本发明涉及一种从山莓鲜果中提取木犀草素和山莓素的方法，属于天然产物分离技术领域。
背景技术：
山莓又名山抛子、牛奶泡、撒秧泡，三月泡、四月泡、龙船泡，蔷薇科悬钩子属的植物。分布于日本、越南、朝鲜、缅甸以及中国大陆的甘肃、西藏、东北、青海、新疆等地，生长于海拔200米至2,200米的地区，多生在向阳山坡、山谷、荒地、溪边和疏密灌丛中潮湿处，目前尚未由人工引种栽培。落叶灌木，高1—2米，小枝红褐色，有许多皮刺分布于枝干，幼枝带绿色，有柔毛及皮刺。叶卵形或卵状披针形，长3.5—9厘米，宽2—4.5厘米，顶端渐尖，基部圆形或略带心形，不分裂或有时作3浅裂，边缘有不整齐的重锯齿，两面脉上有柔毛，背面脉上有细钩刺；叶柄长约1.5厘米，有柔毛及细刺；托叶线形，基部贴生在叶柄上。花白色，直径约2厘米，通常单生在短枝上；萼片卵状披针形，有柔毛，宿存。聚合果球形，直径1—1.2厘米，成熟时红色。花期4—5月，果期5—6月。
山莓果实氨基酸(20.84mg/g·fw)至少含有17种氨基酸，包括8种人体必需氨基酸；sod含量达237.98μg/g·fw；矿质元素含量丰富，尤其是锶(se)；种子油中脂肪酸尬发以下饱和脂肪成分以不饱和脂肪酸为主，亚油酸(46.56％)、亚麻酸(11.67％)有较高含量，此外，含丰富糖类、蛋白质、有机酸、维生素、氨基酸等营养成分，被称为“第三代黄金水果”的，还含有木犀草素和山莓素等活性物质。
木犀草素白色或类白色结晶性粉末，易溶于水，溶于乙醇等极性有机溶剂。对山莓酮葡萄糖苷(rkg)、山莓酮半乳糖苷和山莓酮木糖苷的黑色素形成抑制作用进行了对比。结果显示rkg的黑色素抑制作用最强，山莓酮半乳糖苷次之，山莓酮木糖苷无抑制作用。
木犀草素(rkg)具有很好的抗老化、美白、亮肤及皮肤调理作用。近年研究表明，皮肤中由一氧化氮合成酶作用而合成的一氧化氮给皮肤造成很大伤害，使皮肤变得粗糙、老化的同时，也成为色素沉积的主要原因之一。木犀草素则是一优良的一氧化氮捕捉剂，添加在护肤品可以有效的消除皮肤中过多的一氧化氮，从而降低酪氨酸酶活性，减少黑色素的形成。
山莓素是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分，没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯，它不仅以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式(以鞣花单宁或苷等)存在于自然界。。山莓素与三氯化铁的显色反应呈蓝色，遇硫酸呈黄色。它微溶于水、醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚。山莓素表现出对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用，特别是对结肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮肤肿瘤等有很好的抑制作用。红山莓---“第三代水果”是当今发现的天然山莓素含量最高的食物，远远超过了核桃和越橘等，并且美国明尼苏达大学和南卡罗来纳医科大学贺岭斯癌症中心研究证实，红山莓中含有大量的山莓素，可有效抵抗致癌症物质和致有机突变的物质。
公开号为cn101204240的中国专利公开了一种红山莓清澈型果汁、果醋饮料，其特征在于所述的红山莓清澈型果汁、果醋饮料的工艺步骤为：原料挑选、打浆、酶解、分离澄清、离心过滤、添加辅料调配、胶体磨加工、均质机处理、脱气、热灌装、杀菌、冷却、成品。实现糖度：10°bx；酸度(以乙酸计)0.8mg/100ml；该饮料不添加任何色素，可酿制成色彩艳丽的纯天然饮料，含天然植物sod、山莓酮、水杨酸等品质和精华，为人们提供了一种具有养颜美容、抗癌、抗衰老、降血压、降血脂和预防贫血、肠胃病、心脑血管疾病的保健功效的果汁饮料。
公开号为cn101002619的中国专利公开了一种红山莓混浊果汁饮料，其配比为：红山莓∶水为1∶3；向上述配比液中添加辅料：糖度(白砂糖)：11.5％；酸度(柠檬酸)：ph＝3.5；果胶为上述果汁配比重量的0.08％，cmc0.2％。经过以下步骤：挑选红山莓、加热90℃处理、过100目取汁、添加辅料调配、胶体磨加工、均质处理、脱气、加热90℃、罐装、杀菌、冷却、成品。该饮料不用添加色素，可酿制成色彩艳丽的纯天然饮料，含天然植物sod、山莓酮、水杨酸等品质和精华，为人们提供了一种具有养颜美容、抗癌、抗衰老、降压、降脂和预防贫血、肠胃病、心脑血管疾病的保健功效的果汁饮料。
公开号为cn101401775的中国专利公开了一种日用皮肤美白功效纳米乳的制备方法，其特征在于包括以下步骤：按日用型纳米乳原料配比，将乙二胺四乙酸二钠置于容器中，再加入三重蒸馏水进行充分溶解后，再依次加入柠檬酸和naoh充分溶解后，依次加入n-乙酰葡萄糖胺，l-抗坏血酸2-葡糖苷，完全溶解后，再依次加入β-山莓酮葡萄糖苷，维生素pp因子，以上物质的溶解可以置于cq-10超声震荡器中进行超声震荡加速溶解；再慢慢加入光甘草定应用液，待完全溶解后，测定该溶液ph值为4.7±0.2，用彩色记号笔标记为水相(i)；将肉豆蔻酸异丙酯，置于另一个容器中，取维生素e加入肉豆蔻酸异丙酯中，置于超声振荡器中震荡超声进行混匀，再加入黄芩苷、苯乙基间苯二酚，也置于超声振荡器中震荡超声使之完全溶解，并用记号笔标记为油相(ii)；再将辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(s)∶聚甘油脂肪酸酯(c)＝3∶1的比例，分别取辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯，并将两者置于第三个容器中，加盖，并将此容器迅速置于液体快速混合器上，打开液体快速混合器，充分混合均匀，使之形成乳化剂/助乳化剂(s/c)混合物，3-5min后，关闭液体快速混合器，加入阿魏酸异辛酯，按上述方法进行混匀，并用记号笔标记为s/c混合物(iii)；按照油相(ii)∶s/c(iii)∶水相(i)＝15％∶35％∶50％的比例，先分别取水相(i)、s/c混合物(iii)置于第四个容器中；将上述水相(i)、s/c混合物(iii)两液相充分混合后，再在室温25℃条件下或者自然室温中，将其放入超声振荡器中震荡并超声2min左右，或者在室温25℃条件下或者自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm·min-1的转速磁力搅拌5min，然后，再在此容器中直接加入油相(ii)，并将整个体系在超声振荡器中超声10min左右，或者在室温25℃条件下或者自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm/min的转速磁力搅拌20min；关闭超声振荡器或者定时恒温磁力搅拌器，取下容器，观察其外观如是微淡黄色、清亮透明、流体性和分散性好、有明显可见乳光者，即为日用皮肤美白功效纳米乳；将此日用皮肤美白功效纳米乳迅速分装于不同规格的避光玻璃容器之中，加盖，消毒，包装，并置于干燥、通风、阴凉的室温之中保存即可。
公开号为cn101718690a的中国专利公开了一种山莓山莓素的测定方法，采用紫外光谱扫描山莓素标准品溶液，确定山莓素的最大吸收峰及测定溶剂甲醇，确定并验证在一定浓度范围内山莓素含量与吸光度之间的线性关系；然后利用有机溶剂乙酸乙酯将山莓中的山莓素成分提取出来，采用紫外吸收法测定山莓素的含量。该方法所测定山莓素的浓度范围在0ug/ml～18ug/ml，检测限为0.25ug，实现了操作简捷，数据可靠，快速高效，低成本的测定。
公开号为cn103190612a的中国专利公开了一种山莓山莓素咀嚼片及其加工方法，包括以下步骤：将具有活性物质的山莓采摘后，经风选、剔除杂质后破碎；先后用12倍量和8倍量的丙酮总共回流1.5小时，加热温度至不高于80℃，提取山莓素后过滤、洗涤得到山莓素固体，将山莓素固体粉碎后备用；对山莓进行挑选、风选、去杂、经过0.5％的柠檬酸与0.3％的抗坏血酸合用灭酶处理后，在400pa真空压力和60℃干燥温度下脱水，当山莓含水率在6-6.5％以下时，置入超微粉碎机中制得山莓纤维粉；在70-75％的山莓纤维粉中加入2-5％的葡萄糖粉、0.1-0.3％的大麦芽粉、0.1-0.5％的南瓜粉、0.5-2％的大豆卵磷脂和5-10％的木糖醇，经过筛分，除去较大颗粒制成预混粉料；在预混粉料中加入1-4％的山莓素、2.1～3.1％的果葡糖浆、0.1-0.3％的柠檬酸、0.1-0.3％的羟甲基淀粉钠、1-3％的硬脂酸镁和0.1-0.3％的d-异抗坏血酸钠，混和均匀，也可根据不同人群口感加入少量的酸味剂进行调配，酸碱调整范围不宜过大，以免失去山莓固有香味；把混合均匀的料送入摇摆颗粒机进行造粒，混动摇摆次数60次/分；造粒后放进热风循环烘箱干燥0.5小时，风量3600立方米/小时，干燥温度控制在55℃；最后在旋转式压片机中压片成型，压片压力55kn。
公开号为cn103766859a的中国专利公开了一种强化山莓素含量的红山莓果酱生产工艺，包括以下步骤：红山莓冻果在常温下解冻6h，鲜果水清洗去除杂质；使用绞肉机对解冻的原料果进行破碎(孔径8mm)，制得原料酱；树苺浆与提取剂水以1:11的比例在微波设备中提取1.5h，温度为75℃；将真空度升至0.05-0.08mpa，按树苺液：白砂糖：柠檬酸＝5:4.5:0.5比例抽入原辅料，充分的搅拌，温度达到85-95℃；调整好浓度的酱体泵入平衡罐灌装，灌装机内酱体温度不得低于85℃；杀菌水温一段≥92℃；二段≥95℃；控制冷却中心温度≤40℃；检查，吹干水分，装箱。
从山莓研究文献来看，黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、抗心率失常、抗氧化高效性与低毒性、抗衰老等生理活性。木犀草素具有抑菌和活肤美白的作用，山莓素不易溶于甲醇、氯仿，表现出对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用，特别是对结肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮肤肿瘤等有很好的抑制作用。
山莓野生资源蕴藏量相当大，具有良好的开发价值和应用前景。目前对其研究主要集中在资源调查，而对它的药效成分提取、药理方面的研究报道很少，特别是其果实之药用价值未被重视。随着山莓果实的药用有效成分研究的进一步深入，山莓果实的药用价值必将会得到更加充分的发现和利用。若对提取过程中其有效成分进行综合开发利用，因而对山莓进行综合深加工意义非凡，探索从山莓中同时提取木犀草素和山莓素，其意义相当远大。
技术实现要素：
针对山莓果实含有大量水溶性成分，在提取过程中由于破碎不彻底，造成细胞内活性成分未能充分释放，在提取废渣中残留较多，此类功能性成分并未得到充分利用，生产成本较高。
本发明采用的微生物菌种，木霉(trichodermasp.)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号分别为cgmccno.3.3002。
木霉发酵液的制备：按木霉菌培养方法进行液体培养即可。
本发明采用的技术方案包括：新鲜山莓果实经醇提、木霉发酵、分别用硅胶柱和大孔树脂吸附分离、洗脱、浓缩结晶制得木犀草素和山莓素纯品。
因此，本发明提供一种从山莓鲜果中提取木犀草素和山莓素的方法，具体步骤包括如下：
(1)将山莓果实匀浆，加入乙醇进行80～95℃回流提取30～60min，陶瓷膜过滤一次，得提取液和滤渣ⅰ，其中山莓果实重量kg与乙醇体积l比为1:2～4；
(2)将提取液在45～55℃减压进行浓缩至原有体积的1/20～1/30，得到浓缩液ⅰ，在0～5℃保存1～2h，陶瓷膜过滤一次，得滤液ⅱ和滤渣ⅱ；
(3)将滤渣ⅰ加入3～15％木霉发酵液，25～35℃保存2～4d，再加入滤液ⅱ，继续发酵10～20h，再加入乙醇，进行80～95℃回流提取30～60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液ⅲ，其中加入乙醇体积l与山莓果实重量kg比为2～3：1；
(4)滤液ⅲ在45～55℃减压进行浓缩至原有体积的1/20～1/30，得到浓缩液ⅲ，上硅胶柱吸附浓缩液，用三倍柱体积的石油醚进行冲洗，并用两倍至四倍柱体积的石油醚乙酸乙酯溶液(1：1)进行洗脱，得到洗脱液ⅰ；
(5)滤渣ⅱ加入乙醇溶解，上大孔树脂柱，用两倍至四倍柱体积的含有60～85％乙醇水溶液对大孔树脂进行洗脱，得到洗脱液ⅱ，并将洗脱液ⅱ进行45～55℃减压浓缩至原来体积的1/8～1/20，得浓缩液ⅱ，其中加入乙醇体积l与滤渣ⅱ重量kg比为0.5～4：1；
(6)将洗脱液ⅰ进行45～55℃减压浓缩至原来体积的1/10～1/15，静置过夜，过滤，干燥滤渣得山莓素，再重结晶得山莓素纯品；
(7)将浓缩液ⅱ放置在4～8℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为木犀草素粗品，再在4～8℃重结晶得木犀草素纯品。
上述所采用的大孔树脂为klfc-150、ab-8、lsa-20、s-9等。
在一个实施方案中，步骤(5)中所述乙醇溶液，是指60～85％乙醇水溶液，其中60％乙醇水溶液的配制方法为60ml无水乙醇加入40ml水混合制成。
在一个实施方案中，步骤(3)中所述3～15％木霉发酵液中％是指体积质量比，加入木霉发酵液体积l与山莓果实重量kg比。
在一个实施方案中，步骤(1)、(2)、(3)、(6)和(7)中所述过滤，是指采用0.2μm孔径大小的陶瓷膜过滤一次。
技术效果
1、本发明方法操作简单，大大提高了木犀草素和山莓素的产率，极大地降低了木犀草素和山莓素的生产成本，简化了其生产过程。
2、使用山莓作为提取原料，既大大提高了山莓的利用效率，又提高了山莓的附加值。
3、该法既避免了木犀草素的破坏和抑菌问题，又促进了山莓素的转化。
具休实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何
一个或类似实例。
实施例1
将100kg山莓果实匀浆，加入250l乙醇进行85℃回流提取50min，陶瓷膜过滤一次，得提取液和滤渣ⅰ；将提取液在50℃减压进行浓缩至10l，得到浓缩液ⅰ，在3℃保存2h，陶瓷膜过滤一次，得滤液ⅱ和1.34kg滤渣ⅱ。
将滤渣ⅰ加入10l木霉发酵液，30℃保存2d，再加入滤液ⅱ，继续发酵20h，再加入200l乙醇，进行85℃回流提取60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液ⅲ；滤液ⅲ在55℃减压进行浓缩至8l，得到浓缩液ⅲ，上硅胶柱吸附浓缩液，用25l石油醚进行冲洗，并用25l的石油醚乙酸乙酯溶液(1：1)进行洗脱，得到洗脱液ⅰ。
将洗脱液ⅰ进行55℃减压浓缩至2l，静置过夜，过滤，干燥滤渣得山莓素，再重结晶得216g山莓素纯品；滤渣ⅱ加入3l乙醇溶解，上大孔树脂柱，用10l的含有75％乙醇水溶液对ab-8大孔树脂进行洗脱，得到洗脱液ⅱ，并将洗脱液ⅱ进行45℃减压浓缩至1l，得浓缩液ⅱ；将浓缩液ⅱ放置在4℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为木犀草素粗品，再在4℃重结晶得328g木犀草素纯品。经hplc检测木犀草素纯度为98.45％，山莓素纯度为96.02％。
实施例2
将200kg山莓果实匀浆，加入600l乙醇进行80℃回流提取60min，陶瓷膜过滤一次，得提取液和滤渣ⅰ；将提取液在55℃减压进行浓缩至25l，得到浓缩液ⅰ，在2℃保存2h，陶瓷膜过滤一次，得滤液ⅱ和2.85kg滤渣ⅱ。
将滤渣ⅰ加入20l木霉发酵液，28℃保存4d，再加入滤液ⅱ，继续发酵15h，再加入500l乙醇，进行80℃回流提取60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液ⅲ；滤液ⅲ在55℃减压进行浓缩至20l，得到浓缩液ⅲ，上硅胶柱吸附浓缩液，用60l的石油醚进行冲洗，并用70l的石油醚乙酸乙酯溶液(1：1)进行洗脱，得到洗脱液ⅰ。
将洗脱液ⅰ进行45～55℃减压浓缩至6l，静置过夜，过滤，干燥滤渣得山莓素，再重结晶得562g山莓素纯品；滤渣ⅱ加入3.5l乙醇溶解，上s-9大孔树脂柱，用14l的含有75％乙醇水溶液对大孔树脂进行洗脱，得到洗脱液ⅱ，并将洗脱液ⅱ进行55℃减压浓缩至1l，得浓缩液ⅱ；将浓缩液ⅱ放置在4℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为木犀草素粗品，再在4℃重结晶得735g木犀草素纯品。经hplc检测木犀草素纯度为98.76％，山莓素纯度为96.36％。