本发明涉及杂环化合物，特别涉及一种吡喃骈吲哚化合物的制备方法及其用途。
背景技术：
血栓性疾病是引起人类死亡的三大疾病之一，严重威胁人类生命和健康，血栓性疾病引起的死亡人数已经超过恶性肿瘤。溶栓疗法是早期急性心肌梗塞和血栓栓塞性疾病的有效治疗方法。纤溶疗法是早期急性心肌梗塞和其它血栓性疾病的有效治疗方法，这种疗法是通过药物激活血液潜在活性的纤溶酶原，形成活性的纤溶酶降解血栓成纤维蛋白降解产物而溶解血栓。纤溶疗法被誉为20世纪心脑血管药理学领域的十大发现之一。
国内外临床上使用的溶栓药物近百种，典型的是链激酶(streptokinase，sk)、尿激酶(urokinase-typeplasminogenactivator，uk，u-pa)、重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinanttissue-typeplaminogenactivator，rt-pa)，对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(anisoylatedplasmsnogenstreptokinaseactivatorcomplex，apsac)和重组链激酶(reeombinantstreptokinase，r-sk)等。
典型的纤溶疗法在临床上使用的药品如组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂等会带来出血的重大危险性，只能用于治疗严重血栓患者。由于纤溶酶原激活剂类药物存在安全性问题，研究者正在使用组织型纤溶酶原激活剂重组变异体(recombinantvariantsoftissue-typeplasminogenactivator，rt-pa)等低分子量化合物以降低出血危险性，活化的血液蛋白质c的抗凝血作用和促进纤溶作用正在受到关注。在临床上，消除血栓的药物如血小板膜特异性糖蛋白抑制剂阿昔单抗，除了具有出血危险性外，还带来了像阿司匹林减少血小板的副作用。
心脑血管药理学领域正亟需出血危险性小、不损伤血液因子、专一性高的小分子化合物作为药物的出现，寻找这样的小分子化合物并将其开发成高效、特异、安全的溶栓药物一直是全球的研究热点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种吡喃骈吲哚类化合物，该目标化合物能提高纤溶酶原活性，促进fitc(异硫氰酸荧光素)-纤维蛋白降解，具有很好的溶栓活性。
本发明的另一个目的是提供吡喃骈吲哚类化合物的制备方法。
本发明的又一个目的是提供吡喃骈吲哚类化合物的用途。
本发明目的是通过以下技术方案来实现的。
第一方面，本发明涉及一种吡喃骈吲哚类化合物，其结构通式如式i、ii所示，
第二方面，本发明涉及吡喃骈吲哚类化合物的制备方法，其步骤包括：
s1、将菌株fg216接种于斜面培养基，然后将斜面菌株fg216种子培养液按照1％的接种量，接种于查氏培养基中，22-26℃、180r·min-1的恒温摇床上培养4-6天，然后再添加培养基体积1％重量的鸟氨酸，培养24-28小时；
s2、加入与查氏培养基等体积的甲醇，超声处理12-18分钟，在转速10000rpm条件下离心12-18分钟，取上清液在55-65℃下减压浓缩、真空干燥；然后将干固物溶于甲醇中，过滤，取上清液减压浓缩、真空干燥；最后将干固物硅胶柱层析得到所述吡喃骈吲哚类化合物。
所述fg216菌株分离自舟山群岛海域，属于小单胞菌属(micromonosporasp.)。该菌株名称：stachybotryslongisporafg216，保藏号：cctccno.m2012272，保藏日期：2012年7月6日，保藏地点：中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学。
优选的，所述查氏培养基由蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、氯化钴、硫酸亚铁、氯化钙和海水组成，经灭菌后使用。
优选的，所述查氏培养基的ph值为5.8。
更优选的，查氏培养基为，每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、酵母提取物1g、氯化钴0.0025g、硫酸亚铁0.015g、氯化钙0.0065g。
优选的，步骤s2中，硅胶柱层析的流动相为氯仿-甲醇-乙酸，体积比为7∶1∶0.1-4∶1∶0.1。
第三方面，本发明涉及一种药物组合物，该组合物中含有结构通式为式i、ii的化合物。
优选的，所述药物组合物中的含有的吡喃骈吲哚类化合物占药物组合物总量的0.1wt％-99wt％。
第四方面，本发明涉及本发明的吡喃骈吲哚类化合物在制各治疗或预防血栓栓塞性疾病药物中的用途。
第四方面，本发明涉及本发明的药物组合物在制备治疗或预防血栓栓塞性疾病药物中的用途。
本发明制备的吡喃骈吲哚类化合物用作药物时，可直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
所述药物组合物含有0.1％-99％的本发明制备的吡喃骈吲哚类化合物化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒的惰性的可用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂，可以是是乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸钠等。将本发明的药物组合物以单位体服用量的形式使用。本发明的药物组合物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
本发明具有如下有益效果：
1、所述吡喃骈吲哚类化合物能够提高纤溶酶原活性，经过检测，吡喃骈吲哚类两个化合物在体外具有一定的溶栓活性，ec50分别为40μm和120μm，且化合物ii具有极低的体内毒性。
2、所述吡喃骈吲哚类化合物可用于治疗或预防血栓栓塞性疾病药物中，血危险性小、不损伤血液因子、专一性高。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
fg216菌株，该菌株属于小单胞菌属(micromonosporasp.)。该菌株名称：stachybotryslongisporafg216，保藏号：cctccno.m2012272，保藏日期：2012年7月6日，保藏地点：中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学。
查氏培养基，该培养基每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、酵母提取物1g、氯化钴0.0025g、硫酸亚铁0.015g、氯化钙0.0065g，ph5.8经灭菌后使用。
实施例1
将菌株fg216接种于斜面培养基，然后将培养好的斜面菌株fg216种子培养液按照1％的接种量，接种于查氏培养基中，25℃、180r·min-1的恒温摇床上培养4天，然后再添加培养基体积1％重量的鸟氨酸，培养24小时完成发酵培养。培养结束后，三角瓶中加入与等体积的甲醇，超声15min，在转速10000rpm条件下离心15min，弃除沉淀，上清液在60℃条件下减压蒸馏蒸干，浓缩物真空干燥8h，干固物溶于20ml的甲醇溶液中，过滤弃除沉淀，收集上清液，再减压浓缩真空干燥，所得干固物硅胶柱层析氯仿-甲醇-乙酸，体积比为7∶1∶0.1-4∶1∶0.1。而得到具有溶血栓促进作用的吡喃骈吲哚类化合物i和吡喃骈吲哚类化合物ii。
吡喃骈吲哚化合物i的结构式为：
分子式：c28h38n2o5
分子量：482
性状：白色粉末
1hnmr(cdcl3，500mhz)：δ7.27(1h，s)，5.31(1h，brs.)，5.09(1h，t，j＝7.0hz)，5.03(1h，t，j＝7.0hz)，4.65(1h，d，j＝19.5hz)，4.60(1h，d，j＝19.5hz)，4.11(1h，t，j＝5.5hz)，3.76(2h，m)，3.73(1h，m)，2.81(1h，dd，j＝17.7，5.2hz)，2.48(1h，dd，j＝17.7，5.2hz)，2.15(2h，s)，2.09(2h，dd，j＝15.5，7.2hz)，2.01-1.97(3h，m)，1.92-1.89(3h，m)，1.60(3h，s)，～1.57(2h，m)，1.55(3h，s)，1.52(3h，s)，1.13(3h，s)；13cnmr(cdcl3，125mhz)：δ161.8，157.8，148.5，135.0，131.1，129.5，124.5(2c)，119.6，114.1，99.7，79.6，66.2，60.1，57.5，50.0，39.6，37.7，30.2，27.2，26.6(2c)，25.9，24.5，21.4，18.5，18.0，16.2；esims：m/z483[m+h]+，hresims：calaforc28h39n2o5[m+h]+483.2853，found483.2856.
吡喃骈吲哚化合物ii的结构式为
分子式：c28h38n2o5
分子量：482
性状：白色粉末
1hnmr(cdcl3，500mhz)：7.04(1h，s)，5.23(1h，d，j＝4.4hz)，5.07(1h，t，j＝6.8hz)，5.03(1h，t，j＝6.8hz)，4.65(1h，d，j＝18.5hz)，4.49(1h，d，j＝18.5hz)，4.34(1h，s)，3.75-3.67(2h，m)，2.81(1h，dd，j＝17.8，5.2hz)，2.54-2.50(2h，m)，2.09-2.04(2h，m)，2.00-1.96(2h，m)，1.89(2h，t，j＝7.5hz)，1.86-1.78(2h，m)，1.60(3h，s)，1.57-1.55(2h，m)，1.53(3h，s)，1.52(3h，s)，1.17(3h，s)；13cnmr(cdcl3，125mhz)：δ163.7，157.3，148.5，135.0，131.5，130.1，124.51，124.46，120.6，114.0，99.6，79.6，66.2，66.1，58.3，49.0，39.6，37.4，29.6，27.1，26.6，25.9，24.6，21.4，18.9，18.0，16.1；esims：m/z483[m+h]+，hresims：calaforc28h39n2o5[m+h]+483.2853，found483.2835.
活性评价：
(1)、对结构式i、ii中的两个化合物的体外纤溶活性测定
采用发色底物法评定微生物代谢产物，以评测从长孢葡萄穗霉stachybotryslongisporafg216中分离提取出的化合物fgfc2，ll-z1272β和麦角固醇，是否具有纤溶促进作用。在纤溶酶原(plg)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(pro-upa)、牛血清白蛋白(bsa)、发色底物和待测样品构成的反应体系中，连续测定纤溶酶的生成引起的吸光度的变化以评定化合物的活性。
于96孔圆底平板孔内依次注入tris-hcl溶液、bsa、s-2043和plg溶液，其浓度和剂量见表1，加入样品溶液10μl后再注入单链尿激酶型纤溶酶原激活剂溶液，成54μl反应体系。加完样后放入酶标仪中检测样品吸光度，检测温度为37℃，检测波长为405nm，以此评定样品的纤溶活性。对照组则使用等体积tris-hcl溶液作空白对照。
表1
结论：
实验结果显示，实施例1制备的结构式i、ii中的吡喃骈吲哚类两个化合物在体外具有一定的溶栓活性，ec50分别为40μm和120μm。
毒性评价：
以昆明种小鼠为实验对象，吡喃骈吲哚化合物经口给药，实验结果表明化合物ii显示无毒，在caco-2实验显示化合物ii具有低的表观渗透系数和低的渗透性，所以进一步采用静脉给药的方式，研究了化合物ii的急性毒性实验，glp实验室的结果表明，icr小鼠的ld50＞250mg/kg，三次急性毒性实验结果表明，化合物ii显示极低毒性。
实施例2
将实施例1中制得的结构式i、ii的吡喃骈吲哚类两个化合物，各取1mg分别用0.5ml的dmso溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例3
将实施例1中制得的结构式i、ii的吡喃骈吲哚类两个化合物，各取1mg分别用0.5ml的dmso溶解后，按常规加注射用水，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，分装于安培瓶中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例4
将实施例1中制得的吡喃骈吲哚类化合物，按照喃骈吲哚类化合物与赋形剂的重量比为9∶1的比例混合，制成粉剂。所述赋形剂为乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸钠等，制成粉剂。
实施例5
将实施例1中制得的吡喃骈吲哚类化合物，按照喃骈吲哚类化合物与赋形剂的重量比为5∶1的比例混合，制成粉剂。所述赋形剂为乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸钠等，制成粉剂。
实施例6
将实施例1中制得的吡喃骈吲哚类化合物，按常规口服液制法，制成口服液。
实施例7
将实施例1中制得的吡喃骈吲哚类化合物，按其与赋形剂按照重量比为5∶1的比例混合制成胶囊，赋形剂可以是乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸钠。
实施例8
按实施例1中制得的吡喃骈吲哚类化合物，按其与赋形剂按照重量比为3∶1的比例混合，制成胶囊，赋形剂可以是乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸钠。