一种蛋白激酶多肽抑制剂的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种蛋白酶多肽抑制剂。

背景技术：

mapks是一类广泛存在于从酵母到高等植物与动物的蛋白激酶，它们负责将特定的细胞外刺激信号传导至细胞核，介导细胞产生特定反应，因而在细胞信号传递过程中占有相当重要的地位。p38mapk是1993年由brewster等人在研究高渗环境对真菌的影响时发现的。以后又发现它也存在于哺乳动物的细胞内，也是mapks的亚类之一，其性质与jnk相似，同属应激激活的蛋白激酶。研究证明，p38mapk通路的激活剂与jnk通路相似。一些能够激活jnk的促炎因子(tnfα、il-1)、应激刺激(uv、h2o2、热休克、高渗与蛋白合成抑制剂)也可激活p38。此外，p38还可被脂多糖及g+细菌细胞壁成分所激活。激活p38的上游激酶包括mkk3，mkk4，mkk6以及mkk7，而p38下游效应蛋白包括mk2(mapkinase-activatedproteinkinase2,mapkapk2)、mk3、mnk1(mapkinaseinteractionproteinkinase)、prak(p38regulated/activatedproteinkinase)、ck2(caseinkinase2)以及核内转录因子atf2(activatingtranscriptionfactor-2)，atf1，sap1(srfaccessoryprotein1)，chop(growtharrestanddnadamageinduciblegene153,gadd153)，p53，stat1，c/ebpβ，mef2c(myocyteenhancefactor2c)以及mef2a等。因此，p38mapk广泛参与炎症反应、应激、发育、细胞生长与凋亡、细胞周期调控、缺血/再灌注损伤及心肌肥厚等生理、病理过程中的信号传导，从而成为重要的药物开发靶点。

目前已有的p38抑制剂分子多是一些小分子化合物，它们竞争性地结合于p38分子中的atp结合位点或其它重要活性位点，从而抑制激酶的活性。但是由于激酶活性位点的保守性较强，体内数量众多的激酶分子都有相似的活性位点，因而此类抑制剂缺乏专一性；很多研究表明，这些抑制剂与其它激酶都有不同程度的交叉抑制作用，以及药物脱靶效应；此外在动物实验中，也表现出一定的基因与肝脏毒性。所以，目前还未有适合临床治疗的p38抑制剂药物。

近年来，由于抗体药物的深入研发及广泛上市应用，生物药物成为药物研发的一个热门领域。而多肽药物作为生物药物的一个重要组成部分，由于其分子量适中(比小分子化合物大比蛋白质小)、生物活性高、毒副作用小而成为医药研发的重点。而随着多肽生产工艺的进步、结构修饰手段的完善以及制剂水平的提高，制约多肽药物成药性的瓶颈问题逐步得到解决，从而使获批上市的多肽药物逐年增加。以2012年fda的多肽药物数据为例，共有6个多肽药物获批上市，进入三期临床的多肽药物为14个，二期临床74个，一期临床40个。

技术实现要素：

针对上述p38mapk小分子抑制剂的缺陷，本发明提供一种能够阻断p38mapk蛋白与其上下游效应因子相互作用，并有效抑制p38mapk信号通路信号传导的多肽抑制剂pi-38。

根据本发明的一个方面，本发明提供一种多肽pi-38，所述多肽的氨基酸序列为如seqidno：1所示，具体为：sgrvmrgprsa。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽pi-38在制备治疗、预防、减轻和/或缓解p38mapk激酶相关疾病的药物中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽pi-38在制备抑制炎症反应的药物中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽pi-38在制备抑制肿瘤的药物中的应用。

所述肿瘤包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、子宫颈癌、结直肠癌、食管癌、肝细胞癌、淋巴癌、黑色素瘤、髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、脾癌。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽pi-38在制备治疗、预防、减轻和/或缓解类风湿性关节炎的药物中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包括活性成分多肽pi-38和药学上可接受的载体。

所述药物组合物包括但不限于注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂等。

所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明所述多肽pi-38作为活性成分时应为“有效量”的，所述“有效量”是指无毒性，但足够量的提供所需的作用的药物或药剂。在本发明的药物组合物或药剂盒中，一种成分或制剂单元的“有效量”是指该成分在和其他成分联合应用时有效提供所需效应的量。“有效量”会因受试者的不同而不同，依据年龄和个体的一般情况，特定的活性药物等等。因此，不可能总是指精确的“有效量”，然而，任何个体病例中合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员应用常规的实验方法来测定。

本发明所述多肽pi-38可以采用本领域技术人员已知的方法(例如固相合成方法)制备得到，以及可以采用本领域已知的分离纯化方法(例如高效液相色谱法)分离纯化。

本发明研究表明，所述多肽pi-38能在体外阻断p38mapk蛋白与其效应蛋白的相互作用，在体外特异性地抑制p38激酶活性。pi-38可以抑制细菌内毒素lps刺激引起的人外周血单核细胞肿瘤坏死因子tnfα及白介素1β的分泌。pi-38还可以特异性抑制细菌内毒素lps刺激的人肿瘤细胞中p38mapk对效应分子的磷酸化作用。动物实验也表明，pi-38可以抑制炎症反应。

附图说明

图1为多肽pi-38质谱鉴定图；

图2为多肽pi-38对p38mapk蛋白与其效应蛋白相互作用的阻断效果；

图3为多肽pi-38对p38mapk蛋白激酶活性抑制作用；

图4为多肽pi-38对肿瘤细胞内p38的磷酸化的抑制作用；

图5为多肽pi-38对人外周血单核细胞tnfα及il-1β分泌的抑制作用；

图6为多肽pi-38对炎性因子分泌的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1多肽pi-38的合成与纯化

1.按照fmoc固相多肽合成法合成多肽pi-38，合成步骤如下所示：

1.1为保证多肽c-端为-conh2结构，选用rinkamide树脂类作为高分子固相载体。

1.2去fmoc保护基团：

1.2.1将所需高分子固相载体放入合成柱中，加入有机溶剂dmf(二甲基甲酰胺)浸泡10分钟后排放；通入20％的哌啶/dmf溶液盖过树脂表面，通n2反应10分钟后排放；重复一遍通入20％哌啶/dmf、通n2反应10分钟后排放。

1.2.2n2保护下，通入dmf溶剂5遍，以彻底洗涤上述树脂。

1.3缩合反应:

氨基酸活化：称取所需摩尔量3倍的fmoc-保护氨基酸，溶解于dmf溶剂中，配制成其饱和溶液，加入等摩尔量1-羟基苯并三唑(hobt)及二异丙基碳二亚胺(dic)，如果需要再加入dmf直至完全溶解，形成氨基酸活化液。

在n2环境下，氨基酸活化液通入合成柱中，与其中高分子树脂充分接触，使高分子树脂上活性基团与活化的氨基酸发生(脱水)缩合反应生成肽键；室温下缩合反应时间为30分钟至1小时；反应后排放废液；

1.4按照多肽序列，重复步骤1.2至1.3操作直至完成整个肽链的合成。

1.5裂解及侧链保护基团的移除：

1.5.1配制三氟乙酸(tfa)混合裂解液“k”，配方如下：

三氟乙酸(tfa)(82.5％v/v)

苯酚(phenol)(5％v/v)

水(water)(5％v/v)

苯基甲基硫醚(thioanisole)(5％v/v)

1,2-乙二硫醇(1，2-ethanedithiol)(2.5％v/v)

1.5.2实施步骤：

1.5.2.1按照步骤1.2所叙，先除去与固相载体相连的多肽n-端的fmoc保护基团，用二氯甲烷洗去残余dmf，干燥，转入一干燥玻璃容器中；

1.5.2.2导入上述tfa裂解液“k”(30ml/克树脂)，在室温下温和搅拌反应4小时。

1.5.2.3反应完毕后，将树脂滤出，裂解液直接进入事先(-20℃)冷却的甲基异丁基醚中(30ml:5mlv/v)沉淀；

1.5.2.4高速离心(4000rmp，4℃)5分钟，弃去清液，用95％tfa溶解瓶底沉淀，再倒入冷却的甲基异丁基醚中(30ml:5mlv/v)沉淀；

1.5.2.5弃去清液，通入n2至甲基异丁基醚基本挥发，用少量的去离子水溶解沉淀物，经-80℃冷冻，在冷冻干燥机上干燥后，得到粉状微黄色粗肽。

2.多肽的分析和纯化：

由岛津lc-10atvp型输液泵、岛津dgu-14a型脱气机、岛津spd-10a型紫外检测器、rheodyne7725i进样阀、phenomenexnucleosilc18色谱柱(250×4.6mmi.d.)、wdl-95型色谱工作站构成hplc分离系统。样品进样后以1.0ml/min的流速0-30分钟内，含0.1％三氟乙酸的5％乙腈水溶液至含0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液线性梯度淋洗，uv220nm检测的色谱条件，进行分离监测。色谱峰流出液收集于离心管留待随后的质谱分析。

质谱所用仪器为brukerdaltonics公司biflex型maldi-tof质谱仪，氮激光器，激光波长337nm，采用延时(引出delayedextraction)和反射(reflection)的工作方式，加速电压19.5kv，反射电压20kv，延时引出电压14.5kv，延时时间为50～200ns，正离子检测。将色谱峰收集液与适量的基质溶液混合后取约1微升溶液，滴加在样品靶上，待溶剂挥发样品结晶后，送入质谱仪进行质谱分析，累加30次单次扫描信号得到质谱图(见图1)。

多肽pi-38经hplc纯度鉴定，其纯度大于98％，含11个氨基酸(sgrvmrgprsa)，分子量1173da。

上述多肽由宁波康贝生化有限公司合成。

实施例2pi-38对p38mapk蛋白与其效应蛋白相互作用的阻断效果。

使用spot技术，将与p38mapk蛋白有相互作用的mkk3b及mef2a蛋白制备成多肽阵列芯片，用多肽阻断阵列上蛋白与p38重组蛋白的互做反应。

材料：多肽阵列实验室自制，氨基酸购自吉尔生化，p38重组蛋白购自genetex公司，人p38蛋白抗体购自cst，hrp标记抗人p38蛋白抗体的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，化学发光反应液购自thermo公司

从-20度冰箱取出的多肽芯片，置于平皿中使用无水乙醇震荡洗涤3次，每次5分钟。之后多肽芯片膜放入平皿中，使用tbs-t溶液震荡洗涤3次，每次10分钟。随后将多肽芯片膜放入平皿中，加入封闭液(5％脱脂奶粉溶液)，室温震荡封闭4小时后，使用tbs-t溶液震荡洗涤膜一次，5分钟。用封闭液(5％脱脂奶粉溶液)稀释p38蛋白溶液为终浓度为0.3nm的反应溶液，使用终浓度为0.9nm的多肽与p38蛋白反应液共同孵育30分钟，将多肽芯片膜分别与含多肽或不含多肽的p38蛋白反应溶液室温震荡孵育2小时后，使用tbs-t溶液震荡洗膜3次，每次10分钟。用上述封闭液稀释一抗(人p38蛋白抗体)溶液，稀释比例1:500，将多肽芯片膜置于反应液中震荡孵育2小时后，使用tbs-t溶液震荡洗膜3次，每次15分钟。之后用封闭液稀释hrp标记的二抗溶液，通常稀释比例为1:5000(可根据抗体说明书推荐使用稀释度调整)，将多肽芯片膜置于反应液中震荡孵育2小时后，使用tbs-t溶液震荡洗膜3次，每次15分钟。随后弃去多肽芯片膜上多余缓冲溶液，在膜上滴加化学发光反应液，反应液完全覆盖膜片表面后充分反应2分钟，保持膜片湿润。将膜片放入化学发光检测仪中扫描膜片上发光斑点，保存扫描图片，见图2。

图中方框选出的多肽点为多肽阻断p38蛋白与阵列多肽互做的位点，从图中可以看出多肽分别阻断p38与mkk3b及mef2a的互做，表明多肽在分子水平上能够阻断重组p38蛋白与效应蛋白的互做。

实施例3pi-38对p38mapk蛋白激酶活性抑制作用

p38激酶测定/抑制剂筛选试剂盒是检测p38蛋白活性的非定量酶学检测方法。试剂盒中检测用的酶标板是预包被有相当于atf2的底物，atf2上含有可被p38有效磷酸化的thr氨基酸残基，检测抗体能特异的检测atf2被p38激酶磷酸化的thr。若加入活性多肽抑制剂，有抑制作用的活性多肽能够抑制p38的激酶活性，则特异抗体无法识别到atf2蛋白上的磷酸化thr。

材料：p38激酶测定/抑制剂筛选试剂盒购自abnova公司，小分子抑制剂sb202190购自mce公司，其它试剂均为试剂盒自带。

从试剂盒提供的酶标板上移取适当数量的酶标板孔置于冰上待用。分别在不同的板孔中添加10ul纯化的p38重组蛋白(终浓度10munits/孔)，10ul阳性对照sb202190(终浓度20um)，以及10ul梯度稀释的多肽样品(终浓度分别为20nm，200nm，2μm，20μm，200μm)，随后向每孔中添加90ul的kinasereactionbuffer，盖好盖子30℃孵育60min。用washbuffer清洗每一个板孔5次，倒掉剩余washbuffer，按标准拍板方法轻轻拍板去掉剩余washbuffer，或者吸取剩余液体。每孔分别加入100ulanti-phospho-atf2thr71多抗(ppt-09)，盖上酶标板盖子室温放置30min。再次洗板(方法同上)后，每孔分别加入100ulhrp标记的anti-rabbitigg，盖上酶标板盖子室温放置30min，倒掉不结合的液体部分。再次洗板(方法同上)，随后每孔分别加入100ulsubstratereagent，盖上酶标板盖子室温放置5-15min。最后向每孔中加入100ul终止液，将酶标板放入酶标仪，在波长450nm处读数。

实验结果如图3和表1示，结果表明，加入不同浓度的多肽后，酶标板吸光度随着多肽浓度的升高逐步降低，表明p38激酶活性被多肽所抑制。

表1不同浓度多肽对p38mapk蛋白激酶活性抑制作用

实施例4pi-38特异性抑制肿瘤细胞内p38的磷酸化激活

材料：人乳腺癌细胞(mcf-7)购自atcc；细胞培养液rpmi1640购自hyclone公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；anisomycin购自mce公司；pvdf膜购自pall公司；磷酸化atf2，磷酸化hsp27，磷酸化p38抗体均购自santacruz公司；tublin抗体购自cst公司。

将mcf-7细胞在含有10％fbs的rpmi1640细胞培养液中于37℃，5％co2培养至80％汇片。将培养好的细胞按5×105细胞/孔，移至装有0.2ml新鲜的含有10％fbs的rpmi1640细胞培养液的24孔细胞板中培养一天至80％汇片。然后更换新鲜的含有10％fbs的rpmi1640细胞培养液，分别加入不同浓度的多肽抑制剂(5μm、10μm或25μm)处理半小时后，加入10μg/ml的anisomycin刺激细胞30分钟。弃去培养液上清，收集细胞总蛋白，进行12％sds-page电泳分离并电转至pvdf膜。分别使用磷酸化atf2，磷酸化hsp27，磷酸化p38抗体及tublin抗体(对照)进行westernblot，检测相应的p38效应蛋白磷酸化水平。

结果如图4所示，表明多肽可以剂量依赖地抑制肿瘤细胞mcf-7内p38效应蛋白的磷酸化。

实施例5pi-38抑制人外周血单核细胞tnfα及il-1β分泌实验

材料：健康人血采自实验室工作人员，脂多糖(lipopolysaccharide，lps来源于e.coli055：b5)购自sigma公司，细胞培养液dmem购自hyclone公司，缓冲液dpbs及pbs购自北京索莱宝生物科技有限公司，人il-1β，tnf-α的elisa试剂盒购自北京百智生物科技有限公司。

从健康人的肝素抗凝全血中分离获得pbmcs(外周血淋巴细胞)。ph7.2浓度0.01m的杜氏磷酸缓冲液(dpbs)清洗细胞三次后，细胞重悬于含5％无内毒素胎牛血清和抗生素(penicillin–streptomycin)的dmem培养基中，随后以2.5×10⁵个细胞/孔，将获得的pbmcs置于96孔细胞培养板中。ph7.2浓度0.01m的pbs配制的多肽抑制剂以不同的终浓度(0.0001-25μm)加入细胞中，与细胞共孵育1小时后，加入终浓度22ng/ml的lps刺激细胞18小时。收集培养24小时后的细胞上清，elisa试剂盒检测上清中细胞因子il-1β，tnf-a的浓度。

结果见图5和表2，从图中可以看出，随着多肽抑制剂浓度的提高，il-1β，tnf-a的分泌与对照比较都成下降趋势，表明多肽抑制剂有效抑制单核细胞中p38的活性。

表2多肽对人外周血单核细胞tnfα及il-1β分泌的抑制作用

实施例6pi-38对小鼠急性炎症模型中炎性因子分泌的抑制作用

50只雄性昆明种小鼠(17-22g)(中国协和动物中心)随机分为5组，每组10只。先分别给药预处理：阳性药对照组给予消炎痛(中国河北永丰药业)灌胃给药(25mg/kg)、空白对照组给予腹腔注射等体积生理盐水、实验组分别给予腹腔注射活性多肽(pi38)低剂量(5mg/kg)、腹腔注射活性多肽中剂量(10mg/kg)和腹腔注射活性多肽(pi38)高剂量(20mg/kg)。半小时后分别将小鼠右耳前后两面各涂上二甲苯致炎剂20μl/耳，左耳为空白对照。2小时后，将小鼠断颈处死，沿耳廓基线剪下双耳，用8mm角膜环钻分别在同一部位打下耳片，用电子天平称重。用右耳耳片重量减去左耳耳片重量，计算出各组肿胀度(mg)，肿胀率(％)＝(空白对照组肿胀度-给药组肿胀度)/空白对照组肿胀度。

结果见图6和表3，从图中可以看出，多肽能够在动物炎症模型中抑制炎性因子的释放，表明多肽具有抗炎药物活性。

表3多肽对小鼠急性炎症模型中炎性因子分泌的抑制作用

序列表

<110>北京博肽未名生物技术有限公司

<120>一种蛋白激酶多肽抑制剂

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

serglyargvalmetargglyproargserala11