本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种循环肿瘤dna检测方法，探针及传感器。
背景技术：
肿瘤是严重危害人类生命健康的一类慢性疾病，随着肿瘤分子生物学的发展，临床上已达到对肿瘤进行基因水平上的诊断及靶向治疗。循环肿瘤dna(circulatingtumordna，ctdna)是一种新型的肿瘤生物标志物，它是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的dna。近年来不断有报道，尽管ctdna在健康人的血液中含量极低，但当机体处于特殊疾病状态(如肿瘤、炎症疾病和组织创伤等)时，其含量明显上升，且在肿瘤患者中游离dna还存在dna完整性、基因突变、dna超甲基化及染色体基因重排等肿瘤特异性的改变，由于检测血液样本具有容易获取、快速简便且无创伤等优点，因此，检测肿瘤患者血中ctdna可视为一种“液体活检”。
现有的ctdna的新检测方法不断出现，即便它们各具检测优势，但仍存在一系列问题，如：检测耗时长、灵敏度及选择性低，只能检测已知突变位点，通量低等。由于ctdna呈高度碎片状，在外周血中的浓度低、易降解，使这一标准化程序的建立十分困难。
技术实现要素：
本发明提供一种循环肿瘤dna检测方法，探针及传感器，解决现有技术中循环肿瘤dna检测灵敏度低，特异性差，耗时长，操作复杂的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种循环肿瘤dna检测探针，包括：金纳米粒子-适配体复合物及包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物。
一种循环肿瘤dna检测传感器，包括：丝网印刷电极以及设置在其上的金纳米粒子-适配体复合物与包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物。
进一步地，所述金纳米粒子-适配体复合物的制备方法包括：
按照2∶1的体积比，依次将金纳米粒子aunps和适配体aptamer混合均匀，室温避光静置；
加入等量的pbs溶液，室温避光静置；
加入nacl溶液，使溶液中nacl的浓度调节至0.05m，随后室温静中将nacl的浓度调节至0.1m；
在12,000rpm条件下离心30min，弃去上层清液，用0.1m的nacl和pbs缓冲液润洗下层固体，储存在0.02％(v/v)tween20水溶液中。
进一步地，包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物的制备方法包括：
将包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白加入至含有edc和nhs的mes缓冲溶液中并超声30分钟；
所得混合溶液以不低于10000rpm离心5分钟，弃去上层清液；
向离心后得到的沉淀中加入5-甲基胞嘧啶单克隆抗体(1mg/ml)，室温下孵化3小时；
混合液在10,000rpm条件下离心10min，弃去上层清液，用pbs润洗下层固体，用pbs缓冲溶液储存4℃冰箱中备用。
一种循环肿瘤dna检测方法，包括：
将待检样本与金纳米粒子-适配体复合物aptamer-aunps混合；
再将包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物mab-lpa加入到上述混合物中；
用微分脉冲伏安法进行电化学检测，在扫速为50mv/s，电位扫描范围-0.9～-0.3v条件下检测包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白lpa的信号，测定样品中ctdna(pik3ca-e542k)的含量。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本申请实施例中提供的循环肿瘤dna检测方法，采用金纳米粒子-适配体复合物与包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物配合电化学检测方法，实现高效，简便，高特异性以及高灵敏度的循环肿瘤dna定量检测。具体来说，通过适配体特异性的捕获循环肿瘤dna，并通过金纳米粒子实现电信号传递；而后通过抗体，确切地说是5-甲基胞嘧啶单克隆抗体，在所述捕获的循环肿瘤dna中，高精度筛选出目标循环肿瘤dna，大幅提升检测的特异性，提升检测的可靠性，排除各类干扰dna对检测的影响；同时，大幅简化检测步骤。同时，在金纳米粒子的基础上，通过包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白lpa实现电信号放大，从而大幅提升检测灵敏度，提升电化学检测的效率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的微分脉冲伏安法测定不同浓度的循环肿瘤dna的峰电流曲线和校正曲线。
具体实施方式
本申请实施例通过提供一种循环肿瘤dna检测方法，探针及传感器，解决现有技术中循环肿瘤dna检测灵敏度低，特异性差，耗时长，操作复杂的技术问题。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细说明，应当理解本发明实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互组合。
一种循环肿瘤dna检测探针，其特征在于，包括：金纳米粒子-适配体复合物及包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物。
适配体用于在带检测的样本中筛选并捕获待检测循环肿瘤dna，因此适配体根据不同的检测目标而定。初步捕获大量的可与适配体碱基配对的dna，当然不可避免的是，初步捕获的循环肿瘤dna中不可避免的包含有干扰dna。
通过抗体的选择，能够进一步在初步捕获的循环肿瘤dna中，进一步筛选，从而排除大量的干扰dna，使得检测的可靠性大幅提升。
本实施例中，针对循环肿瘤dna(pik3cae542k)有良好的选择性，采用的抗体选用5-甲基胞嘧啶单克隆抗体实现高特异性检测，从而进一步提升检测可靠性。
不可否认的根据实际需要，上述原理还可以选用不同的抗体选择。
通过包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白lpa与抗体复合，能够在金纳米粒子导电性的配合下，实现电化学检测电信号的放大，使得循环肿瘤dna的检测灵敏度大幅提升。
值得说明的是，上述测量的介质简单，操作简便高效。检测周期远远小于现有技术。
本实施例还基于上述探针提出一种检测传感器方案。
一种循环肿瘤dna检测传感器，包括：丝网印刷电极以及设置在其上的金纳米粒子-适配体复合物与包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物。
探针的工作原理上文已记载，不再赘述。通过lpa放大的电信号通过丝网印刷电极连接电化学工作站实现定量检测。从而大幅提升检测的灵敏度和可靠性。
实际测量中，在丝网印刷电极上，将金纳米粒子-适配体复合物与样本混合，待反应结束完成捕获后，再滴加包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物实现进一步特异性捕获，排除干扰，实现高灵敏度，高可靠性检测。
本实施例还公开了探针的制备方法。
首先依次将200μl的aunps和10μlaptamer加入到1.5ml的ep管中，轻轻吹打至混合均匀，室温避光静置24h。然后加入等量的pbs(10m，ph7.0)溶液，室温避光静置6h。常温避光静置6h后加入1mnacl溶液，使溶液中nacl的浓度调节至0.05m，随后室温静置14h中将nacl的浓度调节至0.1m。待反应完后，混合液在12,000rpm条件下离心30min，弃去上层清液，用500μl0.1mnacl和500μlpbs(10mm,ph7.4)润洗下层固体，重复3次，储存在0.02％(v/v)tween20水溶液中。
包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物的制备方法包括：
首先，将包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白加入至1ml含有400mmedc和100mmnhs的mes缓冲溶液(ph5.2)中并超声30分钟，所得混合溶液以10,000rpm离心5分钟，弃去上层清液；然后向离心后得到的沉淀中加入500μlanti-mab(1mg/ml)，室温下孵化3小时，待反应完后，混合液在10,000rpm条件下离心10min，弃去上层清液，用pbs(50mm,ph7.4)润洗下层固体，重复3次，用pbs(50mm,ph7.4)储存4℃冰箱中备用。
实施例还提供一种循环肿瘤dna检测方法。
一种循环肿瘤dna检测方法，其特征在于，包括：
将待检样本与金纳米粒子-适配体复合物aptamer-aunps混合；
再将包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物mab-lpa加入到上述混合物中；
用微分脉冲伏安法进行电化学检测，在扫速为50mv/s，电位扫描范围-0.9～-0.3v条件下检测包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白lpa的信号，测定样品中循环肿瘤dna，即pik3cae542k)的含量。
当然也可以在检测过程中，进行金纳米粒子-适配体复合物和包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物制备。一般递交顺序是，适配体混合纳米金粒子，滴加待检样本，再滴上包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物。
参见图1，需要说明的是，本实施例中检测得到的循环肿瘤dna的定量信息通过电流幅值的形式体现。
因此，需要明确循环肿瘤dna的浓度和电流幅值对应关系。
本实施例中，通过将一系列标准浓度的循环肿瘤dna溶液滴加到丝网印刷电极上进行检测，从而得到不同浓度的循环肿瘤dna溶液对应的电流信号。
然后在实际测量时，将测得的电流信号得到对应的循环肿瘤dna的浓度信息。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本申请实施例中提供的循环肿瘤dna检测方法，采用金纳米粒子-适配体复合物与包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物配合电化学检测方法，实现高效，简便，高特异性以及高灵敏度的循环肿瘤dna定量检测。具体来说，通过适配体特异性的捕获循环肿瘤dna，并通过金纳米粒子实现电信号传递；而后通过抗体，确切地说是5-甲基胞嘧啶单克隆抗体，在所述捕获的循环肿瘤dna中，高精度筛选出目标循环肿瘤dna，大幅提升检测的特异性，提升检测的可靠性，排除各类干扰dna对检测的影响；同时，大幅简化检测步骤。同时，在金纳米粒子的基础上，通过包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白(lpa)实现电信号放大，从而大幅提升检测灵敏度，提升电化学检测的效率。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。