MGST1基因在肺腺癌细胞中增殖与凋亡中的应用的制作方法

本发明涉及一种人源mgst1的新用途，尤其是涉及人源mgst1基因在肺腺癌细胞的增殖与凋亡中的应用。

背景技术：

肺癌是一种恶性程度很高的肿瘤，在全球范围内都存在很高的发病率和死亡率，严重威胁着人们的生命健康。在我国，因罹患肺癌而产生的死亡率也是位居所有恶性肿瘤的首位，也是目前肿瘤研究者研究的重点和难点。肺腺癌是肺癌最常见的组织类型之一，近些年的疗效并没有明显的改善，患者的5年生存期仍然很低，患者的预后还是很差，生活质量很低。因此研究肺腺癌的致病驱动基因，探寻肺腺癌新的治疗靶基因具有重大意义。

微粒体谷胱甘肽s转移酶1(microsomalglutathionestransferase1，mgst1)是编码蛋白质基因，位于12号染色体短臂12区3带，mgst1蛋白属于第ii相代谢酶，催化结合反应、代谢外源性物质尤其是药物排出体外。在亚细胞水平mgst1主要分布于内质网、微粒体和线粒体外膜，具有被氧化应激活化的特性，保护这些膜免受氧化应激。近年来，氧化应激逐渐成为研究肿瘤形成及发展因素的热点。氧化和抗氧化失衡通过细胞信号传导，调控癌基因及抑癌基因的表达，促进细胞的增殖分化，导致细胞凋亡减少，从而引发肿瘤。并且已有大量文献报道，mgst1参与黑色素瘤、神经母细胞瘤的氧化应激调节肿瘤的发生发展。

为了研究mgst1在肺腺癌中发挥的作用，本发明采用慢病毒感染高表达mgst1的人肺腺癌细胞，运用mts、平板克隆染色、流式细胞仪，裸鼠皮下成瘤等方法检测mgst1对肺腺癌细胞增殖及凋亡的影响。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于：(1)提供人源mgst1基因在抑制a549肺腺癌细胞系增殖中的应用；(2)提供人源mgst1基因在抑制a549肺腺癌细胞系凋亡中的应用；(3)提供人源mgst1基因在抑制肿瘤生长中的应用。

为了实现以上目的，本发明通过如下技术方案进行实现：

1.培养a549肺腺癌细胞系。

2.用慢病毒感染a549细胞，对照组为无关序列scramble，实验组mgst1-85、mgst1-86两个序列，对照组和实验组均带有gfp绿色荧光标签。其中scramble序列、shmgst1-85序列、shmgst1-86的序列表如下：

scramble序列：5’-ttctccgaacgtgtcacgt-3’

shmgst1-85序列：5’-actgcaactgcattctata-3’

shmgst1-86序列：5’-gaagactgtgtagcatttg-3’

3.通过以下方法来研究mgst1在肺腺癌中发挥的作用：

(1)用western检测慢病毒感染a549的mgst1蛋白表达；

(2)用mts检测敲减mgst1后细胞增殖能力；

(3)用平板克隆检测敲减mgst1后细胞克隆形成能力；

(4)用流式细胞仪检测敲减mgst1后细胞凋亡；

(5)运用裸鼠皮下成瘤技术，在体内层面研究mgst1基因对肿瘤生长的作用。

结果表明：敲减a549细胞的mgst1基因后，a549细胞中mgst1蛋白的表达水平显著下降，细胞的增殖能力显著下降，细胞平板克隆形成能力显著减低，早期细胞凋亡显著增加，皮下成瘤瘤体积显著减小。

附图说明

图1为：慢病毒感染a549细胞效率，图a和b分别为无关序列scramble明场和荧光，图c和d分别为shmgst1-85明场和荧光，图e和f分别为shmgst1-86明场和荧光。(放大倍数：50倍；标尺20um)

图2为：western检测慢病毒抑制mgst1蛋白的表达。

图3为：mts检测表明抑制mgst1的表达能显著降低a549细胞的增殖能力，p<0.05。

图4为：平板克隆检测表明抑制mgst1的表达能显著抑制a549细胞的克隆形成能力，p<0.01。

图5为：流式细胞仪检测抑制mgst1的表达显著增加a549细胞的早期凋亡率，p<0.05。

图6为：裸鼠成瘤实验结果表明抑制mgst1的表达能显著减小肺腺癌肿瘤的体积，抑制肿瘤生长。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

具体实施方式1：mgst1慢病毒感染

a549细胞系铺6孔板10小时后，换成含5ug/ulpolybree的无血清rpmi-1640medium，加入相应的病毒体积(细胞个数*moi/病毒滴度)，培养8小时后，将培养基换成含10％胎牛血清rpmi-1640medium。转染后72小时检测荧光发光情况(图1),可观察到对照组及实验组慢病毒感染效率均大于80％。

具体实施方式2：western检测蛋白表达

将细胞收集于离心管内离心，2000rpm，4min，预冷的pbs洗两次，根据细胞量加入合适体积的ripa(10μl/ml的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，吹打混匀，ep管封口膜封闭后放于4℃细胞碎裂超声仪中，500watt，裂解20min；14000g，20min离心，沉淀细胞碎片，上清即为细胞全蛋白，bca法测定浓度。每孔蛋白上样量为50ug。电泳条件5％浓缩胶80v，50分钟；12％分离胶120v，100分钟。转膜条件100v，100分钟。mgst1一抗稀释比例1:1000，二抗稀释比例1:8000。

检测结果(图2)所示：实验组shmgst1-85、shmgst1-86细胞中mgst1的蛋白表达明显比对照组scramble低。

具体实施案例3：抑制mgst1的表达可显著抑制肺腺癌细胞a549的增殖

采用mts实验来检测人肺腺癌细胞株a549的增殖情况。取处于生长指数期的对照组scramble和实验组shmgst1-85、shmgst1-86细胞，细胞计数后接种于96孔细胞培养板，每孔2000个细胞，全波长扫描仪490nm波长处测取od值，数据分析。

实验结果(图3)显示：与对照组scramble相比，实验组shmgst1-85、shmgst1-86细胞增殖速度均明显减慢，且随时间的推移，活细胞数的差值开始具有统计学意义，p<0.05，说明抑制mgst1的表达后能够显著抑制人肺腺癌a549细胞的增殖。

具体实施案例4：抑制mgst1的表达可显著抑制肺腺癌细胞a549的细胞克隆形成能力

采用平板克隆形成实验来检测人肺腺癌细胞株a549的克隆形成能力情况。取处于生长指数期的对照组scramble和实验组shmgst1-85、shmgst1-86细胞，细胞计数后接种于6孔细胞培养板，每孔200个细胞，每组设置3个平行复孔，放37℃5％co2恒温培养箱中培养14天左右，培养至肉眼可见克隆形成；克隆形成后，终止培养，弃培养基，pbs缓冲液小心清洗2次，晾干，加1ml甲醇固定30min，弃甲醇晾干后加入1ml吉姆萨染液染色30min，洗去染液，晾干；计数大于50个细胞的克隆数，做柱状图分析数据。

结果(图4)显示：实验组shmgst1-85、shmgst1-86细胞克隆形成数目均明显比对照组scramble少，p<0.01。说明抑制mgst1表达后可显著抑制肺腺癌细胞a549的细胞克隆形成能力。

具体实施案例5：抑制mgst1的表达可显著增加肺腺癌细胞a549的早期凋亡率

采用流式细胞仪来检测a549细胞的凋亡情况。取处于生长指数期的对照组scramble和实验组shmgst1-85、shmgst1-86细胞，用无edta的胰酶消化成单细胞悬液，2000rpm，离心5min；pbs液洗两次，弃上清，500μlbindingbuffer重悬细胞，加5μlannexinv-apc(凯基生物)混匀后，加入5μl7-add(凯基生物)染液，混匀后避光室温孵育15min；1小时内上机检测样品。整理数据，分析结果。

检测结果(图5)显示：实验组shmgst1-85、shmgst1-86细胞早期凋亡率均明显比对照组scramble高，(4.43±0.84)、(4.37±1.92)％vs(1.30±0.10)％，p<0.05，但晚期凋亡率无明显差异。

具体实施方式6：抑制mgst1的表达可显著减少裸鼠皮下肿瘤的体积

取处于生长指数期的对照组scramble和实验组shmgst1-85细胞，用胰酶消化成单细胞悬液，2000rpm，离心5min；pbs液洗两次，弃上清，并用pbs液重悬，细胞计数，注射于雄性4周balb/c裸鼠左侧腋下，每只裸鼠注射5*10⁶个细胞，每组7只裸鼠，裸鼠成瘤7周左右，解剖瘤体，整理数据，分析结果。

结果(图6)显示：实验组shmgst1-85的瘤体积和瘤体重明显比对照组scramble小。

以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。