一株赖氨酸芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用的制作方法

本发明涉及微生物和饲料添加剂领域，具体涉及一株赖氨酸芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，zea)是一种非类固醇类的、具有类雌激素作用的霉菌毒素，主要由禾谷镰刀菌、粉红镰刀菌、串珠镰刀菌、三线镰刀菌等合成分泌。每年zea的污染给全世界各地的种植业与畜牧业带来了重大的经济损失。由于小麦、玉米等粮食作物在田间容易被霉菌感染，如果湿度和温度等环境条件适宜，在运输、加工和存储的过程中霉菌将会大量生长繁殖并产生各种霉菌毒素。在中国，由于收获、储存及加工工艺的影响，这一污染现象显得更加严重。饲料霉变给农业和畜牧业造成的损失巨大，据联合国粮农组织(fao)估计，全世界每年25％的谷物受到霉菌毒素的污染，平均有2％不能食用造成浪费，同时由于采食污染的饲料引起的家畜中毒和死亡，造成的损失难以统计。zea对动物和人类都会产生毒害，人类食用被其污染的食物会导致肝癌、睾丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病，主要影响动物的繁殖机能，导致动物繁殖机能紊乱。zea还具有免疫毒性、肝毒性、遗传毒性，对肿瘤发生也有一定的影响。解决zea污染对农业可持续发展和人类及畜禽健康都具有重要意义。

鉴于zea所带来的严重危害，控制zea的污染极为重要。一方面，必须从源头上控制zea的产生，另一方面必须积极研究对已产生的zea毒素进行降解与脱毒的技术。目前，国内外学者已经研究了多种脱毒方法与技术，根据其技术原理可以分为三类，即物理、化学和生物脱毒法，其中辐照技术、吸附技术和臭氧去毒都具有一定的效果，是降低谷物中zea污染的重要技术，但传统去毒方法对zea的去除效果不稳定，营养成分损失较大，难以规模化生产。生物降解zea因具有特异性强、脱毒效率高、降解产物无毒害等优势，因而受到广泛关注。因此，目前仍有必要寻找可用于饲料产品添加的降解zea的新的微生物，并将其应用于受zea污染的动物饲料产品中。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，从鸡肠道内分离培养出一株能够降解玉米赤霉烯酮的赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusmacroides)zj-2016-1，该菌株能够高效降解样品和/或产品中的玉米赤霉烯酮，作为降解玉米赤霉烯酮的生物材料，在开发新的生物降解菌剂和生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。

为此，本发明一方面提供了一株能够降解玉米赤霉烯酮的赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusmacroides)zj-2016-1，该菌株的保藏号为cgmccno.14013，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年4月11日。

在本发明优选的实施方案中，该菌株的生物学特性为在lb培养基平板上，37℃，培养24h，菌落形态为小于0.8mm的圆形棕黄色小菌落，细胞呈杆状，芽孢呈梭状，能够利用葡萄糖、纤维二糖等，革兰氏染色为阳性。

本发明另一方面提供了根据本发明的赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1制备的用于降解玉米赤霉烯酮的菌剂，其由赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1的培养液、发酵产物、代谢产物或菌悬液制备而来。

本发明再一方面提供了制备上述菌剂的方法，包括如下步骤：

1、将赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1于种子培养基中培养，获得菌种；

2、将上述种子液接种入含有种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；

3、将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产发酵罐发酵培养，出罐形成能分解玉米赤霉烯酮的菌剂；

其中，种子培养基和发酵培养基均为液体lb培养基。

本发明再一方面提供了本发明的赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1在制备用于降解玉米赤霉烯酮的菌剂中的应用，其中菌剂由赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1的培养液、发酵产物、代谢产物或菌悬液制备而来。

本发明再一方面提供了本发明的赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1或本发明的菌剂在降解样品和/或产品中玉米赤霉烯酮的应用，其中样品和/或产品优选为农产品加工原料、饲料、食品或环境样品和/或产品。

本发明再一方面提供了一种降解样品和/或产品中玉米赤霉烯酮的方法，包括如下步骤：

1、获得本发明的赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1的培养液、发酵产物、代谢产物或菌悬液；

2、将步骤1中获得的培养液、发酵产物、代谢产物或菌悬液与含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品混合。

在本发明优选的实施方案中，所述赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1的培养液、发酵产物、代谢产物或菌悬液为将赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1接种于液体lb培养基中，在温度37℃和转速200r/min(旋转半径20mm)条件下振荡培养24h，收集培养产物即为赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1的培养液、发酵产物、代谢产物或菌悬液。

本发明再一方面提供了一种降解样品和/或产品中玉米赤霉烯酮的方法，包括将本发明的菌剂与含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品进行混合处理的步骤，其中样品和/或产品优选为农产品加工原料、饲料、食品或环境样品和/或产品。

在本发明优选的实施方案中，农产品加工原料优选为玉米、大豆、大麦、小麦、燕麦、花生、高粱、大米、小米等，饲料优选为玉米粉、豆粕、麸皮、dggs、配合饲料、全价饲料、蛋白饲料等，食品或环境样品和/或产品优选为鸡蛋、牛奶、肉制品等。

附图说明

图1：玉米赤霉烯酮标准品的高效液相色谱图。

图2：不接种zj-2016-1培养液的对照组降解玉米赤霉烯酮的高效液相色谱图。

图3：接种zj-2016-1培养液的实验组降解玉米赤霉烯酮的高效液相色谱图。

图4：添加玉米赤霉烯酮标准品的玉米饲料空白组的高效液相色谱图。

图5：添加玉米赤霉烯酮标准品的玉米饲料对照组的高效液相色谱图。

图6：添加玉米赤霉烯酮标准品的玉米饲料实验组的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

lb液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为胰蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeastextract)和氯化钠(nacl)，溶剂为水；胰蛋白胨在lb液体培养基中的浓度为1％，酵母提取物在lb液体培养基中的浓度为0.5％，nacl在lb液体培养基中的浓度为1％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。

lb固体培养基：在lb液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g:100ml)，得到lb固体培养基。

实施例1：菌株的分离与鉴定

1、菌株的分离

(1)在无菌工作台中，将鸡肠道内容物取出混匀，称取0.25～0.5g加入到10ml含终浓度为20ppmzea的lb液体培养基中摇床驯化培养，摇床转速为200r/min，摇床温度为37℃，驯化时间为96h。

(2)在无菌操作台中取上述驯化的菌液按1％体积比接种到10ml含终浓度为20ppmzea的lb液体培养基中摇床驯化培养，摇床转速为200r/min，摇床温度为37℃，驯化时间为96h。如此循环重复2-3次。

(3)将最后一次驯化培养后的菌液用无菌生理盐水进行浓度梯度稀释后涂布在lb培养基平板上，37℃条件下培养24h，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于玉米赤霉烯酮降解实验。得到的降解玉米赤霉烯酮能力最强的菌株命名为zj-2016-1。

2、菌株的鉴定

(1)16srdna试验鉴定

提取zj-2016-1总dna，以其为模板，利用细菌16srdna通用引物(27f:agagtttgatcctggctcag；1492r:ggttaccttgttacgactt)进行pcr扩增，得到长度约为1149bp的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序。

根据genbank序列同源性比较，菌株zj-2016-1与lysinibacillusmacroidesdsm54(genbank登录号lgci01000008)同源性为99.86％，初步判定该菌为赖氨酸芽孢杆菌属细菌(lysinibacillussp.)。

(2)生物学特性鉴定

本发明分离、筛选得到的菌种为赖氨酸芽孢杆菌属lysinibacillussp.，经鉴定，该菌的生物学特性如下：菌落形态为小于0.8mm的圆形棕黄色小菌落，细胞呈杆状，芽孢呈梭状，能够利用葡萄糖、纤维二糖等，革兰氏染色为阳性。

基于以上特征，将菌株zj-2016-1鉴定为赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusmacroides)。

实施例2：赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1培养液在降解玉米赤霉烯酮中的应用

1、赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1培养活化

将赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusmacroides)zj-2016-1接种于液体lb培养基中，在温度为37℃和转速为200r/min(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h后，收集培养产物为zj-2016-1培养液，用于后续的玉米赤霉烯酮降解实验。

2、赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1培养液对玉米赤霉烯酮的降解作用

(1)玉米赤霉烯酮溶液的配制

将10mg玉米赤霉烯酮标准品(sigma-aldrich，货号z2125)溶解于50ml色谱纯甲醇中获得浓度为200ppm的玉米赤霉烯酮溶液。

(2)降解玉米赤霉烯酮

实验组：取1ml浓度为200ppm的玉米赤霉烯酮溶液置于100ml锥形瓶中，80℃-100℃水浴加热使甲醇挥发完全，加入10ml新鲜lb培养基，使其终浓度为20ppm。接种100μl上述得到的zj-2016-1培养液，充分混匀在37℃，转速为200r/min(旋转半径20mm)的条件下振荡培养48h。

对照组：取1ml浓度为200ppm的玉米赤霉烯酮溶液置于100ml锥形瓶中，80℃-100℃水浴加热使甲醇挥发完全，加入10ml新鲜lb培养基，使其终浓度为20ppm。以不接种zj-2016-1培养液的含玉米赤霉烯酮的lb培养基作为对照组。

(3)玉米赤霉烯酮的检测

将实验组和对照组的反应液与甲醇以(1:3)的比例涡旋1min进行提取，12000r/min离心10min，取上清液过0.22μm的尼龙滤膜，最后使用hplc-fld对样品滤液进行检测。

hplc检测条件为流动相乙腈:水:甲醇＝46:46:8(v:v:v)；流速1.0ml/min；色谱柱为c18150mm×4.6mm×5μm；激发波长为274nm，检测波长为460nm；柱温30℃；进样量10μl。

玉米赤霉烯酮降解率(％)＝(对照组残留玉米赤霉烯酮含量-实验组残留玉米赤霉烯酮含量)/对照组玉米赤霉烯酮含量×100。

结果如附图1-3所示，其中对照组残留玉米赤霉烯酮含量为19.28±0.08ppm；实验组残留玉米赤霉烯酮含量0±0ppm。

结果表明，zj-2016-1培养液对玉米赤霉烯酮具有较好的降解效果，降解率达到100％。

实施例3：赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1培养液对玉米饲料中玉米赤霉烯酮的降解作用

1、赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1培养液对玉米饲料中玉米赤霉烯酮的降解

称取玉米饲料450g，添加玉米赤霉烯酮标准品(sigma-aldrich，货号z2125)，使其终浓度为10ppm，拌匀后，平均分成9份，做三种不同的处理，每个处理设置3个重复，第一种加入50ml无菌水(空白组)，第二种加入50ml灭过菌的lb培养液(对照组)，第三种加入含有细胞浓度为10⁷cell/ml的zj-2016-1培养液(实验组)，然后置于37℃恒温培养箱中处理48h。

2、玉米赤霉烯酮的检测

pbs缓冲溶液(0.01mol/l)的配制：将8gnacl、1.44gna2hpo4、0.24gkh2po4、0.2gkcl溶于800ml去离子水中，调节ph＝7.4，定容至1l。

向步骤1中所述的3个处理组共9份样品中分别加入150ml甲醇溶液，然后高速搅拌提取3min，静置，过滤。取10ml滤液用40mlpbs缓冲液进行稀释，过滤。将滤液全部通过免疫亲和柱，然后用10％甲醇水溶液冲洗免疫亲和柱2次，弃去冲洗液，最后加入0.5ml甲醇，分别孵育2min，收集洗脱液，洗脱液用于hplc分析。

hplc检测条件为流动相乙腈:水:甲醇＝46:46:8(v:v:v)；流速1.0ml/min；色谱柱为c18150mm×4.6mm×5μm；激发波长为274nm，检测波长为460nm；柱温30℃；进样量10μl。

玉米赤霉烯酮降解率(％)＝(对照组残留玉米赤霉烯酮含量-实验组残留玉米赤霉烯酮含量)/对照组玉米赤霉烯酮含量×100。

结果如附图4-6所示，其中空白组残留玉米赤霉烯酮含量为9.35±0.42ppm；对照组残留玉米赤霉烯含量为8.94±0.55ppm；实验组残留玉米赤霉烯含量为2.04±0.31ppm。

结果表明，赖氨酸芽孢杆菌zj-2016-1培养液对玉米饲料中的玉米赤霉烯酮仍然具有较好的降解效果，降解率达到77.2％。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一株赖氨酸芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用

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<213>人工序列

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