一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法与流程

本发明涉及作物抗病育种技术领域，尤其涉及一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法。

技术背景

黄瓜（cucumissativusl.,2n=14）是世界范围内种植的一种重要的蔬菜作物，在我国蔬菜供应和国民经济中占有极其重要的地位，但是近年来随着黄瓜保护地栽培面积的不断扩大，黄瓜病害越来越成为制约黄瓜生产的一个重要因素，严重影响黄瓜的产量和品质。据报道2014-2016年，中国河北、山东、河南和辽宁省等地黄瓜细菌角斑病（angularleafspot,als）危害十分严重，严重减产的达到30-50%（mengetal.,2017）。

黄瓜角斑病是由丁香假单胞杆菌黄瓜细菌角斑病致病变种(pseudomonassyringaepv.lachrymans，psl)引起的叶部病害，病菌在种子和病残体幸存，初侵染来源为带菌的种子、昆虫、雨水、劳动者、病残体及污染病残体的土壤等，带菌土壤通过大风或者灌溉迅速远距离传播。病菌通过种子萌发时定植到子叶上增殖发病，子叶侵染首先在子叶边缘开始黄化，叶片侵染发病时首先在叶背面出现水浸状的褪绿斑，病斑的外围扩大呈褪绿晕环，因受叶脉限制而呈多角形，逐渐成黄褐色、褐色、灰白色、白色，易破裂形成穿孔，有时可危害瓜条，腐烂有臭味（youngetal.1996）。

黄瓜角斑病菌psl与寄主植物互作的报道甚少，ps小种存在分化现象，renata等收集了侵染瓜类作物的22个psl小种，利用感病黄瓜lineb鉴定了不同小种的致病性和毒力，并通过分子进化方法对小种进行了划分。根据psl小种的致病性及其分子进化分析结果，将psl菌株划分为两种类型，强致病力类型和弱致病力类型(renataetal.,2015）。当病菌侵染寄主植物后，寄主植物一般产生两种反应，其一是过敏性坏死反应，当病菌侵染寄主细胞后，病菌在寄主植物中繁殖很少，一般在12-24h内达到高峰，然后迅速衰减；另一种反应为非过敏性坏死反应，细菌感染寄主后，在寄主的接种部位不断增殖，一般3至4d内达到高峰产生坏死斑。黄瓜对psl抗病反应为延迟了病菌在寄主细胞的增殖，表现为耐病，接种psl后侵染位点可检测到高浓度的游离氨基酸，psl的生理小种的致病性与其产生的蛋白裂解酶成正相关（keenetal.,1967aandb)。而寄主在psl侵染位点诱导产生病程相关蛋白（pathogenesis-relatedproteins,prps）来抑制psl分泌的蛋白酶功能，从而减缓病害的发展（kryczynskietal.,2002)。这种互作方式符合亲和互作的特征，这为我们指导开展黄瓜抗als抗病性鉴定奠定了理论基础。

利用化学农药防治als不仅污染环境，而且容易产生抗药性（lamichhaneetal.,2015）。利用黄瓜种质资源进行抗病品种的选育是一项最经济和有效的措施，而快速、可靠、准确的接种鉴定是实现这一目标的关键。目前黄瓜als抗病鉴定主要是通过喷雾接种病菌的方法，虽然操作简单，但是病害发病不稳定，受环境影响大，每次喷雾接种后的材料的发病率及病情指数不稳定，给抗病鉴定带来困难。目前缺乏一种快速准确评价不同黄瓜种质资源对als抗病鉴定表现型的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，该方法首先在黄瓜幼苗两片子叶完全展开时，以一定浓度的强致病力的黄瓜细菌角斑病psl病菌液轻轻注射黄瓜幼苗的子叶背面，然后保温保湿7天后根据子叶的表现的症状来判定黄瓜对细菌角斑病的抗病性。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种黄瓜子叶接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，该方法使用黄瓜细菌角斑病菌psl强致病力菌株进行子叶注射接种，从而根据接种子叶的症状快速鉴定黄瓜种质资源对细菌角斑病的抗病性，该方法包括以下步骤：

（1）鉴定黄瓜细菌角斑病病菌psl强致病力菌株用于黄瓜幼苗子叶接种，且接种浓度在1×10⁶cfu/ml至5×10⁶cfu/ml之间；

（2）黄瓜幼苗子叶为受体注射接种：将黄瓜种子消毒后播种到营养土中，在人工气候室内培养，培养条件为24℃光照培养16小时、20℃黑暗培养8小时、湿度100%，当子叶完全展开时，将psl菌液轻轻注射入黄瓜幼苗子叶背面的细胞间隙中。接种完后扣透明的塑料盖密封，在人工气候室内继续培养7天，然后统计接种后的子叶的发病症状，根据子叶的症状来判断黄瓜对细菌角斑病的抗病性。

（3）黄瓜对细菌角斑病病菌的抗病性鉴定：当psl菌液接种黄瓜幼苗子叶7天后，在抗病材料上症状表现为无明显褪绿晕环、子叶浓绿色，而感病材料表现为有明显的褪绿晕环、子叶黄化。通过上述方法，即可快速鉴定出黄瓜抗细菌角斑病的材料。

进一步地，步骤（1）中分离黄瓜细菌角斑病病菌强致病力菌株的方法为：①田间采集具有黄瓜细菌角斑病典型症状的病叶，放入离心管中，室内无菌条件下用10%次氯酸钠消毒3min，用无菌的蒸馏水冲洗三次。②在离心管里用无菌的玻璃棒将病叶捣碎，加无菌水0.5ml，取无菌的接种针沾取捣碎的病菌汁液，在kb培养基上划线，24℃暗培养2天直至菌落长出。③选取单菌落kb划板培养，然后培养的划线菌用无菌水在平板上冲洗，收集黄瓜细菌角斑病菌液后，用无菌水调节菌液浓度在1×10⁶cfu/ml。④用注射器轻轻在黄瓜子叶叶背面注射接种，直至菌液浸透整个子叶叶背面。⑤以24℃光照培养16小时、20℃黑暗培养8小时、湿度100%的条件培养3至7天。⑥根据接种后子叶褪绿黄化的程度来判断黄瓜细菌角斑病菌株的致病力水平，选取强致病力的黄瓜细菌角斑病菌株用于随后的抗病鉴定研究。

进一步地，分离的强致病力黄瓜细菌角斑病菌株用无菌的1%脱脂奶粉保存，并加甘油至终浓度为30%，分装在1.5ml离心管后于-80℃下长期保存。

进一步地，步骤（2）中黄瓜种子要用10%的次氯酸钠消毒后，用水冲洗3遍，催芽后定植于48孔育苗盘上，然后置于人工气候室中培养。

一种上述方法在黄瓜抗细菌角斑病育种中的应用，也是本发明的保护范围。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

（1）规范了黄瓜细菌角斑病的快速接种鉴定技术，以黄瓜幼苗子叶为接种对象，通过注射接种psl强致病力病菌，在接种过程中psl病菌接种浓度可控，保证黄瓜材料在不同批次的接种鉴定中结果的规范性、准确性、可比性、一致性和稳定性，与传统的黄瓜幼苗叶片喷雾接种方法相比，该方法更为简单、准确、稳定、可控，从而规范了黄瓜抗细菌角斑病菌的接种鉴定技术。

（2）采用注射快速接种子叶，接种后根据接种子叶的褪绿症状来直接判断黄瓜材料对黄瓜的抗性，这种判断方法简单、可靠，可以有效避免黄瓜喷雾接种后叶片调查时发病症状不明显、不稳定和鉴定结果差等问题。

（3）本发明创造性的选择在幼苗的子叶叶背面采用微注射接种，黄瓜的子叶叶片较厚，使用无注射器针头的注射器和子叶叶片紧密吻合，在一定的压力作用下，可以轻轻地将菌液注射进去子叶的细胞间隙中，而且在注射过程中注意避免注射的位置产生伤口，这样在叶片无创口情况下，接种后7天就可以根据子叶的症状来鉴定抗病性。

附图说明

图1表示强致病力psl菌株的浓度；分别以1×10⁸cfu/ml、1×10⁷cfu/ml、1×10⁶cfu/ml和1×10⁵cfu/ml为浓度梯度接种黄瓜幼苗子叶。

图2表示子叶注射法的流程；

子叶背面被去掉针头的注射器轻轻注射到子叶细胞间隙里，避免注射的部位产生伤口。

图3表示在不同浓度下材料的抗病表现，其中在psl病菌>=1×10^7：的接种浓度下，^，ps76和str8都产生黄化褪绿斑；在psl病菌<=1×10⁵的接种浓度下，ps76和str8子叶的都不产出黄化褪绿斑，两者无差异；在psl病菌为1×10⁶接种浓度下，ps76和str8症状差异明显，其中ps76表现为无褪绿斑，而str8的表现为黄化褪绿，该浓度合适用于区分抗感材料。

图4黄瓜材料gy14和9930子叶注射接种psl的抗病性表现。gy14和9930在接种后7天的症状表现，其中gy14的子叶无明显褪绿黄化症状，而感病的9930子叶表现为明显的褪绿黄化症状。

具体实施方式

1.黄瓜细菌角斑病病菌psl强致病力菌株的分离鉴定

采用平板分离法分离黄瓜细菌角斑病的致病力菌株psl：①田间采集具有黄瓜细菌角斑病典型症状的病叶，放入离心管中，室内无菌条件下用10%次氯酸钠消毒3min，用无菌的蒸馏水冲洗三次。②在离心管里用无菌的玻璃棒将病叶捣碎，加无菌水0.5ml，取无菌的接种针沾取捣碎的病菌汁液，在kb培养基上划线，24℃暗培养2天直至菌落长出。③选取单菌落kb划板培养，然后培养的划线菌用无菌水在平板上冲洗，收集黄瓜细菌角斑病菌液后，用无菌水调节菌液浓度在1×10⁶cfu/ml。④用注射器轻轻在黄瓜子叶叶背面注射接种，直至菌液浸透整个子叶叶背面。⑤以24℃光照培养16小时、20℃黑暗培养8小时、湿度100%的条件培养3至7天。⑥根据接种后子叶褪绿黄化的程度来判断黄瓜细菌角斑病菌株的致病力水平，选取强致病力的黄瓜细菌角斑病菌株用于随后的抗病鉴定研究。分离的强毒力psl菌株可以用无菌的1%脱脂奶粉保存，并加甘油至终浓度为30%，分装在1.5ml离心管后于-80℃下长期保存。

2.pls强毒力菌株的接种浓度的确定

以抗病的黄瓜自交系ps76和感病自交系str8为材料，种子用10%的次氯酸钠消毒后，用水冲洗3遍，催芽后定植于48孔育苗盘上，每个材料种8株，置于人工气候室中培养，培养条件：24℃光照培养16小时、20℃黑暗培养8小时，直至黄瓜的两片子叶完全展开时，于接种前2天将苗盘用透明的塑料盖密封保持湿度100%，随后子叶可方便用于接种。根据步骤（1）选取的强致病力的psl菌株，从冻存的-80℃冰箱里取出迅速在没有融化的情况下用针刺菌然后在kb固体培养基中划线，随后在24℃下暗培养1d，然后活化的菌株再转接到kb固体培养基上，暗培养2d，用分光光度计测定菌液的浓度，并用无菌的蒸馏水将调整菌液浓度分别为1×10⁸cfu/ml、1×10⁷cfu/ml、1×10⁶cfu/ml和1×10⁵cfu/ml，每个育苗盘接种不同浓度梯度，并设置无菌水对照。随后将psl菌液轻轻注射入黄瓜幼苗的一个子叶背面的细胞间隙中，另一个子叶不进行接种（图2）。接种完后扣透明的塑料盖密封，在人工气候室内保持24℃光照培养16小时、20℃黑暗培养8小时，湿度在100%，保持7天，然后统计接种后的子叶的发病症状，当某一浓度的psl菌液接种后在抗病材料上症状表现为无明显褪绿晕环、子叶浓绿色，而感病材料表现为有明显的褪绿晕环、子叶黄化时，此时的psl菌液浓度为最适接种浓度，在psl病菌>=1×10^7：的接种浓度下，^，ps76和str8都产生黄化褪绿斑；在psl病菌<=1×10⁵:的接种浓度下，ps76和str8子叶的都不产出黄化褪绿斑，两者无差异；在psl病菌为1×10⁶:接种浓度下，ps76和str8症状差异明显，其中ps76表现为无褪绿斑，而str8的表现为黄化褪绿，该浓度合适用于区分抗感材料。表明psl强致病力菌株的最适宜接种浓度为1×10⁶cfu/ml（图1、图3）。

1.子叶注射接种psl快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病技术建立

对黄瓜的种质资源育苗并进行抗病鉴定。具体方法同（2），黄瓜种质资源在人工气候室进行育苗，每个种质资源种8株，待到子叶完全展开时用于接种，采用psl的最适接种浓度（1×10⁶cfu/ml）接种黄瓜的子叶背面，用手托起子叶，用无菌的注射器将菌液轻轻注入子叶背面的细胞间隙，注意在注入的时候避免接种部位产生伤口。子叶接种完后在人工气候室内保持100%的湿度7天，然后统计不同黄瓜种质资源接种子叶的症状。接种的子叶表现为黄化褪绿的为感病，而子叶叶片浓绿、无褪绿斑的为抗病。通过上述方法，我们筛选了10个抗细菌角斑病的材料，4个感病材料，其中4个抗病材料配制成2个杂交组合，建立了一种黄瓜子叶注射快速准确鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，为应用该方法开展黄瓜抗细菌角斑病病育种奠定了技术基础（图4）。表1为不同的黄瓜材料对psl抗病性表现。筛选出10份抗病材料（r），4份感病材料（s）。

表1不同的黄瓜材料对psl抗病性表现

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