维生素C在制备培养基中的用途的制作方法

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及维生素c在制备培养基中的用途、促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化的培养基以及促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化的方法。

背景技术：

造血干细胞是指一类具有自我更新能力，并能分化为各种血细胞(红细胞、白细胞和血小板)的细胞。由于其具有造血重建能力，在临床上造血干细胞被广泛用于治疗各种血液疾病，包括：遗传性疾病(如：地中海贫血症、镰刀形贫血症、再生障碍性贫血、范可尼贫血症等)以及非遗传性疾病(如：白血病等)。

临床上通常采用造血干细胞移植的方式治疗。造血干细胞移植是指通过向患者体内输注造血干细胞，从而重建患者正常造血与免疫系统，进而达到治疗疾病的方法。通常造血干细胞移植用以治疗造血功能异常、免疫功能缺陷、血液系统恶性肿瘤等，其疗效高、很多患者得到长生存期、乃至疾病得以根治。通常的造血干细胞来源有：外周血、骨髓、脐带血和胎盘。造血干细胞移植已经成功地被用于临床治疗系列白血病，但是由于其来源有限，且异体移植时，具有不可回避的配型问题，限制了其广泛地应用。

因而，寻找一种可以大量提供配型相合的，具有正常功能的造血干细胞来源，是目前造血干细胞领域最首要的任务。

而hescs/hipscs(人类胚胎干细胞/人类诱导多能干细胞)的出现无疑为解决上述问题提供了一个可能的答案。由于hescs/hipscs可以无限扩增，从而使得大量地从它们分化获得造血干/前体细胞(hematopoieticstem/progenitorcells,hs/pcs)成为可能；又如前所述，目前实验支持hipscs可以有效地回避免疫排斥反应的发生，因而可以回避配型问题。因此，有效地从hpscs获得可用于移植的hs/pc，是目前干细胞和造血领域十分重要的问题。

目前，在体外诱导hpscs分化产生hs/ps，主要包括三种方法：基质细胞共培养法；eb(embryoidbody；拟胚体)法和单层分化方法。

基质细胞共培养法是采用从造血微环境(niche)中分离得到的基质细胞与hpscs进行培养，在基质细胞和含血清培养基的共同作用下，将hpscs分化成造血前体细胞(hematopoieticprogenitorcell；hpcs)。在这些基质细胞中比较有代表性的，目前为许多实验室采用的是op9细胞，一种骨髓间充质细胞。该方法被报道有效地将hpscs分化成cd34⁺cd43⁺cd45^+/-的hpcs。

eb法是先将hpscs制备成拟胚体(embryoidbody；eb)，以模拟体内的三胚层发育的过程，然后再加入培养基，通常包含有特定的细胞因子，如bmp4，这些因子能促使细胞依次向中胚层和hpc方向分化。eb法可以在含血清的培养基中进行造血分化，也可在无血清的培养基中进行分化。

单层分化的方法是绕过eb形成的步骤，直接用含有生长因子的培养基，将贴壁生长的细胞分化成hpc。

然而，稳定高效的诱导分化体系仍需要进一步改进。

技术实现要素：

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

发明人通过实验发现，对于人多能干细胞造血分化的基础培养基basalmedium(bm)：dmem/f12(hyclone)+1％its(insulin-transferrin-selenium，gibco)，添加与不添加维生素c(vc)对多能干细胞造血分化的效率影响非常大。在添加维生素c时，人的多能干细胞能有效地分化为cd34⁺cd43⁺的hpc；而在不添加时，人的多能干细胞几乎不能有效地分化为cd34⁺cd43⁺的hpc。

基于此，在本发明的第一方面，本发明提出了维生素c在制备培养基中的用途，所述培养基用于促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化。发明人通过实验发现，在人多能干细胞造血分化的单层分化培养体系中，添加维生素c可有效促进人的多能干细胞诱导分化成cd34⁺cd43⁺的hpc，申请人认为，维生素c对促进人多能干细胞(包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞)的定向造血分化具有重要作用.

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述造血分化包括多能干细胞向内皮细胞、造血前体细胞以及终末分化细胞的至少之一的分化。发明人发现，利用添加有维生素c的诱导分化培养基，对胚胎干细胞或诱导多能干细胞向内皮细胞、造血前体细胞以及终末分化细胞的至少之一的分化都有显著的促进作用。

根据本发明的具体实施例，所述胚胎干细胞或诱导多能干细胞为人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞。发明人发现，利用添加有维生素c的培养基，在促进人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化中效果更加显著。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化的培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：dmem/f12、its以及维生素c。发明人通过实验发现，包含有dmem/f12、its以及维生素c的培养基可有效促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞的造血分化。

根据本发明的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，基于100毫升的所述dmem/f12，所述its的用量为1ml，所述维生素c的用量为不低于1mg，优选地，所述维生素c用量为7mg。发明人发现，维生素c用量低于1mg时，促造血分化效果下降；维生素c用量为7mg时，促造血分化进一步显著提高。发明人发现，在上述用量下，培养基促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化的效率进一步显著提高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的培养基培养所述胚胎干细胞或诱导多能干细胞。利用根据本发明实施例的促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化的方法，可高效促进多能干细胞诱导分化成cd34⁺cd43⁺的hpc。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述培养基中进一步含有bmp4、activina、bfgf、vegf以及sb431542的至少之一。其中，bmp4和activina促进人多能干细胞向中胚层分化，vegf和bfgf及sb431542促进中胚层向内皮及造血转变。

根据本发明的具体实施例，所述bmp4在所述培养基中的终浓度为50ng/ml。

根据本发明的再一具体实施例，所述activina在所述培养基中的终浓度为50ng/ml。

根据本发明的再一具体实施例，所述bfgf在所述培养基中的终浓度为50ng/ml。

根据本发明的再一具体实施例，所述vegf在所述培养基中的终浓度为50ng/ml。

根据本发明的再一具体实施例，所述sb431542在所述培养基中的终浓度为10μm。

根据本发明的实施例，预先将所述胚胎干细胞或诱导多能干细胞接种在12-well培养板中，所述胚胎干细胞或诱导多能干细胞的接种密度为1.5*10⁵个/孔。发明人发现，细胞密度低于1.5*10⁵个/孔时，更换诱导培养基会造成细胞大量死亡，影响下一步分化；细胞密度高于1.5*10⁵个/孔时，更换诱导培养基，细胞不容易分化，而大大降低分化效率。

根据本发明的实施例，所述12-well培养板预先铺有growthfactorreducedmatrigel(减生长因子的基质胶)，预先铺设上述基质胶，细胞能够贴壁生长及且分化效率会进一步提高。

根据本发明的实施例，所述接种后的人多能干细胞预先在mtesr1培养基培养过夜，这样更有利于人多能干细胞的生长及分化。

根据本发明的实施例，在培养的第0～1天，所述培养是在含有dmem/f12、its、维生素c、bmp4以及activina的培养基中培养的。使用该培养基可有效促进中胚层分化。

根据本发明的再一具体实施例，在培养的第2～3天，所述培养是在含有dmem/f12、its、维生素c、bfgf以及vegf的培养基中培养的。使用该培养基可以有效促进内皮细胞分化。

根据本发明的再一具体实施例，在培养的第4天，所述培养是在含有dmem/f12、its、维生素c、bfgf、vegf以及sb431542的培养基中培养的。使用该培养基可以有效促进造血前体细胞生成。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的vc促进人多能干细胞向造血前体细胞分化的结果图，

其中，a为人多能干细胞造血分化的流程图；

b为vc添加与否的情况下，对照组(con.，添加vc)与实验组(-vc，不添加vc)生成cd34⁺细胞的情况；

c为在vc添加与否的情况下，对照组与实验组生成cd34⁺cd31⁺细胞的情况；d为在

vc添加与否的情况下，对照组与实验组生成cd34⁺cd43⁺细胞的情况；以及

图2是根据本发明实施例的cfu形成实验结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

(1)vc促进人多能干细胞向造血前体细胞分化

发明人在本申请基础培养基bm(dmem/f12(hyclone)+1％its(insulin-transferrin-selenium，gibco)+维生素c(vc，gibco，70ng/ml))的基础上，测试含有或不含有维生素c的基础培养基，对人多能干细胞造血分化的影响。如图1a所示，第-1天时，发明人将人的胚胎干细胞h1用2mg/ml的dispase(中性蛋白酶)消化成小块，每个小块含有约20-50个细胞；然后接种到铺有growthfactorreducedmatrigel(bd)的12孔板上，每孔接种约15万细胞。采用mtesr1培养基培养过夜。在第0天时，更换成bm培养基或者不含有vc的基础培养基bm，并添加终浓度bmp4(50ng/ml，peprotechinc.)，activina(50ng/ml，sinobiologicalinc.)；第二天时更换同样的基础培养基，细胞因子换为bfgf(50ng/ml，sinobiologicalinc.)，vegf(50ng/ml，sinobiologicalinc.)；第4天时，更换同样的基础培养基，细胞因子换为bfgf(50ng/ml，sinobiologicalinc.)，vegf(50ng/ml，sinobiologicalinc.)，以及sb431542(10μm，selleck)。在分化第7天时，即可检测血液细胞的形成。

如图1b所示，在添加vc的情况下，人多能干细胞分化产生的cd34⁺细胞，要比不添加vc的高；更进一步地，发明人分析cd34⁺cd31⁺内皮细胞的得率，发现添加vc的情况下，要比不添加vc的高(结果如图1c所示)；同样分析造血前体细胞的得率发现，发现添加vc的情况下，要比不添加vc的cd34⁺cd31⁺细胞得率要高(结果如图1d所示)。说明vc在人多能干细胞造血分化的过程中，不但促进内皮细胞的生产，也促进造血前体细胞的生产。

(2)在添加vc的情况下，生产的造血前体细胞具有生产各系血液细胞能力

发明人为了验证在添加vc的情况下，生成的造血前体细胞是否具有生成血液细胞的能力，发明人将cd34⁺的细胞在分化第7天，通过磁珠分选出来，在半固体培养基(methoculth4435，stemcell)中进行集落(colony-formingunit，cfu)形成实验验证，并与不添加vc，形成的cd34⁺细胞进行比较。实验结果表明，在添加vc的情况下，上述造血前体细胞具有形成各系集落的能力(结果如图2所示，图2显示了cd34⁺细胞形成的cfu的能力，其中，e表示红细胞；g表示粒细胞；m表示巨噬细胞；gm表示g和m的混合集落；mix表示e、g和m的混合集落)，证明他们具有生成血液细胞的能力。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。