏等原因造成生态环境的破坏，蜜蜂的免疫系统得到了破坏，使得蜜蜂养殖过程中频繁遭受到疾病和寄生虫的侵害，甚至在欧美等国家蜜蜂出现了蜂群崩溃综合症，给蜂农造成了巨大的经济损失。因此运用现代生物技术作为蜜蜂健康养殖的技术支撑，研究蜜蜂防御素基因表达，掌握蜜蜂对病虫害的免疫防御技术是蜂业生产中急需解决的问题。

本发明对健康蜜蜂添食抗菌剂苯菌灵，通过荧光rt-pcr检测方法对添食苯菌灵前后蜜蜂体内免疫基因defensin-1的表达水平进行快速准确的检测判断，蜜蜂体内免疫基因defensin-1的表达水平进行动态监测，研究抗生素对于昆虫免疫系统调控的影响作用，加强蜜蜂的饲养管理，重视抗病蜜蜂品种和品系的培育工作，正确指导抗生素药物的使用，为科学利用抗生素对意大利蜜蜂天然免疫的提高及蜂病的药物防治提供理论依据。

实时荧光rt-pcr技术是在常规pcr技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光rt-pcr不仅实现了常规pcr从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，实时荧光rt-pcr技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光rt-pcr技术全封闭反应，无须pcr后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学、医学等研究领域。

技术实现要素：
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本发明所要解决的技术问题在于意大利蜜蜂免疫基因defensin-1实时荧光rt-pcr检测方法的建立，为快速检测免疫基因defensin-1的表达建立了一个技术平台。主要用于意大利蜜蜂免疫基因defensin-1在苯菌灵胁迫下的表达调控及其对蜜蜂天然免疫和疾病防控的研究，研究结果可为科学利用抗生素对意大利蜜蜂天然免疫的提高及蜂病的药物防治提供理论基础。

一种荧光rt-pcr技术检测意大利蜜蜂免疫基因defensin-1表达的方法采用以下的技术方案来实现：

设计一种荧光rt-pcr技术检测意大利蜜蜂defensin-1基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光rt-pcr反应特点的特异上下游引物：

defensin-1-f：5'-gagaatgaagaacgtgccga-3'

defensin-1-r：5'-atgacctccagctttacccaa-3'

本发明所述特异性引物快速检测意大利蜜蜂defensin-1基因表达的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)使用下述引物进行该基因的检测和获得：

符合荧光rt-pcr反应特点的该序列特异上下游引物：

defensin-1-f：5'-gagaatgaagaacgtgccga-3'

defensin-1-r：5'-atgacctccagctttacccaa-3'

(2)总rna的提取：采用各种通用的rna提取方法，从意大利蜜蜂成体中提取总rna；

(3)cdna合成：以意大利蜜蜂总rna为模板合成cdna，反应体系为20μl；

(4)实时荧光pcr：以上述合成的cdna为模板，上述(1)中defensin-1-f和defensin-1-r、β-actin-f和β-actin-r为特异性引物，进行实时荧光pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的ct值取平均数。

(5)苯菌灵处理前后意大利蜜蜂defensin-1的相对表达量计算：

实时荧光rt-pcr后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2－δδct法计算defensin-1基因的相对表达量。

本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为

100μm的贮存液，工作液浓度为2μm。

本发明进一步公开了采用荧光rt-pcr技术检测抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂defensin-1基因的相对表达量，旨在制备检测抗菌肽defensin-1在意大利蜜蜂免疫系统调控中的作用。实验结果表明：图1为抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂defensin-1基因的相对表达量。从图中看出，在苯菌灵胁迫的情况下，意大利蜜蜂体内的defensin-1的相对表达量呈下降的趋势，这说明免疫基因defensin-1参与了意大利蜜蜂的机体免疫，并且在抗生素的胁迫下机体免疫功能减弱，对于解析昆虫体天然免疫有一定的参考价值。

本发明提供的特异性引物快速检测意大利蜜蜂defensin-1基因表达的方法，与现有技术相比的有益效果是：

(1)本发明采用的实时荧光rt-pcr技术与常规pcr相比，实时荧光rt-pcr技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光rt-pcr技术全封闭反应，无须pcr后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光rt-pcr技术也免除了常规pcr中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。

(2)在通过荧光rt-pcr的方法研究抗生素苯菌灵处理前后蜜蜂免疫基因defensin-1表达的变化，结果显示苯菌灵胁迫下意大利蜜蜂体内的defensin-1基因的表达水平下调，说明抗生素苯菌灵确实对蜜蜂体内defensin-1基因表达产生了影响，一定程度上破坏了蜜蜂机体的天然免疫。

(3)因此本发明研究结果可为探究意大利蜜蜂天然免疫及蜂病防治提供了理论基础，这对于意大利蜜蜂的疾病防治具有重要意义。

说明书附图：

图1为内参基因β-actin扩增曲线；

图2为内参基因β-actin溶解曲线；

图3为defensin-1的扩增曲线；

图4为defensin-1的溶解曲线；

图5为抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂defensin-1基因的相对表达量。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员参照本发明的精神，可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本发明中所述的意大利蜜蜂总rna的提取、cdna的合成、实时荧光rt-pcr等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒等实验药品和试剂都可以从生产商家购买。

实施例1：

获得意大利蜜蜂defensin-1基因序列

打开beebase(http://hymenopteragenome.org/beebase/)数据库，在搜索栏输入关键词defensin-1，搜索到defensin-1-1和defensin-1-2两个结果。点击defensin-1-1得到其beebase数据库基因号为gb41428。点击进入基因描述页面，选中ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库的链接，进入ncbi，得到其基因编号为loc406143，ref-seq的mrna编号为nm-001011616.2,protein编号为np_001011616.2，即得到defensin-1的cds以及氨基酸序列。

实施例2：

意大利蜜蜂总rna的提取

选取2组(每组3个平行样)健康的意大利蜜蜂进行抗生素对defensin-1表达量影响的实验。实验组三个蜂群依照苯菌灵药物使用说明，饲喂一周。实验组三个蜂群饲喂同量的糖水，饲喂一周。处理后选取适量的意蜂工蜂，并保存于-80℃冷冻。

(1)取10头意蜂工蜂置于无菌研钵内，倒入液氮并迅速用研磨棒充分研磨，研磨后将粉末转入1.5ml中，再加1000μlrnaisoplus溶液入离心管，静置5min。

(2)将200μl氯仿加入离心管，剧烈振荡5-10min，静置5min。

(3)4℃下12000rpm离心10min，将上层无色水相转入新的无菌离心管中，加入500μl异丙醇，轻柔颠倒混匀，放置10min，12000rpm离心10min。

(4)小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1000μl75％乙醇洗涤沉淀。4℃下7500rpm离心5min，再重复一次乙醇洗涤沉淀操作。

(5)小心弃去上清液，室温干燥2min。将rna沉淀溶于50μldepc水中。

(6)所得沉淀即为意蜂总rna，产物立即使用或冷冻保存于-80℃。

实施例3：

cdna的合成

以实施例2所述意大利蜜蜂总rna作为模板。取一消毒的0.2ml离心管，加入以下反应体系(20μl体系)：

(1)在冰浴的nuclease-freepcr管中加入以下试剂：

(2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。

(3)将试管冰浴，再加入下列试剂：

5×rtbuffer4.0μl

thermoscientificribolockrnaseinhibitor(20u)0.5μl

revertaidpremiumreversetranscriptase(200u)1.0μl

(4)轻轻混匀后离心3～5s

(5)在pcr仪上按照下列条件进行反转录反应

①25℃孵育10min

②cdna合成50℃30min

③终止反应85℃5min，处理后，置于冰上放置。

(6)将上述溶液-20℃保存。

实施例4：

荧光定量pcr反应体系和条件

(1)引物设计：

根据所述意大利蜜蜂defensin-1-1基因的全长序列，使用primer5软件设计适用于实时荧光rt-pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

defensin-1-f：5'-gagaatgaagaacgtgccga-3'；

defensin-1-r：5'-atgacctccagctttacccaa-3'

pcr产物预计长度为123bp

同时，根据转录组数据库里提供的意大利蜜蜂β-actin基因的cds序列设计用于实时荧光pcr内对照的引物，引物序列如下：

β-actin-f：5'-atgccaacactgtcctttctgg-3'

β-actin-r：5'-gacccaccaatccatacgga-3'

pcr产物预计长度为135bp。

(2)实时荧光rt-pcr：运用sybrgreen嵌合荧光法进行rt-pcr分析。使用cf96xpcr仪(bio-rad)进行pcr反应。以上述实施例3中合成的cdna为模板，使用defensin-1-f和defensin-1-r、β-actin-f和β-actin-r为特异性引物，进行实时荧光rt-pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数)取平均数。

实时荧光pcr扩增体系设置如下：

实验样本：将cdna样品稀释8倍作为模板上机检测。

实时荧光pcr扩增参数设置如下：

仪器的操作

完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在abisteponeplus型荧光定量pcr仪中进行反应。

试验中进行抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂defensin-1基因的相对表达量比较，在计算时：当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2^－δδct法计算苯菌灵处理前后defensin-1基因的相对表达差异。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>安徽省农业科学院蚕桑研究所

<120>一种荧光rt-pcr技术检测意大利蜜蜂免疫基因defensin-1表达的方法

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<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>意大利蜜蜂

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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