用于鉴定辣椒品种兴蔬绿燕杂交种纯度的SSR分子标记及其方法与流程

本发明涉及辣椒分子标记技术领域，特别涉及一种用于鉴定辣椒品种兴蔬绿燕杂交种纯度的ssr分子标记及其方法。

背景技术：

“兴蔬绿燕”是湖南省蔬菜研究所选育的中晚熟杂交羊角椒品种，适宜于湖南省种植，据不完全统计仅2013年-2015年间推广面积已经达到近40万亩。“兴蔬绿燕”株高70厘米，植株生长势旺，植株开展度80厘米×80厘米，始花节位第12节。果长21.5厘米，果径1.8厘米，肉厚0.3厘米，果肩平或斜，果顶锐尖，果面光亮，果形顺直，青熟果为绿色，成熟果鲜红色，平均单果重22.1克，果实味辣，风味好。挂果性强，坐果率高，采收期长，以鲜食为主，可盐渍、酱制加工。抗病性与抗逆性较强，适于嗜辣地区作丰产栽培(湘审椒2013003)。辣椒是以自交为主的常异花授粉植物，也存在一定概率的天然杂交事件，由于在杂种f1代制种时需要人工辅助授粉，授粉过程需要人工去雄，制种过程中父本可能的生物学混杂、去雄时机不当、天然杂交、植株自交等原因都可能导致杂交种纯度的下降或严重下降，从而给种子生产企业、销售代理和辣椒生产企业或种植户造成巨大的经济损失。因此，对f1代种子进行纯度鉴定是进行种植销售前的一个必不可少的环节。

目前，辣椒种子的纯度检测技术一直以来都落后于辣椒育种和制种技术，其主要应用的方法还是传统的形态检测法，即采用田间种植形态观测法，这种方法耗时至少4个月、场地占用面积大、费工，而且所得的结论与观察者的实践经验密切相关，所以准确率低，存在着天然的局限性。随着分子生物学技术的发展，近年来已有很多利用ssr(simplesequencerepeat,ssr)标记进行辣椒种子纯度检测的案列，在小麦、水稻等作物上已经广泛使用。ssr分子标记所揭示的多态性直接反应辣椒不同个体间基因组dna的差异，不受植株生长发育阶段和环境的影响，具有准确性高、重复性好、样品数量多、操作简单、耗时很短的优点。ssr分子标记在辣椒上的应用对于提高育种效率、保证品种质量安全、加快育种进程具有重要意义。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于鉴定辣椒品种兴蔬绿燕杂交种纯度的ssr分子标记及其方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

用于鉴定辣椒品种“兴蔬绿燕”杂种f1种子纯度的ssr分子标记，其引物序列ca47，包括父本ca47-1和母本ca47-2，大小分别为157bp和169bp。

用于pcr扩增上述分子标记的引物序列ca47如下：

ca47f：tggaggctatggaactcacc；

ca47r：aagctgctgttgtccctcat。

利用ncbi中的辣椒est数据库、ssr分子标记引物数据库及参考文献中报道的辣椒ssr引物中有目的性的筛选120对ssr引物，将上述120对ssr引物合成后进行引物多态性筛选；筛选的具体过程为：首先提取兴蔬绿燕f1、兴蔬绿燕父本和母本的基因组dna，然后以兴蔬绿燕f1、兴蔬绿燕父本和母本的基因组dna为模板，120对ssr引物分别逐对进行pcr扩增，扩增完毕后进行聚丙稀铣胺凝胶电泳，电泳完毕后对凝胶显染色，最后对每一对引物扩增出来的条带进行判断，如果某一对引物的扩增条带在父母本中具有多态性，并在f1代中同时显示出父母本的特征条带时，我们就确定这一对引物可以用于后续的精准鉴定试验，否则，则表示这一对引物不适合鉴定兴蔬绿燕的父母本及其杂种一代。最终，经过这一选择过程，我们选择出了用于后续鉴定试验的ssr分子标记引物对ca47f和ca47r。

一种利用ssr分子标记鉴定辣椒品种“兴蔬绿燕”杂种f1种子纯度的方法，包括以下步骤：

1)选取兴蔬绿燕f1代辣椒种子和兴蔬绿燕的父本、母本种子；

2)以待检测的辣椒幼苗基因组dna为模板，使用ssr引物对ca47进行pcr扩增；

3)将pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果检测的产物中同时含有父本和母本所对应的条带，则该检测样本为“兴蔬绿燕”真杂种。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明一种用于鉴定辣椒品种兴蔬绿燕杂交种纯度的ssr分子标记及其方法，利用开发的ssr分子标记引物组及其检测方法可以将“兴蔬绿燕”杂交f1种子与其父本、母本区分开来，快速鉴定和检测出杂交种子的纯度。本方法不受植株生长发育阶段和环境的影响，具有准确性高、重复性好、样品数量多、操作简单、耗时短的优点，具有较高的商业应用前景，值得大范围推广。

附图说明

图1为ca47引物对鉴定辣椒品种“兴蔬绿燕”种子(兴蔬绿燕f1代辣椒种子和兴蔬绿燕的父本、母本种子由湖南省蔬菜研究所辣椒课题组提供；)纯度的部分pcr产物电泳图。其中♂和♀分别表示父本和母本泳道，其特征性带型分别为157bp和169bp，编号1-11为“兴蔬绿燕”杂交种泳道，除9号泳道没有跑出带型、2号泳道带型较弱外，其他泳道都兼具父本和母本的特征带型。

图2为利用引物ca47引物对兴蔬绿燕的大规模检测验证部分电泳图；

图3利用引物ca47引物对博辣红牛辣椒品种的大规模检测验证部分电泳图；

图4利用引物ca47引物对兴蔬215辣椒品种的大规模检测验证部分电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

用于鉴定辣椒品种兴蔬绿燕杂交种纯度的ssr分子标记及其方法

实验例1：

2015年3月，我们利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的辣椒est数据库、ssr分子标记引物数据库、参考文献中报道的辣椒ssr引物(kong,etal,2012；hill,etal,2013；nicolaietal,2013等文献)，有目的性的筛选了120对ssr引物，这其中既有est-ssr引物(前人利用est序列开发的引物)也包含有gdna-ssr引物(前人利用基因组序列开发的引物)。将120对ssr引物委托北京三博生物科技有限公司合成，引物合成后进行引物多态性筛选。筛选的具体过程为：首先提取兴蔬绿燕f1、兴蔬绿燕父本和母本的基因组dna，然后以兴蔬绿燕f1、兴蔬绿燕父本和母本的基因组dna为模板，120对ssr引物分别逐对进行pcr扩增，扩增完毕后进行聚丙稀铣胺凝胶电泳，电泳完毕后对凝胶显染色，最后对每一对引物扩增出来的条带进行判断。如果某一对引物的扩增条带在父母本中具有多态性，并在f1代中同时显示出父母本的特征条带时，我们就确定这一对引物可以用于后续的精准鉴定试验，否则，则表示这一对引物不适合鉴定兴蔬绿燕的父母本及其杂种一代。经过这一选择过程，我们选择出了用于后续鉴定试验的ssr分子标记引物对ca47f和ca47r。图1为ca47引物对鉴定辣椒品种“兴蔬绿燕”种子(其中，兴蔬绿燕f1代辣椒种子和兴蔬绿燕的父本、母本种子由湖南省蔬菜研究所辣椒课题组提供，本发明中发明人通过市售渠道获得；)纯度的部分pcr产物电泳图。其中♂和♀分别表示父本和母本泳道，其特征性带型分别为157bp和169bp，编号1-11为“兴蔬绿燕”杂交种泳道，除9号泳道没有跑出带型、2号泳道带型较弱外，其他泳道都兼具父本和母本的特征带型。

实验例2：

1.种子消毒。随机取适量辣椒种子(100粒左右)，放在灭菌的培养皿中，加入5ml5％的次氯酸钠溶液，浸泡10min，期间不停混匀，随后用灭菌蒸馏水洗涤4次以洗干净次氯酸钠。

2.种子催芽。准备好一种子催芽专用塑料盒(长宽高＝10×10×5cm，有盖，透明)，底部放一张灭菌滤纸，滤纸上滴入灭菌蒸馏水至滤纸完全湿润。将灭菌好的辣椒种子点入塑料盒滤纸上，盖上盖子。随后将塑料盒放入28℃的恒温培养箱中催芽。

3.采用植物组织直接pcr试剂盒进行dna提取和pcr扩增，具体步骤如下：

3.1辣椒基因组dna提取

3.1.1取发芽后(培养箱中培养8-10天)的辣椒幼苗10mg或1cm²组织放入1.5ml离心管中，每个离心管插入一根塑料研磨棒，加入液氮后快速研磨成粉末，后加入100μlpd1buffer，涡旋混匀；

3.1.2将离心管置于金属加热器或水浴中95℃孵育30min。

3.1.3加入100μlpd2buffer，常温下涡旋混匀，此混匀的液体用于后续pcr扩增的dna模板。

3.2pcr扩增

3.2.1pcr扩增反应体系如下：

3.2.2pcr扩增反应程序如下：

3.3用于辣椒幼苗dna提取和pcr扩增反应的试剂盒为transdirect^tmplanttissuepcrkit，从北京全式金生物技术有限公司订购。

4.将3.2.2所得的pcr产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

4.1凝胶电泳为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，配制方法如表1。

其中凝胶配方较为完整的展现了不同体积的凝胶对应的各组分的比例，不同比例的凝胶代表待鉴定的不同样本的大小。

表1、8％丙烯酰胺凝胶电泳配方

4.2电泳。首先80v电压20min，后200v稳压电泳80min。

5.显染色，将4.2电泳所得凝胶进行显色和染色，具体过程如下：

5.1漂洗：染胶盒中加入200ml蒸馏水，卸page胶于盒中，漂洗一次。

5.2染色：用硝酸银专用杯称量0.3gagno3，加入蒸馏水溶解后沿染胶盒边缘倒入，摇动5～8min。

5.3漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2次，洗净后倒掉蒸馏水。

5.4显色：用显色液专用杯称量3gnaoh加入200ml蒸馏水溶解，再加入1.5ml甲醛，混匀后沿染胶盒边缘倒入，摇动直至显出清晰条带，时间大约6～8分钟。

5.5洗涤：显影清晰后，倒掉显影液，用自来水清洗凝胶2次(自来水沿盒子边缘加入)，彻底去掉显影液，以免保存时变色。

5.6保存：保鲜膜包胶，统计带型，照相，保存。

本发明中，申请人对显染色过程进行了优化，将传统染色显色过程耗时近3.5小时缩短到了不到40分钟，明显提高了染色显色效率。

6.种子纯度计算方法：

根据5.6中带型统计结果计算杂交种子纯度，如果检测的种子表现出双亲带型，说明是杂交种；如果仅出现单个亲本带型或其他带型，则表示该种子为假杂种。杂交种子纯度(pure，p)的数值用百分比(％)表示，具体计算公式如下：

公式中：p为杂交种子纯度，n为具有双亲带型的种子数量，n为检测的种子总数量。

实验例3：

2015年12月-2016年1月，我们分别从三个不同辣椒品种兴蔬绿燕、兴蔬215、博辣红牛中随机抽取出一定数量的杂交f1种子及其父本母本种子进行催芽发芽，并提取dna，利用ca47引物分别对其dna进行pcr扩增，利用本发明的方法进行凝胶电泳和染色显色，并计数统计，验证ca47引物的正确性。我们对兴蔬绿燕进行了96孔板扩增，其中包括父本1个、母本1个、f1种子94个，检测结果显示，94个f1种子中有1个只具有母本的条带，而93个具有双亲的条带，检测结果表明该批次的兴蔬绿燕杂交种子f1代的纯度为p＝93/94*100＝98.94％。在随后的多批次检测中，检测准确率都在98％以上。检测结果的部分电泳图见图2；

随后我们用同样的方法对博辣红牛和兴蔬215的种子也进行了pcr扩增、电泳和染色显色试验，并进行了计数统计，结果发现，ca47引物对的pcr扩增结果在博辣红牛和兴蔬215中没有多态性，f1代和双亲的条带都是一样的，因此ca47引物不能用于区分博辣红牛和兴蔬215这两个辣椒品种。检测结果见图3和图4。这也进一步说明ca47引物用于鉴定兴蔬绿燕杂交种的纯度是特定的、可行的、准确的。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。