本发明属于医学领域，尤其涉及一种验证急性病毒性肝炎的动物模型及其构建方法。
背景技术：
胰岛素抵抗(insulinresistance，ir)就是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，即靶组织对胰岛素反应的敏感性下降，由此，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。ir是ii糖尿病(t2dm)发病的重要机制之一，改善ir是t2dm的基础研究及药物开发的重点。肝脏是胰岛素作用的靶组织之一，是胰岛素抵抗发生的主要部位。胰岛素敏感性降低可导致肝脏葡萄糖异生和葡萄糖输出增加与餐后高胰岛素血症，高胰岛素水平能进一步加重胰岛素抵抗程度，并促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，而胰岛素抵抗更是与包括肝癌等多种肿瘤的发生、进展、转移以及预后不良密切相关，还可促使肿瘤细胞对常规抗癌药物产生抗性，降低肿瘤治疗效果，产生肿瘤多药耐药(mdr)的作用。另外胰岛素抵抗的发生可以通过增加机体氧化应激水平而诱导自噬的发生。自噬是由内质网来源的双层膜结构包裹细胞质中的变性蛋白和受损细胞器形成自噬泡，并携带进入溶酶体内进行降解和加工的过程，其在肿瘤细胞发生发展中具有复杂的作用，因而建立高自噬活性的胰岛素抵抗肝癌细胞模型，便于观察胰岛素抵抗与自噬的关系，了解在肝癌中二者作用消长对于化疗药物敏感性影响及其作用机制，特别是方便于筛选与肝癌耐药性相关的指标、选取抵抗肝癌耐药的高效化疗药物具有重要价值。
hepg2细胞源于人肝胚胎瘤细胞，保留了肝细胞许多特征的同时也具有肿瘤细胞的特性，其表达高亲和力的胰岛素受体，发挥葡萄糖摄取、糖原合成酶的活性，脂类生成及rna的合成等作用，同时也具有无限增殖能力和一定的化疗药物耐受性。目前，在胰岛素抵抗和自噬的研究中，尤其研究胰岛素抵抗与自噬机制的联系、化疗药物的筛选及作用靶点、探索肿瘤耐药性早期诊断靶点方面，迫切需要一种同时兼备胰岛素抵抗性、高自噬性，同时又是肿瘤的细胞模型。近年来研究人员已成功复制了多种胰岛素抵抗细胞模型，大多数模型的诱导困难、耗时长且不具备较长时间的稳定性，这些模型对于在较长时间对胰岛素抵抗及其耐药机制的观察有很大程度的局限性。另外，迄今还未有报道建立同时具备胰岛素抵抗性和高自噬活性的耐药肿瘤细胞模型。因此，建立一种简单、稳定、经济，同时具备胰岛素抵抗及高自噬活性的耐药细胞模型显得尤为重要。
目前，肝炎已经成为威胁人类健康几大疾病之一，而我国又是肝炎高发大国。临床上，急性肝炎在肝炎患者中占了一定的比例，多种病因可以导致急性肝损伤，严重的肝损伤引起肝细胞变性、坏死，可进一步发展成为肝衰竭。目前，开发疗效显著而低毒副作用的治疗急性肝炎药物研究成为众多研究关注的热点。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前癌肝转移瘤种植模型发病率高、模型生存时间短、不能适应长时间实验、未能模拟肿瘤转移的全过程、不符合临床肝转移瘤的发生机制特征、诱导周期较长等缺陷；大多数模型的诱导困难、耗时长且不具备较长时间的稳定性；而且对构建的模型缺乏检测技术，不能准确验证构建的模型效果。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种验证急性病毒性肝炎的动物模型及其构建方法。
本发明是这样实现的，一种验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法，所述验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法包括以下步骤：
清洁级雄性大鼠240只，体重240g～350g；动物随机分为正常对照组、急性病毒性肝炎模型组；
细胞培养：将常规培养的肝癌hepg2细胞接种于含10％～15％dmem培养基中在36℃～37℃，5％～10％co2培养箱中孵育至少12h～18h，使之完全贴壁后备用；先用无血清培基洗涤备用的肝癌hepg2细胞，接着更换无血清的dmem培养液同步化6h～12h，然后加入1μmol/l～1.5μmol/l胰岛素，置于36℃～37℃，5％～10％培养箱中孵育72h～96h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/l～0.05mol/l磷酸缓冲盐溶液洗涤2次～4次，然后再用ph6.0～6.5的酸性dmem培养液36℃～37℃孵育15min～25min；再用0.01mol/l～0.05mol/l磷酸缓冲盐溶液洗涤4～6次，即成肝癌hepg2细胞的培养；所述dmem培养基中溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸5-35mg/l、精氨酸10-60mg/l、天门冬酰胺5-25mg/l、天冬氨酸15-80mg/l、胱氨酸5-30mg/l、谷氨酸50-100mg/l、谷氨酰胺40-80mg/l、甘氨酸5-20mg/l、组氨酸5-10mg/l、异亮氨酸5-15mg/l、亮氨酸10-20mg/l、赖氨酸10-25mg/l、甲硫氨酸10-30mg/l、苯丙氨酸5-20mg/l、脯氨酸10-40mg/l、丝氨酸10-30mg/l、苏氨酸10-40mg/l、色氨酸5-80mg/l、酪氨酸10-50mg/l、缬氨酸10-20mg/l、羟基脯氨酸5-10mg/l、高半胱氨酸2-10mg/l、牛磺酸5-15mg/l；
接种造模：用培养好的肝癌hepg2细胞接种于急性病毒性肝炎模型组；将肝癌hepg2细胞液0.05ml～0.1ml连续接种15天；观察大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现；
rna微阵列基因检测：30天后，将接种急性病毒性肝炎模型组的大鼠处死，肺脏被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作；用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna；取适量rna溶液，经紫外分光光度计定量测定rna样品od260和od280值，计算rna浓度，1％琼脂糖电泳观察总rna，取2-5μg用microconcentrifugalfilter微离心过滤柱过滤，得到片段小于300个核苷酸的小rna；应用poly聚合酶将小rna的3’端加上poly(a)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的荧光标记，完成μparaflotmmicrorna微阵列基因；
表达实验和分析：通过微循环泵杂交仪器在μparaflotm微流体芯片上过夜，使用含甲酸胺sspe缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光扫描仪采集杂交图象，array--pro软件对杂交图像进行数字化转换、数据处理和分析，计算两组检测到信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点，大鼠微阵列芯片包括454个microrna，包含数据库中成熟的microrna和部分成熟microrna的互补链；芯片上的检测探针均进行18个重复，实验进行4次。
进一步，表达实验和分析后还需进行：
实时荧光定量pcr检测：用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna，计算rna浓度；特异逆转录引物从taqmanmicrornaassays获得，并用taqmanmicrornareversetranscriptionkit将rna反转录为cdna进行实时荧光定量pcr检测，反应结束后用abiprism7900软件分析结果，pcr实验进行6次，用比较阈值循环方法分析数据，得到ct值，即荧光达到阈值所需的pcr循环数，并分析基因相对表达量。
进一步，实时荧光定量pcr检测后需进行生物信息学预测：应用miranda、targetscan和pictar3个生物信息学靶基因预测软件，对microrna芯片结果中挑选出来的microrna的靶基因做出预测；
进一步，生物信息学预测后需进行统计学处理：根据资料的性质、分布和设计特点，应用spss13.0统计软件对数据进行分析。
进一步，用激光扫描仪采集杂交图象方法包括：
对急性病毒性肝炎动物模型进行超声探查所用探头为l15-7io浅表探头，对肝脏异常回声记录，并测量大小后采集图像；
对构建的急性病毒性肝炎动物模型进行microct增强扫描，microct采用的造影剂为fenestralc，造影剂用量为0.4ml/20g，每次扫描采取的增强方式：注入造影剂后4小时进行扫描；
所述图像的融合规则为：
其中，τ1＝1/(1+exp{-β(||ma||2-||mb||2)}),(β＞0)，
ma,mb分别表示源图像每块的均值；源图像xa和xb分别减去ma和mb得到
所述通信图像灰度级的取值范围为g＝{0，1，2┄，l-1}，大小为m×n的图像，假设灰度级为i的像素点数为mi，各灰度级的分布概率为：
设定一个阀值t，将图像灰度级分为c0和c1两组，u0和ω0为c0组的灰度平均值和产
生的概率；u1和ω1为c1组的灰度平均值和产生的概率，两组间的方差表达式如下式：
其中u是整幅图像的灰度平均值，如下式：
图像的阀值分割方法，得到公式，如下：
当z值取最大时，此时，两组间的相似性最小，方差值最大，而其中的每一组组内方差值最小，找到了最优化的阀值t，此时就可取得最优阀值t：
t＝argmaxδ2(t)；
对构建的急性病毒性肝炎动物模型进行磁共振肝脏横断位及冠状位扫查，扫描序列：t2wi横断面及冠状位。
进一步，观察大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现的检测方法包括：
对构建的急性病毒性肝炎动物模型进行micropet成像；麻醉好的急性病毒性肝炎动物模型通过尾静脉注射100μci的放射性分子探针0.2ml，俯卧位头先进的体位固定于扫描床上，于注射药物的一小时后行扫描18f-fdg，20分钟后18f-fb-nga；均静态扫描10分钟；
扫描结束后，将扫描的图像用osem3d迭代重建，迭代4次，重建后利用医学分析软件pmod勾画感兴趣区域，并得到相应感兴趣区域上放射性物质摄取的平均值。
本发明的另一目的在于提供一种验证急性病毒性肝炎动物模型。
本发明提供的建立的大鼠模型，证明了急性病毒性肝炎可能存在的多靶点多层次的网络式调控机制。
本发明通过分组实验揭示了分子水平上急性病毒性肝炎本质的部分科学内涵。证明了证候的宏观表型与微观生物分子之间的复杂关系。
本发明之构建方法具有操作简单，成本低的特点，耐药肝癌hepg2细胞模型稳定性高、自噬活性高，并具有高自噬活性导致的化疗药物耐受性，有助于在体外分析；本发明可用于肝癌细胞耐药性的早期诊断试剂盒；可用于筛选改善肝癌自噬活性的药物以有效改善肝癌细胞的耐药状态。实验证明，通过本发明建立的耐药肝癌hepg2细胞模型具有稳定96小时以上的胰岛素抵抗性。
模型组出现活动度明显减少、体毛凌乱；体重减轻。
本发明提供的动物模型及其构建方法，首次对不同高、低转移潜能癌株及生物学特性进行对比分析，发现高低不同癌株及高低不同转移结节之间生物学特性指标表达有统计学差异；首次对高、低不同转移特性的癌株的影像进行分析；首次对多种pet成像进行最佳组合，充分反映了肝转移瘤发生生物学特性，为早期肝转移的发现及诊断提供新方法。
本发明克服了原有模型模型生存时间短、不能适应长时间实验的缺陷。本发明尤其是适合临床常见的超声、ct、mri和pet等多种影像技术成像分析，而且操作简单，费用低。为临床早期肝转移的诊断提供先进的影像诊断技术。
附图说明
图1是本发明实施例提供的验证急性病毒性肝炎的动物模型构建方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
如图1所示：本发明实施例提供的验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法，所述验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法包括以下步骤：
s101:清洁级雄性大鼠240只，体重240g～350g；动物随机分为正常对照组、急性病毒性肝炎模型组；
s102:细胞培养：将常规培养的肝癌hepg2细胞接种于含10％～15％dmem培养基中在36℃～37℃，5％～10％co2培养箱中孵育至少12h～18h，使之完全贴壁后备用；先用无血清培基洗涤备用的肝癌hepg2细胞，接着更换无血清的dmem培养液同步化6h～12h，然后加入1μmol/l～1.5μmol/l胰岛素，置于36℃～37℃，5％～10％培养箱中孵育72h～96h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/l～0.05mol/l磷酸缓冲盐溶液洗涤2次～4次，然后再用ph6.0～6.5的酸性dmem培养液36℃～37℃孵育15min～25min；再用0.01mol/l～0.05mol/l磷酸缓冲盐溶液洗涤4～6次，即成肝癌hepg2细胞的培养；
s103:接种造模：用培养好的肝癌hepg2细胞接种于急性病毒性肝炎模型组；将肝癌hepg2细胞液0.05ml～0.1ml连续接种15天；观察大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现；
s104:rna微阵列基因检测：30天后，将接种急性病毒性肝炎模型组的大鼠处死，肺脏被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作；用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna；取适量rna溶液，经紫外分光光度计定量测定rna样品od260和od280值，计算rna浓度，1％琼脂糖电泳观察总rna，取2-5μg用microconcentrifugalfilter微离心过滤柱过滤，得到片段小于300个核苷酸的小rna；应用poly聚合酶将小rna的3’端加上poly(a)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的荧光标记，完成μparaflotmmicrorna微阵列基因；
s105:表达实验和分析：通过微循环泵杂交仪器在μparaflotm微流体芯片上过夜，使用含甲酸胺sspe缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光扫描仪采集杂交图象，array--pro软件对杂交图像进行数字化转换、数据处理和分析，计算两组检测到信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点，大鼠微阵列芯片包括454个microrna，包含数据库中成熟的microrna和部分成熟microrna的互补链；芯片上的检测探针均进行18个重复，实验进行4次。
所述dmem培养基中溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸5-35mg/l、精氨酸10-60mg/l、天门冬酰胺5-25mg/l、天冬氨酸15-80mg/l、胱氨酸5-30mg/l、谷氨酸50-100mg/l、谷氨酰胺40-80mg/l、甘氨酸5-20mg/l、组氨酸5-10mg/l、异亮氨酸5-15mg/l、亮氨酸10-20mg/l、赖氨酸10-25mg/l、甲硫氨酸10-30mg/l、苯丙氨酸5-20mg/l、脯氨酸10-40mg/l、丝氨酸10-30mg/l、苏氨酸10-40mg/l、色氨酸5-80mg/l、酪氨酸10-50mg/l、缬氨酸10-20mg/l、羟基脯氨酸5-10mg/l、高半胱氨酸2-10mg/l、牛磺酸5-15mg/l。例如：
(1)丙氨酸5mg/l、精氨酸10mg/l、天门冬酰胺5mg/l、天冬氨酸15mg/l、胱氨酸5mg/l、谷氨酸50mg/l、谷氨酰胺40mg/l、甘氨酸5mg/l、组氨酸5mg/l、异亮氨酸5mg/l、亮氨酸10mg/l、赖氨酸10mg/l、甲硫氨酸10mg/l、苯丙氨酸5mg/l、脯氨酸10mg/l、丝氨酸10mg/l、苏氨酸10mg/l、色氨酸5mg/l、酪氨酸10mg/l、缬氨酸10mg/l、羟基脯氨酸5mg/l、高半胱氨酸2mg/l、牛磺酸5mg/l；
(2)丙氨酸20mg/l、精氨酸35mg/l、天门冬酰胺15mg/l、天冬氨酸47.5mg/l、胱氨酸17.5mg/l、谷氨酸75mg/l、谷氨酰胺60mg/l、甘氨酸12.5mg/l、组氨酸7.5mg/l、异亮氨酸10mg/l、亮氨酸15mg/l、赖氨酸17.5mg/l、甲硫氨酸20mg/l、苯丙氨酸12.5mg/l、脯氨酸25mg/l、丝氨酸20mg/l、苏氨酸25mg/l、色氨酸42.5mg/l、酪氨酸30mg/l、缬氨酸15mg/l、羟基脯氨酸7.5mg/l、高半胱氨酸6mg/l、牛磺酸10mg/l
(3)丙氨酸35mg/l、精氨酸60mg/l、天门冬酰胺25mg/l、天冬氨酸80mg/l、胱氨酸30mg/l、谷氨酸100mg/l、谷氨酰胺80mg/l、甘氨酸20mg/l、组氨酸10mg/l、异亮氨酸15mg/l、亮氨酸20mg/l、赖氨酸25mg/l、甲硫氨酸30mg/l、苯丙氨酸20mg/l、脯氨酸40mg/l、丝氨酸30mg/l、苏氨酸40mg/l、色氨酸80mg/l、酪氨酸50mg/l、缬氨酸20mg/l、羟基脯氨酸10mg/l、高半胱氨酸10mg/l、牛磺酸15mg/l
表达实验和分析后还需进行：
实时荧光定量pcr检测：用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna，计算rna浓度；特异逆转录引物从taqmanmicrornaassays获得，并用taqmanmicrornareversetranscriptionkit将rna反转录为cdna进行实时荧光定量pcr检测，反应结束后用abiprism7900软件分析结果，pcr实验进行6次，用比较阈值循环方法分析数据，得到ct值，即荧光达到阈值所需的pcr循环数，并分析基因相对表达量。
实时荧光定量pcr检测后需进行生物信息学预测：应用miranda、targetscan和pictar3个生物信息学靶基因预测软件，对microrna芯片结果中挑选出来的microrna的靶基因做出预测；
生物信息学预测后需进行统计学处理：根据资料的性质、分布和设计特点，应用spss13.0统计软件对数据进行分析。
用激光扫描仪采集杂交图象方法包括：
对急性病毒性肝炎动物模型进行超声探查所用探头为l15-7io浅表探头，对肝脏异常回声记录，并测量大小后采集图像；
对构建的急性病毒性肝炎动物模型进行microct增强扫描，microct采用的造影剂为fenestralc，造影剂用量为0.4ml/20g，每次扫描采取的增强方式：注入造影剂后4小时进行扫描；
所述图像的融合规则为：
其中，τ1＝1/(1+exp{-β(||ma||2-||mb||2)}),(β＞0)，
ma,mb分别表示源图像每块的均值；源图像xa和xb分别减去ma和mb得到
所述通信图像灰度级的取值范围为g＝{0，1，2┄，l-1}，大小为m×n的图像，假设灰度级为i的像素点数为mi，各灰度级的分布概率为：
设定一个阀值t，将图像灰度级分为c0和c1两组，u0和ω0为c0组的灰度平均值和产
生的概率；u1和ω1为c1组的灰度平均值和产生的概率，两组间的方差表达式如下式：
其中u是整幅图像的灰度平均值，如下式：
图像的阀值分割方法，得到公式，如下：
当z值取最大时，此时，两组间的相似性最小，方差值最大，而其中的每一组组内方差值最小，找到了最优化的阀值t，此时就可取得最优阀值t：
t＝argmaxδ2(t)；
对构建的急性病毒性肝炎动物模型进行磁共振肝脏横断位及冠状位扫查，扫描序列：t2wi横断面及冠状位。
观察大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现的检测方法包括：
对构建的急性病毒性肝炎动物模型进行micropet成像；麻醉好的急性病毒性肝炎动物模型通过尾静脉注射100μci的放射性分子探针0.2ml，俯卧位头先进的体位固定于扫描床上，于注射药物的一小时后行扫描18f-fdg，20分钟后18f-fb-nga；均静态扫描10分钟；
扫描结束后，将扫描的图像用osem3d迭代重建，迭代4次，重建后利用医学分析软件pmod勾画感兴趣区域，并得到相应感兴趣区域上放射性物质摄取的平均值。
本发明提供一种验证急性病毒性肝炎动物模型。
本发明提供的建立的大鼠模型，证明了急性病毒性肝炎可能存在的多靶点多层次的网络式调控机制。
本发明通过分组实验揭示了分子水平上急性病毒性肝炎本质的部分科学内涵。证明了证候的宏观表型与微观生物分子之间的复杂关系。
本发明之构建方法具有操作简单，成本低的特点，耐药肝癌hepg2细胞模型稳定性高、自噬活性高，并具有高自噬活性导致的化疗药物耐受性，有助于在体外分析；本发明可用于肝癌细胞耐药性的早期诊断试剂盒；可用于筛选改善肝癌自噬活性的药物以有效改善肝癌细胞的耐药状态。实验证明，通过本发明建立的耐药肝癌hepg2细胞模型具有稳定96小时以上的胰岛素抵抗性。
模型组出现活动度明显减少、体毛凌乱；体重减轻。
本发明提供的动物模型及其构建方法，首次对不同高、低转移潜能癌株及生物学特性进行对比分析，发现高低不同癌株及高低不同转移结节之间生物学特性指标表达有统计学差异；首次对高、低不同转移特性的癌株的影像进行分析；首次对多种pet成像进行最佳组合，充分反映了肝转移瘤发生生物学特性，为早期肝转移的发现及诊断提供新方法。
本发明克服了原有模型模型生存时间短、不能适应长时间实验的缺陷。本发明尤其是适合临床常见的超声、ct、mri和pet等多种影像技术成像分析，而且操作简单，费用低。为临床早期肝转移的诊断提供先进的影像诊断技术
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。