一种酶解发酵法制备的牛蒡多糖及其生产工艺和应用的制作方法

本发明属于食品生物技术领域，涉及一种多糖的生产工艺，具体涉及一种酶解发酵法制备的牛蒡多糖及其生产工艺和应用。

背景技术：

牛蒡又名大力子、牛菜等，属桔梗目菊科二年生草本植物。牛蒡是我国传统的药食同源性蔬菜，富含多糖、蛋白质、钙、磷、铁等人体所需的多种维生素、矿物质，以及绿原酸、牛蒡苷、膳食纤维、多酚、黄酮等多种生物活性成分，具有抗菌消炎、抗癌、抗衰老、清除氧自由基、降血压、降血脂，治疗糖尿病、失眠，提高人体免疫力等多种功效，被联合国粮农组织(fao)誉为“21世纪人类最佳保健食品之一”，具有极高的营养价值、经济价值和开发应用前景。

牛蒡多糖为多聚果糖，有低热量、预防臼齿、防治糖尿病，调节血压、减肥、预防心血管疾病、提高免疫力、预防结肠癌、防止便秘、腹泻等保健功能，被广泛应用于食品、医药等领域，在国内外市场需求巨大。目前多糖制备方法有热水浸提法、微波辅助法、超声辅助法、酶法等。但普遍存在提取率低、纯度不高、生产成本高、生物活性不理想等问题。因此，有必要对牛蒡多糖的提取方法进行改进。

技术实现要素：

发明目的：本发明旨在提供一种酶解发酵法制备牛蒡多糖的生产工艺，该工艺操作简单、生产成本低，脱色率和蛋白率脱除率高、多糖提取率95％以上，纯度达90％以上。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明所述的酶解发酵法制备牛蒡多糖的生产工艺，包括：

(1)打浆：将牛蒡根与水按一定料液比混合后打浆，得牛蒡浆；

(2)酶解：调节牛蒡浆的ph值，然后加入淀粉酶酶解，酶解结束后灭酶，得牛蒡酶解液；

(3)超声提取：对牛蒡酶解液进行超声处理，结束后过滤，去掉滤渣，得多糖提取液；

(4)发酵：向所述的多糖提取液中接入酵母菌进行发酵，得牛蒡发酵液；

(5)纯化精制：对牛蒡发酵液进行分离纯化，得所述的牛蒡多糖。

本发明联合应用酶法、超声辅助、以及微生物发酵法制备高活性的牛蒡多糖，结合了酶法和超声两种提取技术的优点，显著提高了多糖的提取效率，有效避免了高温浸提法对牛蒡多糖生物活性造成的不利影响，同时还通过发酵法过程中酵母菌的生长初步去除了牛蒡中的蛋白质、单糖、双糖、维生素、矿物质、色素等营养元素而达到纯度多糖的目的，其生产工艺简单易行、生产成本低，且产品的纯度高、抗氧化活性高、抗结肠癌活性高。

步骤(1)中，所述打浆包括：将牛蒡根与水混合后打浆，得牛蒡浆。

打浆原料选择新鲜、无病变、无霉变的鲜牛蒡根，打浆前，将牛蒡根洗净，切片，片厚1～2cm，95～100℃下漂烫护色1～2min。

所述打浆的料液比(质量体积比，g/ml)为1:3～5。

步骤(2)中，可用酸如柠檬酸调节牛蒡浆的ph值。

所述淀粉酶为中温α-淀粉酶。

所述酶解的条件为：ph值为4.5～6.5，加酶量为15～25u/g，酶解温度为60～70℃，酶解时间为50～90min；优选的，加酶量为15～16u/g，ph值为5.2～5.7，酶解温度为69～70℃，酶解时间为85～90min；更优选的，加酶量为15u/g，ph值为5.5，酶解温度为70℃，酶解时间为85min。

在确定上述淀粉酶酶解条件时，首先设置单因素试验，确定了加酶量、ph、酶解温度、酶解时间的适宜范围分别为：ph值4.5～6.5，淀粉酶加入量为15～25u/g，酶解温度为60～70℃，酶解时间为50～90min，在此基础上，采用box-benhnken中心组合试验法，以淀粉水解度为指标，通过响应面分析优化了最佳的淀粉酶酶解工艺。得到的以y(淀粉水解度)为响应值的回归方程为：

y＝114.02+1.61a+0.26b+0.47c+0.13d-0.45ab-0.73ac-0.050ad+0.75bc-0.13bd+0.075cd-1.94a²-1.64b2-1.81c²-0.81d²

通过方差分析发现，该模型高度显著，最佳的酶解工艺条件是液化酶添加量为15u/g，酶解温度为70℃，ph为5.5，酶解时间为85min。响应面设计与结果见表1，实验结果方差分析结表见表2。

表1响应面设计与试验结果

表2实验结果方差分析结果

注：*表示0.05水平显著，**表示0.01水平显著。

所述酶解结束后，90～95℃灭酶5min，即得牛蒡酶解液。

步骤(3)中，所述超声处理的条件为：超声功率为500～700w，超声时间为30～90min，温度为50～60℃。

步骤(4)中，所述的酵母菌为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，一般按0.02％～0.05％的质量百分比接种酵母菌发酵剂。

所述发酵的温度为25～28℃，时间为2～3天。

步骤(5)中，所述的纯化精制包括：将所述的牛蒡发酵液过滤，滤液浓缩至1/4～1/5倍体积后用水调整其浓度至0.01-0.02g/ml，然后用大孔树脂进行吸附，洗脱后得多糖液，多糖液浓缩干燥，得所述的牛蒡多糖。

洗脱时用纯净水进行，待洗脱液中蛋白质脱除率和脱色率均达到90％以上时停止洗脱，干燥的温度为40～55℃。

所述的大孔树脂优选为s-8大孔树脂或d301-g大孔树脂。

在树脂选择时，精选了d3520、x-5、s-8、ab-8、d201、d301-g等多种树脂，采用静态吸附和动态解析试验，通过比较其对牛蒡多糖的保留和脱色的效果，优选出s-8大孔树脂和d301-g作为精制适宜树脂，实验结果见表3。

表3四种树脂对菊芋菊糖溶液的脱色效果比较

本发明还提供了所述生产工艺制备得到的牛蒡多糖。本发明全程中温提取，避免了高温提取技术对多糖空间结构的破坏，从而有效提高了多糖的生物活性。按上述生产工艺制备的牛蒡多糖的纯度达90％以上。

本发明还提供所述牛蒡多糖在制备抗氧化、抑制人结肠癌保健食品或药物中的应用。实验表明，本发明制备的牛蒡多糖具有优异的抗氧化特性，同时能够有效抑制人结肠癌细胞的生长，因此可将其应用于制备抗氧化、抑制人结肠癌保健食品或药物中。

相对于现有技术，本发明的优点如下：

1)本技术方案首先采用了酶法超声辅助法，利用中温α-淀粉酶对牛蒡浆中的少量淀粉进行酶解，有效降低了牛蒡浆的粘度，提高了牛蒡多糖的溶出效率，也有利于酵母菌的发酵，同时还利用超声波产生的空化效应加速了细胞壁的破碎和多糖的快速溶出，属于中温提取技术，既克服了传统高温提取存在的多糖活性低的缺陷，还极大地提高了多糖的提取效率。

2)本技术方案在酶法超声辅助提取基础上，利用酵母菌发酵时消耗还原糖、蛋白质、矿质元素等成分的特性，达到初步纯化多糖的目的，免去了传统工艺采用的脱蛋白、脱色等加工过程，极大的简化了生产工艺、降低了生产成本、避免了繁琐的工艺步骤造成的多糖生物活性降低，保证了多糖产品的营养保健功能。

3)只采用1种大孔树脂进行精制，克服了多糖纯化需依次通过强酸性阳离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂等步骤引起的操作复杂、不利于工业化生产等缺点，具有多糖提取效率高、产品纯度高、操作简单、成本低廉等优点，具有极大的商业开发价值。

4)本发明制备的牛蒡多糖具有较高的抗氧化活性和抑制人结肠癌细胞增殖活性，为牛蒡多糖抗氧化、抗结肠癌保健食品、药品的开发提供了依据，为牛蒡资源的开发提供了新的途径。

附图说明

图1为牛蒡多糖的高效凝胶渗透色谱分析结果图；

图2为牛蒡多糖对羟自由基的清除作用；

图3为牛蒡多糖对人结肠癌细胞ht-29细胞生长的影响。

具体实施方式

下面详细说明本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中：

牛蒡多糖纯度测定采用高效凝胶渗透色谱法分析，其分析条件为：ultrahydrogeltmlinear，300mm×7.8mmid色谱柱；流动相0.1mol/l硝酸钠溶液，流速0.9ml/min；柱温45℃，进样量2μl，示差折光检测器检测。色谱图见图1。

采用羟自由基测定试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)评价牛蒡多糖的抗氧化活性；采用mtt法评价牛蒡多糖的抗人结肠癌细胞ht-29活性。

实施例1

挑选新鲜、无病变、无霉变的鲜牛蒡根100kg，流水清洗干净、切成厚度为1～2cm的薄片，95～100℃漂烫1～2min，捞出、流水冷却、沥干水分，再加入500l的纯净水混合打浆，用柠檬酸调节浆液ph至6.5，再加热至65℃，按25u/g的比例加入中温α-淀粉酶恒温酶解70min，酶解结束后90℃灭酶5min，再将浆液置于超声设备中，在500w超声功率、温度60℃条件下超声处理70min，再用8层纱布过滤，所得多糖提取液放入1吨发酵罐，发酵罐中按0.05％的质量百分比接种活性酿酒酵母菌发酵剂，混合均匀后于25℃下恒温发酵3天，发酵结束后将牛蒡发酵液通过管式离心机，于离心力3500条件下离心15min，所得滤液经真空浓缩至1/4倍体积后，用蒸馏水将浓缩液浓度调整至0.01g/ml，以2ml/min的流速通过s-8大孔树脂柱，结束后再用纯净水进行洗脱，待洗脱液中蛋白质脱除率和脱色率均达到90％以上时，停止洗脱，洗脱液进行真空减压浓缩、再置于55℃真空干燥箱中进行干燥，即可得到牛蒡多糖。

上述生产工艺制备的牛蒡多糖提取率为95.67％，纯度为91.66％、48h时250mg/ml的多糖溶液对ht-29结肠癌细胞的抑制率达63.41％。

实施例2

挑选新鲜、无病变、无霉变的鲜牛蒡根100kg，流水清洗干净、切成厚度为1～2cm的薄片，95～100℃漂烫1～2min，捞出、流水冷却、沥干水分，再加入300l的纯净水混合打浆，用柠檬酸调节浆液ph至5.5，再加热至60℃，按20u/g的比例加入中温α-淀粉酶恒温酶解60min，酶解结束后92℃灭酶5min，将浆液通过超声设备，在700w超声功率、温度50℃条件下超声处理50min，再用8层纱布过滤，得到多糖提取液。所得多糖提取液放入1吨发酵罐，发酵罐中按0.03％的质量百分比接种活性酿酒酵母菌发酵剂，混合均匀后于28℃下恒温发酵2天，发酵结束后将牛蒡发酵液通过管式离心机，于离心力3500r/min条件下离心15min，所得滤液经真空浓缩至1/5倍体积后，用蒸馏水将浓缩液浓度调整至0.02g/ml，以2ml/min的流速通过s-8大孔树脂柱，结束后再用纯净水进行洗脱，待洗脱液中蛋白质脱除率和脱色率均达到90％以上时，停止洗脱，洗脱液进行真空减压浓缩、再置于50℃真空干燥箱中进行干燥，即可得到牛蒡多糖。

上述生产工艺制备的牛蒡多糖提取率为96.11％，纯度为90.12％、48h时250mg/ml的多糖溶液对ht-29结肠癌细胞的抑制率达58.32％。

实施例3

挑选新鲜、无病变、无霉变的鲜牛蒡根100kg，流水清洗干净、切成厚度为1～2cm的薄片，95～100℃漂烫1～2min，捞出、流水冷却、沥干水分，再加入400l的纯净水混合打浆，用柠檬酸调节浆液ph至5.5，再加热至70℃，按15u/g的比例加入中温α-淀粉酶恒温酶解85min，酶解结束后90℃灭酶5min，将浆液通过超声设备，在600w超声功率、温度50℃条件下超声处理60min，再用8层纱布过滤，得到多糖提取液。所得多糖提取液放入1吨发酵罐，发酵罐中按0.02％的质量百分比接种活性酿酒酵母菌发酵剂，混合均匀后于28℃下恒温发酵3天，发酵结束后将牛蒡发酵液通过管式离心机，于离心力3500r/min条件下离心20min，所得滤液经真空浓缩至1/4倍体积后，用蒸馏水将浓缩液浓度调整至0.015g/ml，以2ml/min的流速通过d301-g大孔树脂柱，结束后再用纯净水进行洗脱，待洗脱液中蛋白质脱除率和脱色率均达到90％以上时，停止洗脱，洗脱液进行真空减压浓缩、再置于55℃真空干燥箱中进行干燥，即可得到牛蒡多糖。

上述生产工艺制备的牛蒡多糖提取率为97.12％，纯度为93.11％，在评价牛蒡多糖的抗氧化活性和抑癌活性时，分析了不同浓度牛蒡多糖溶液的生物活性，结果见图2、图3。由此结果可知，当浓度达0.04mg/ml时，其对羟自由基清除能力即可达到90％以上；24h、48h、72h内，200～250μg/ml的牛蒡多糖对ht-29结肠癌细胞的抑制率达分别达55.84％～59.53％、56.08％～63.41％、57.46％～67.66％。