共价连接的抗原-抗体缀合物的制作方法

本申请是中国专利申请201380034794.7的分案申请，原申请的申请日是2013年7月4日，发明名称是“共价连接的抗原-抗体缀合物”。本文中报道了包含抗原和抗体的复合物，其中该复合物的组分通过单键彼此共价连接。还报道了用于产生该共价复合物的方法及其用途。发明背景多肽治疗性应用的主要瓶颈是它们的溶解度、体内稳定性有限、血清半寿期短和从血流快速清除。报道了不同方案以解决这些缺点。然而，这些技术均未提供在不遭遇免疫原性风险或生物学活性潜在丧失的情况下能够调节药物代谢动力学(pk)的稳健和通用平台。一个改善治疗性多肽的pk/稳定性和生物物理特性的方法是使它们与使多肽稳定化、使其维持溶解状态并延长其半寿期的实体融合。这类实体的例子是人血清白蛋白或人免疫球蛋白fc区。这种方法适用于由天然存在的氨基酸残基组成并且在不丧失其生物学活性的情况下在其c端或n端耐受修饰的许多线形多肽。呈环状、u型、含有非天然氨基酸残基或额外修饰的多肽不能作为融合多肽重组产生。然而，这类多肽可能是治疗性应用所需的选择，因为在蛋白酶稳定性、活性和特异性方面而言，它们经常优于‘正规的’线形肽。一个改善治疗性多肽的pk/稳定性和生物物理特性的方法(其也可以适用于呈环状、u型或含有非天然结构物的那些多肽)是与聚合物化学或酶促缀合，例如通过peg化或hes化(hesylation)。但是，这类修饰经常导致多肽的生物学活性显著降低并且在某些情况下可能是安全问题或毒性问题的原因。用于稳定治疗性多肽或调节其pk的大多数现有化学偶联技术的主要缺点是它们的复杂性。除了化学偶联步骤外，这些方法还在许多情况下产生多肽衍生物的混合物，所述多肽衍生物以不确定的化学计量和/或在不确定的位置与调节pk的实体连接。另外，目前使用的多肽修饰技术经常导致治疗性多肽的生物学活性剧烈降低或甚至完全丧失。此外，难以预测化学缀合物的药理学特性和/或可能的降解途径。us5,804,371报告了半抗原标记的肽及其在免疫检测方法中的用途。洋地黄毒苷标记的肽(缓激肽)及其对发炎组织中缓激肽的化学发光酶免疫测定法的适用性由decariea.等人(peptides15(1994)511-518)报道。在wo2004/065569中报道了多功能抗体。发明概述已经发现通过将半抗原化的化合物共价偶联至抗半抗原抗体，可以实现该化合物的稳定化和pk性能改善。如本文中报道的一个方面是一种含抗原和与所述抗原特异性结合的抗体的缀合物，其特征在于该抗原和该抗体的cdr2中的氨基酸残基之间的共价键，其中根据kabat确定cdr2。已经发现一旦用包含用于该抗原和该抗体的cdr2中的氨基酸残基之间形成共价键的功能残基的通用接头衍生化，则任何抗原可以用于如本文中报道的缀合物和方法中。官能团在通用接头中的位置具有下述优点：不必需再工程化在抗体的cdr2中的官能团的合成及其位置。如本文中报道的一个方面是一种含半抗原化化合物和与所述半抗原化化合物的半抗原特异性结合的抗体(抗半抗原抗体)的缀合物，其特征在于该半抗原化化合物和该抗体的cdr2中的氨基酸残基之间的共价键，其中根据kabat确定cdr2。在全部方面的一个实施方案中，cdr2是重链cdr2。在全部方面的一个实施方案中，半抗原化化合物包含半抗原、任选的接头和有效载荷。在全部方面的一个实施方案中，共价键在半抗原化化合物的接头和抗体的cdr2中的氨基酸残基之间。在全部方面的一个实施方案中，共价键在半抗原化化合物中的官能团和抗体的cdr2中的氨基酸残基之间。在一个实施方案中，官能团处于半抗原化化合物的接头中。在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，共价键在抗体的重链cdr2中的半胱氨酸残基和抗原中的官能团或半抗原化化合物中的官能团之间。在一个实施方案中，根据kabat的重链可变域编号法，抗体的重链cdr2中的半胱氨酸残基在第52位置、或第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第52d位置或第53位置处。在一个实施方案中，根据kabat的重链可变域编号法，抗体的重链cdr2中的半胱氨酸残基在第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第53位置处。在一个实施方案中，根据kabat的重链可变域编号法，抗体的重链cdr2中的半胱氨酸残基在第52b位置或在第53位置处。在全部方面的一个实施方案中，共价键是二硫键。在全部方面的一个实施方案中，该抗体是包含针对第一抗原或第一半抗原的第一结合特异性和针对第二抗原或第二半抗原的第二结合特异性的双特异性抗体，其中第一抗原/半抗原与第二抗原/半抗原不同。在一个实施方案中，该抗体包含针对第一半抗原的第一结合特异性和针对第二半抗原的第二结合特异性。在一个实施方案中，抗体包含针对半抗原的第一结合特异性和针对(非半抗原的)抗原的第二结合特异性。在一个实施方案中，该(非半抗原的)抗原是细胞表面抗原。在一个实施方案中，细胞表面抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，双特异性抗体是全长抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体的一条重链包含穴突变(holemutation)并且相应的另一条链包含隆突突变(knobmutation)。在全部方面的一个实施方案中，有效载荷选自结合部分、标记部分和生物学活性部分。在全部方面的一个实施方案中，该抗体是全长抗体。在全部方面的一个实施方案中，该抗体是人源化或人抗体。在一个实施方案中，该抗体的恒定区是igg1亚类或igg4亚类。在一个实施方案中，抗体具有igg1亚类的恒定区，其中根据kabat的eu索引编号，所述恒定区在第234和235位置处具有丙氨酸并且在第329位置处具有甘氨酸。在一个实施方案中，抗体具有igg4类的恒定区，其中根据kabat的eu索引编号，所述恒定区具有在第228位置处的脯氨酸、在第235位置处的谷氨酸和在第329位置处的甘氨酸。在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，该抗体是抗体的片段。在一个实施方案中，片段是fab或(fab)2。在全部方面的一个实施方案中，缀合物确切地包含一个共价键/重链cdr2。在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，该抗原或半抗原化化合物包含反应基团，所述反应基团可以与抗体的cdr2中的半胱氨酸残基的巯基形成共价键。在一个实施方案中，反应基团是巯基、或马来酰亚胺或卤代乙酰基。在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，共价键是二硫键并且且它在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。在全部方面的一个实施方案中，缀合物包含治疗部分或可检测部分。在一个实施方案中，治疗部分或可检测部分共价缀合至抗原或半抗原。在一个实施方案中，抗原或半抗原缀合至由5至60个氨基酸残基组成的多肽。在一个实施方案中，该多肽包含10至50个氨基酸残基。在一个实施方案中，该多肽包含12至40个氨基酸残基。在一个实施方案中，该多肽包含12至30个氨基酸残基。在一个实施方案中，抗原或半抗原缀合至可检测标记物。在一个实施方案中，抗原或半抗原缀合至多肽，或缀合至可检测标记物，或经接头缀合至有效载荷。在一个实施方案中，接头是非肽接头。如本文中报道的一个方面是在轻链和/或重链具有在cdr2中的半胱氨酸残基的抗体，其中根据kabat确定cdr。在一个实施方案中，半胱氨酸残基处于重链cdr2中。在一个实施方案中，根据kabat的重链可变域编号法，抗体的重链cdr2中的半胱氨酸残基在第52位置、或第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第52d位置或第53位置处。在一个实施方案中，根据kabat的重链可变域编号法，抗体的重链cdr2中的半胱氨酸残基在第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第53位置处。在一个实施方案中，根据kabat的重链可变域编号法，抗体的重链cdr2中的半胱氨酸残基在第52b位置或在第53位置处。在一个实施方案中，抗体确切地在一个重链可变域中第52b位置处或第53位置处具有半胱氨酸残基。在一个实施方案中，半抗原是生物素、或茶碱、或洋地黄毒苷、或碳硼烷或荧光素。在一个实施方案中，抗体是人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗体是全长抗体、或fab、或scfv、或与fc区缀合的scfv。在一个实施方案中，半胱氨酸与孤立的半胱氨酸残基或孤立的同型半胱氨酸残基形成二硫键。如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的缀合物和细胞毒性剂的免疫缀合物。如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的缀合物和和可药用载体的药物制剂。使用如本文中报道的缀合物作为药物。使用如本文中报道的缀合物治疗癌症。使用如本文中报道的缀合物治疗糖尿病。使用如本文中报道的缀合物治疗肥胖症。使用如本文中报道的缀合物治疗炎性疾病。使用如本文中报道的缀合物治疗代谢性疾病。使用如本文中报道的缀合物治疗病毒病。如本文中报道的一个方面是如本文中报道的缀合物在制造药物中的用途。如本文中报道的一个方面是如本文中报道的缀合物作为诊断剂的用途。如本文中报道的一个方面是如本文中报道的包含治疗性多肽的缀合物增加所述治疗性多肽的稳定性的用途。如本文中报道的一个方面是如本文中报道的包含治疗性多肽的缀合物增加所述治疗性多肽的活性的用途。如本文中报道的一个方面是如本文中报道的包含治疗性多肽的缀合物增加所述治疗性多肽的体内半寿期的用途。如本文中报道的一个方面是如本文中报道的缀合物在治疗疾病中的用途。如本文中报道的一个方面是治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的缀合物。如本文中报道的一个方面是治疗个体中疾病的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的缀合物。在一个实施方案中，该疾病是癌症。在一个实施方案中，该疾病是糖尿病。在一个实施方案中，该疾病是肥胖症。如本文中报道的一个方面是产生如本文中报道的缀合物的方法，所述方法包括组合包含第一反应基团的抗体和具有第二反应基团的抗原，其中携带第一反应基团的氨基酸残基的α碳原子与接头同其融合的抗原的原子相距约10至11埃。如本文中报道的一个方面是产生如本文中报道的缀合物的方法，所述方法包括步骤-在溶液中将特异性结合至半抗原并且在cdr2中的一个氨基酸残基处包含反应基团的抗体与包含反应基团的半抗原化化合物组合，其中半抗原化化合物包含有效载荷，如由5至60个氨基酸组成的肽或可检测标记物，和-从溶液回收缀合物。如本文中报道的一个方面是产生抗体的方法，所述抗体用于形成如本文中报道的缀合物，所述方法包括步骤-培育包含编码该抗体的核酸的细胞，和-从细胞或培养基回收抗体，其中在该抗体中，将重链cdr2中的残基突变成半胱氨酸，其中在抗体和其抗原或半抗原化化合物的非共价复合物的x射线结构中，抗体cdr2中的氨基酸残基的α-原子和与接头连接的半抗原的原子或二者间意在形成共价键的抗原原子之间具有10至11埃距离。如本文中报道的一个方面是用于鉴定抗体cdr2中位置的方法，其中所述位置可以突变成用于抗体cdr2中的残基和结合的抗原或半抗原化化合物之间形成共价键的半胱氨酸，所述方法包括步骤-提供抗体和抗原或半抗原化化合物的非共价复合物的晶体结构，其中抗原或半抗原化化合物包含接头序列，和-在抗体的cdr2中和在接头序列中鉴定在抗体cdr2中的氨基酸残基的α-原子和与接头融合的抗原中的原子之间具有10至11埃距离的氨基酸残基，其中，鉴定的位置是抗体cdr2中这样的位置，所述位置可以突变成用于抗体cdr2中的残基和结合的抗原或半抗原化化合物之间形成共价键的半胱氨酸。如本文中报道的一个方面是用于靶向递送半抗原化化合物至靶细胞的双特异性抗体，其中双特异性抗体包含与半抗原化化合物特异性结合的第一结合位点和与细胞的细胞表面标记物特异性结合的第二结合特异性。附图描述图1：用于肽的洋地黄毒苷化(与洋地黄毒苷缀合)的流程(图1a)。洋地黄毒苷化标记物(荧光团dig-cy5；图1b)的例子和洋地黄毒苷化多肽(pyy-衍生物(dig-pyy)；图1c)的例子。图2：单特异性二价抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-cy5缀合物的复合物(图2a)以及单特异性二价抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-多肽缀合物的复合物(图2b)的示意图。双特异性四价抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-多肽缀合物的复合物(图2c)的示意图。图3:包含抗洋地黄毒苷抗体和与肽缀合的洋地黄毒苷(dig-pyy)的复合物的大小排阻层析图(在280nm记录)，其显示具有确定大小的复合物的单峰。图4:a：抗洋地黄毒苷fab(左)的结构模型，显示(圈定的)洋地黄毒苷在vh区和vl区的cdr形成的深口袋中被捕获。b：抗抗生物素fab(右)的结构模型，显示(圈定的)生物胞素酰胺(biocytinamid)在vh区和vl区的cdr形成的深口袋中被捕获。图5：引入和未引入vh53c突变的重组人源化抗生物素抗体的结合的比较。使用biacoret100或biacore3000仪通过表面等离子体共振(spr)技术分析结合特性。a)人源化抗生物素抗体。生物素酰化sirna与人源化抗生物素抗体的结合，kd＝624pm；b)cys53突变的人源化抗生物素抗体。生物素酰化sirna的结合，kd＝643pm；sirna浓度：0.14、0.41、1.23、3.70、11.1、33.3和100nm；抗生物素抗体浓度：2nm；传感芯片cm3；抗体通过抗人iggfc抗体的结合图6：在半抗原中以及在抗体中在适宜位置引入sh官能团允许抗体和半抗原彼此间形成共价键，产生缀合物。图7：sds-page自我荧光条带样式的示意图(在sds-page凝胶不进一步染色的情况下)：a：如果在还原性或非还原性条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间均不形成共价键，则可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自我荧光条带。b：如果在非还原性条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间形成共价键，则可以在抗体和半抗原-荧光团缀合物的合并分子量处检测到一条自我荧光条带。在还原条件下，切割抗体和半抗原-荧光团缀合物(半抗原化化合物)的缀合物中的二硫键并且可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自我荧光条带。图8：在氧化还原活性剂：氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，gssg)和还原剂(二硫赤藓糖醇，dte)存在下结合半抗原的cys突变的抗体与半抗原-cys-荧光标记缀合物(半抗原化化合物)形成缀合物：在sdspage分析中通过荧光信号检测到确定位置处的抗体复合和后续的共价键合。非还原性(上图)和还原性(下图)sds-page分析如实施例11中所述进行。在非还原条件下，抗体共价连接的半抗原可检测为适宜位置处更大尺寸的蛋白质结合信号。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。左：荧光图像右：考马斯蓝染色系列1：具有52bc突变的抗洋地黄毒苷抗体系列2：在第52b位置处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体(a)用3mmdte和10mmgssg共价偶联；(b)用0.3mmdte和1mmgssg共价偶联；(c)用0.03mmdte和0.1mmgssg共价偶联。图9：在仅氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，gssg)存在，但在还原剂不存在或在二者均不存在的情况下结合半抗原的cys突变的抗体与半抗原-cys-荧光标记缀合物形成缀合物：在sdspage分析中通过荧光信号检测到确定位置处的抗体复合和后续的共价键合。非还原性(上图)和还原性(下图)sds-page分析如实施例12中所述进行。在非还原条件下，抗体共价连接的半抗原可检测为适宜位置处更大尺寸的蛋白质结合信号。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。左：荧光图像右：考马斯蓝染色系列1：具有52bc突变的抗洋地黄毒苷抗体系列2：在第52b位置处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体(a)无添加物(b)用1mmgssg共价偶联；(c)用0.1mmgssg共价偶联。图10：ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2)的结构图11：dig-3-cme-eda-cy5的结构图12：dig-马来酰亚胺-cy5的结构图13：dig-eda-cys-cy5的结构图14：dig-ahx-cys-cy5的结构图15：dig-cys-mr121的结构图16：ac-pyy(peg3-dig)的结构图17：ac-pyy(peg3-cys-4abu-dig)的结构图18：peg3-pyy(peg3-cys-4abu-dig)的结构图19：dy636-eda-btn的结构图20：dy636-ser-btn的结构图21：dy636-cys-btn的结构图22：cy5-cys-btn的结构图23：cy5-ser-btn的结构图24：ac-pyy(peg2-btn)的结构图25：ac-pyy-peg3-cys-β-ala-btn)的结构图26：ac-pyy-peg3-ser-peg2-btn)的结构图27：ac-pyy-peg3-cys-peg2-btn的结构图28：ac-pyy(peg3-cys-4-abu-5-fluo)的结构图29：ac-pyy(peg3-cys-peg2-5-fluo)的结构图30：产生ac-pyy(peg2-btn)的示意图图31：产生ac-pyy(peg3-cys-β-ala-btn)的示意图图32：产生ac-pyy(peg3-cys-4-abu-dig)的示意图图33：与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体的x射线结构。棍图中显示与生物胞素酰胺相互作用的氨基酸残基。图34：与未复合的抗原/半抗原相比采用共价缀合物和非共价复合物的体内血液pk研究结果；显示生物素-cy5非共价复合物(图34a)和共价(ss桥接)缀合物(图35b)的cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％，实心标记)，以及未复合的生物素-ser-cy5(星号)的相对剩余荧光强度；将时间点t＝0.08小时处的荧光信号设定为100％；另外，显示小鼠血清样品中人igg的相对剩余量(空心标记)；将t＝0.08小时处的igg血清浓度(mg/ml)设定为100％。图35：确定小鼠血清中洋地黄毒苷化pyy多肽的量的蛋白质印迹。图36：亲和力驱动的半抗原化化合物与抗半抗原抗体复合的分析。在sdspage分析中由荧光信号指引在确定位置处的抗体复合和后续的共价键合，所述sdspage分析如实施例19中所述实施。左：采用未还原样品(凝胶左侧)和还原样品(凝胶右侧)的荧光图像。右：考马斯蓝染色。1：人源化抗洋地黄毒苷抗体+生物素-cys-cy52：人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc+生物素-cys-cy53：人源化抗生物素抗体+生物素-cys-cy54：人源化抗生物素抗体vh53c+生物素-cys-cy5白色箭头标示过量(未偶联的)生物素-cys-cy5，当使用抗洋地黄毒苷抗体vh52bc时，所述过量的生物素-cys-cy5是显著更高，因为在这种情况下缀合反应不是亲和力驱动的。图37：fab区内部为形成结合dig的抗体所要求的半胱氨酸位置和二硫键样式，所述抗体在第52b位置处具有用于半抗原介导的位点定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(a)vh域和ch1域中和vl域和cl域中为形成功能性fab片段所要求的半胱氨酸和二硫键样式。(b)vh域和ch1域中和vl域和cl域中为形成功能性fab片段所要求的半胱氨酸和二硫键样式，所述功能性fab片段在第52b位置处具有用于半抗原介导的位点定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(c和d)vh52b变体的vh域内部形成不正确二硫键的潜力，所述不正确二硫键将产生错误折叠的无功能抗体。(e)vh52b变体的fv区内部将导致错误折叠的无功能抗体的潜在不正确域间二硫键的例子。图38：为形成结合dig的二硫键稳定化的单链fv所要求的半胱氨酸位置和二硫键样式，所述单链fv在第52b位置处具有用于半抗原介导的位点定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(a)vh域和vl域中为形成功能性scfv、dsscfv和52b突变型dsscfv所要求的半胱氨酸。(b)必须形成以产生功能性scfv、dsscfv和52b突变型dsscfv的正确二硫键样式。(c)形成将产生错误折叠的无功能scfv的不正确二硫键的潜力。(d)形成将产生错误折叠的无功能dsscfv的不正确二硫键的潜力。(e)形成将产生错误折叠的无功能52b突变型dsscfv的不正确二硫键的潜力。图39：作为共价偶联有效载荷的递送载具的ley-dig双特异性抗体衍生物的组成。图40：用于靶向递送共价偶联有效载荷的双特异性抗半抗原抗体衍生物的表达和纯化。(a)对于蛋白质印迹分析，将细胞培养上清液进行sdspage(nupage4-12％bis-tris凝胶(1.0mmx12孔)(invitrogen；目录号np0322)并且随后将蛋白质转移至固定转移膜(immobilon-p)(millipore；目录号ipvh07850)，孔径0.45μm的pvdf。通过1:1000稀释的在山羊中产生的抗人κ轻链-碱性磷酸酶抗体(亲和纯化，sigma目录号a3813)和1:1000稀释的在山羊中产生的抗人igg(fc特异的)-碱性磷酸酶抗体(sigma目录号a9544)检测抗体衍生物。施加底物bcip/nbt-蓝液态底物(sigma目录号b3804)用于蛋白质印迹物显色。泳道1–分子量标记；泳道2和3-具有未修饰重链的对照抗体；泳道4-具有延长的h链的ley-dig(52bc)双特异性抗体。(b)sds-page分析(nupage4-12％bis-tris凝胶[invitrogen]和随后用考马斯亮兰染色展示蛋白质制备物的纯度并且显现与表观分子大小对应于其计算分子量的igg相关的多肽链。泳道1–分子量标记；泳道2-具有延长h链的还原ley-dig(52bc)双特异性抗体；泳道3-具有延长重链的非还原ley-dig(52bc)双特异性抗体；(c)大小排阻层析(superdex200)展示在蛋白a纯化后ley-dig(52bc)双特异性抗体衍生物的蛋白质制备物的均一性及其中缺少聚集物。图41：dig-cy5非共价复合物和共价(二硫键桥接)缀合物的cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％)，以及未复合的dig-cy5的相对剩余荧光强度；将时间点t＝0.08小时处的荧光信号设定为100％；另外，显示小鼠血清样品中人igg的相对剩余量；将t＝0.08小时处的igg血清浓度(mg/ml)设定为100％。图42：类体内条件下由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫键桥接)缀合物的生物素-cy5以及未复合的生物素-cy5的cy5-介导荧光的药物代谢动力学；实心菱形：生物素-cy5；实心正方形：生物素-cy5+抗生物素抗体(复合物)；三角形：cy5-生物素-抗生物素抗体缀合物。图43：a)茶碱-cys-cy5的组成、结构和分子量；b)大小排阻层析展示结合茶碱的纯化抗体变体的纯度和均一性；峰#2显示纯化的产物，缺少峰#1表明这类制备物不含聚集物；c)如通过非还原性sdspage(左侧泳道)和还原性(右侧泳道)sdspage展示，在结合茶碱的抗体和茶碱-cys-cy5之间形成共价复合物；cy5似乎在含有茶碱-cys-cy5和cys突变抗体的样品中仅在非还原性条件下与h链偶联，这些共价缀合物在还原时解体(右侧泳道)；泳道1：分子量标记；泳道2-4非还原性条件-泳道2：抗茶碱抗体(无cys-突变)+茶碱-cys-cy5(复合物)；泳道3：抗茶碱抗体-cys_55+茶碱-cys-cy5(缀合物)；泳道4：抗茶碱抗体-cys_54+茶碱-cys-cy5(缀合物)；泳道5-7还原性条件-泳道5：抗茶碱抗体(无cys-突变)+茶碱-cys-cy5(复合物)；泳道6：抗茶碱抗体-cys_55+茶碱-cys-cy5(缀合物)；泳道7：抗茶碱抗体-cys_54+茶碱-cys-cy5(缀合物)。图44：通过非还原性sdspage和还原性sdspage展示在结合生物素的抗体和生物素-cys-cy5之间共价复合物形成；偶联反应在37℃于鼠血清中进行1小时。cy5似乎在含有生物素-cys-cy5和cys突变抗体的样品中仅在非还原性条件下与h链偶联，这些共价缀合物在还原时解体(右侧泳道)；泳道1：分子量标记；泳道2-3非还原性条件-泳道2：抗生物素抗体(无cys突变)+生物素-cys-cy5(复合物)；泳道3：抗生物素抗体-cys+生物素-cys-cy5(缀合物)；泳道4-5还原性条件-泳道5：抗生物素抗体(无cys突变)+生物素-cys-cy5(复合物)；泳道6：抗生物素抗体-cys+生物素-cys-cy5(缀合物)图45：由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫键桥接)缀合物的生物素-cy5以及未复合的生物素-cy5的cy5-介导荧光的体内药物代谢动力学；实心菱形：生物素-cy5，实心圆圈：在施用抗生物素抗体后24小时施用的生物素-cy5(体内复合物形成)；实心正方形：在施用抗生物素抗体-cys后24小时施用的生物素-cys-cy5(体内缀合物形成)。图46：测定了与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体-fab片段的蛋白结构：复合的半抗原紧邻于带负电荷的氨基酸簇存在；作为半抗原在其羧基处经衍生化用于有效载荷偶联的生物素以良好效力结合，因为在这个位置不存在电荷排斥作用(归因于缺少cooh基)；相反，游离(正常)生物素不能有效与抗体结合，因为其羧基紧邻于这个负电荷簇，并且因此被排斥。具体实施方案i.定义出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，其包含从如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有序列构架衍生的轻链可变域(vl)构架或重链可变域(vh)构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，vl接纳体人类构架在序列上与vl人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。术语“氨基酸”指天然存在(即可以由核酸直接或以前体形式编码)的或非天然存在的一组羧基α-氨基酸。各个天然存在的氨基酸由三个核苷酸(所谓密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每种氨基酸由至少一个密码子编码。是称作“遗传密码的简并性”。如本申请内部使用，术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)。非天然存在氨基酸的例子包括但不限于aad(α-氨基己二酸)、abu(氨基丁酸)、ach(α-氨基环己烷-羧酸)、acp(α-氨基环戊烷-羧酸)、acpc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)、aib(α-氨基异丁酸)、aic(2-氨基茚满-2-羧酸；又称作2-2-aic)、1-1-aic(1-氨基茚满-1-羧酸)、(2-氨基茚满-2-羧酸)、烯丙基甘氨酸(allylgly)、别异亮氨酸(allo-ile)、asu(α-氨基辛二酸、2-氨基辛二酸)、bip(4-苯基-苯丙氨酸-羧酸)、bnhp((2s,4r)-4-羟脯氨酸)、cha(β-环丙基丙氨酸)、cit(瓜氨酸)、环己基甘氨酸(chg)、环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、dab(1,4-二氨基丁酸)、dap(1,3-二氨基丙酸)、p(3,3-双苯基丙氨酸-羧酸)、3,3-双苯基丙氨酸、二-正丙基甘氨酸(dpg)、2-呋喃基丙氨酸、高环己基丙氨酸(hocha)、高瓜氨酸(hocit)、高环亮氨酸、高亮氨酸(holeu)、高精氨酸(hoarg)、高丝氨酸(hoser)、羟脯氨酸、lys(ac)、(1)nal(1-萘基丙氨酸)、(2)nal(2-萘基丙氨酸)、4-meo-apc(1-氨基-4-(4-甲氧苯基)-环己烷-1-羧酸)、正亮氨酸(nle)、nva(正缬氨酸)、omathine、3-pal(α-氨基-3-吡啶基丙氨酸-羧酸)、4-pal(α-氨基-4-吡啶基丙氨酸-羧酸)、3,4,5,f3-phe(3,4,5-三氟苯丙氨酸)、2,3,4,5,6,f5-phe(2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸)、pqa(4-氧代-6-(1-哌嗪基)-3(4h)-喹唑啉-乙酸(cas889958-08-1))、吡啶基丙氨酸、喹啉基丙氨酸、肌氨酸(sar)、噻唑基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、tic(α-氨基-1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸)、tic(oh)、tle(叔丁基甘氨酸)和tyr(me)。术语“氨基酸序列变体”指具有某种程度上与天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体将与天然序列多肽拥有至少约70％序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约80％或更大序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约90％或更大序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约95％或更大序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约98％或更大序列同一性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内部的某些位置处拥有置换、缺失和/或插入。氨基酸由常规名称、单字母代码和三字母代码命名。术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。术语“抗体片段”指除完整抗体之外包含完整抗体的一部分的分子，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于fv、fab、fab'、fab’-sh、f(ab')2；双体抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。术语“生物素”，简写为“bi”，指5-[(3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸。生物素又称作维生素h或辅酶r。术语“双特异性抗体”指具有两种不同(抗原/半抗原)结合特异性的抗体。在一个实施方案中，如本文中报道的双特异性抗体是对两种不同抗原即半抗原和非半抗原性抗原特异的。术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。抗体的“类”指由其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仓、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。术语“洋地黄毒苷”，简写为“dig”，指3-[(3s,5r,8r,9s,10s,12r,13s,14s,17r)-3,12,14-三羟基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氢-环戊[a]-菲-17-基]-2h-呋喃-5-酮(cas编号1672-46-4)。洋地黄毒苷(dig)是一种仅存于植物洋地黄(digitalispurpurea)、东方毛地黄(digitalisorientalis)和狭叶毛地黄(digitalislanata)(毛地黄)的花和叶中的类固醇(polya,g.,biochemicaltargetsofplantbioactivecompounds,crcpress,newyork(2003)第847页)。术语“效应子功能”指归因于抗体fc区的那些生物学活性，这些活性随抗体类别变动。抗体效应子功能的例子包括：c1q结合和补体依赖的细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，b细胞受体)；和b细胞活化。术语试剂(例如，药物制剂)的“有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段有效实现所需治疗结果或预防结果的量。木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段，称作“fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和一个残余“fc”片段，该片段的名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的f(ab')2片段。fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。fab'片段因在重链ch1结构域的羧基端处附加额外几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与fab片段不同。fab'-sh在本文中是指这样的fab'，其中恒定域的半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基。f(ab')2抗体片段最初作为成对的fab片段产生，所述成对的fab片段在它们之间具有铰合半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。“fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种格局中每个可变域的3个高变区相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，这6个高变区向抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单个可变域(或仅包含抗原特异的3个高变区的半个fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然以比完整结合位点更低的亲和力进行。术语“fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的c端区域。该术语包括天然序列fc区和变异fc区。在一个实施方案中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基端。然而，fc区的c端赖氨酸(lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如kabat,e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinteres,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242中所述的eu编号体系，也称作eu索引。术语“荧光素”，简写为“fluo”，指6-羟-9-(2-羧苯基)-(3h)-呫吨-3-酮，备选地2-(6-羟-3-氧代-(3h)-呫吨-9-基)-苯甲酸。荧光素又称作二酚酞、c.i.45350、溶剂黄94，d&c黄第7号、angiofluor、日本黄201或皂黄。术语“构架”，简写为“fr”，指除高变区(hvr)残基之外的重链及轻链可变域氨基酸残基。可变域的fr通常由以下4个fr结构域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr序列和fr序列通常按以下序列出现在vh(或vl)中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。术语“游离半胱氨酸氨基酸”指这样的半胱氨酸氨基酸残基，其已经被工程化入亲本抗体中，具有巯基官能团(sh)并且不配对为分子内二硫键。然而，游离半胱氨酸氨基酸可以作为分子内二硫键例如与谷胱甘肽配对。术语“全长抗体”指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的fc区的重链。天然igg抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从n端至c端，每条重链具有一个可变区(vh)，也称作可变重链域或重链可变域，随后是三个恒定域(ch1、ch2和ch3)。类似地，从n端至c端，每条轻链具有一个可变区(vl)，也称作可变轻链域或轻链可变域，随后一个恒定轻链(cl)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。“全长抗体”是包含vl域和vh域以及轻链恒定域(cl)和重链恒定域ch1、ch2和ch3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。全长抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，所述效应子功能指归因于抗体fc恒定区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括c1q结合；补体依赖的细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬；下调细胞表面受体例如b细胞受体和bcr。术语“半抗原”指仅与大载体如蛋白质连接时才可以激发免疫应答的小分子。示例性半抗原是苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸及对氨基苯甲酸、醌、组胺-琥珀酰-甘氨酸(hsg)、肼苯哒嗪、氟烷、铟-dtpa、荧光素、生物素、洋地黄毒苷、茶碱和二硝基酚。在一个实施方案中，半抗原是生物素或洋地黄毒苷或茶碱或碳硼烷。术语“与化合物缀合的半抗原”或“半抗原化化合物”指与又一个部分如多肽或标记物共价连接的半抗原。经常使用活化的半抗原衍生物作为形成这类缀合物的原料。在一个实施方案中，半抗原是洋地黄毒苷并且它经接头(在一个实施方案中通过其3-羟基)与该部分缀合。在一个实施方案中，接头包含a)一个或多个(在一个实施方案中3至6个)亚甲基-羧基-甲基(-ch2-c(o)-)，和/或b)1至10个(在一个实施方案中1至5个)氨基酸残基(在一个实施方案中，所述氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸盐，β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸或赖氨酸)，和/或c)一种或多种(在一个实施方案中一种或两种)具有结构式nh2-[(ch2)no]xch2-ch2-cooh的化合物，其中n是2或3并且x是1至10，在一个实施方案中x是1至7。末尾单元产生(至少部分地)式-nh-[(ch2)no]xch2-ch2-c(o)-的接头(部分)。这种化合物的一个例子例如是12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(产生teg(三乙二醇)接头)。在一个实施方案中，接头还包含马来酰亚胺基。接头具有稳定及增溶作用，原因在于它含有电荷或/并且可以形式氢桥。此外，它可以在空间上促进抗半抗原抗体与半抗原缀合的多肽结合。在一个实施方案中，接头位于多肽的氨基酸的侧链处(例如通过氨基或巯基与赖氨酸或半胱氨酸侧链缀合)。在一个实施方案中，接头位于多肽的氨基端处或羧基端处。接头在多肽上的位置一般选择在不影响多肽生物学活性的区域处。因此，接头的接合位置取决于多肽的性质和负责生物学活性的有关结构要素。可以在体外测定法中检验与半抗原连接的多肽的生物学活性。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。子代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，但是可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物学活性。“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人源化”抗体指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变域的基本上全部部分，其中全部或基本上全部hvr(例如，cdr)与非人抗体的那些对应并且全部或基本上全部fr区与人抗体的那些对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如，非人抗体，指已经历过人源化的抗体。如本文所用，术语“高变区”或“hvr”指抗体可变域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“cdr”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个hvr；vh中三个(h1、h2、h3)和vl中三个(l1、l2、l3)。本文中的hvr包括(a)出现在第26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)氨基酸残基处的高变环(chothia,c.和lesk,a.m.,j.mol.biol.196(1987)901-917)；(b)出现在第24-34(l1)、50-56(l2)、89-97(l3)、31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)氨基酸残基处的cdr(kabat,e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242)；(c)出现在第27c-36(l1)、46-55(l2)、89-96(l3)、30-35b(h1)、47-58(h2)和93-101(h3)氨基酸残基处的抗原触点(maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括hvr氨基酸残基46-56(l2)、47-56(l2)、48-56(l2)、49-56(l2)、26-35(h1)、26-35b(h1)、49-65(h2)、93-102(h3)和94-102(h3)。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，sds-page、等电聚焦(ief)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相hplc)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，见，例如，flatman,s.等人,j.chrom.b848(2007)79-87。“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在细胞内所含的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，组成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。如本文所用，术语“单特异性抗体”指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点的每一个具有相同的结合特异性，即，与相同的抗原或半抗原结合。“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。术语“包装物插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包含的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。“亲本抗体”是一种抗体，所述抗体包含从中一个或多个氨基酸残基被一个或多个半胱氨酸残基替换的氨基酸序列。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。相对于抗体的其他天然形式、野生型形式或修饰形式，亲本抗体可以具有预先存在的氨基酸序列修饰(如添加、缺失和/或置换)。亲本抗体与半抗原特异性结合。亲本抗体还可以额外地针对目的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。还构思针对非多肽抗原的抗体。术语“有效载荷”指希望递送其活性(于)至细胞中和/或定位于细胞处的任何分子或分子组合。有效载荷包括但不限于标记物、细胞毒素(例如假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等)、酶、生长因子、转录因子、药物、放射性核素、配体、抗体、脂质体、纳米粒子、病毒粒子、细胞因子等。“化疗剂”是用于治疗癌症中的化学化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺()；烷基磺酸酯类如白消安、英丙舒凡和泊舒凡；氮丙啶类如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；环乙亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仓、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、罗莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类如阿克拉霉素、放线菌素d、安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、刺孢霉素、卡柔比星(carabicin)、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、佐柔比星、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢药如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和曲美沙特；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-fu；雄激素类如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如紫杉醇(bristol-myerssquibboncology,princeton,nj)和多西紫杉醇(rh6ne-poulencrorer,antony,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；长春瑞滨；米托蒽醌；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；cpt-ii；35拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；和以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物。该定义中还包括发挥对肿瘤调节或抑制激素作用的抗激素药如抗雌激素药，例如包括他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬(fareston)；和抗雄激素药如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物。“抗血管生成剂”指一定程度地阻断或干扰血管形成的化合物。抗血管生成剂可以例如是与参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。在一个实施方案中，抗血管生成因子是与血管内皮生长因子(vegf)结合的抗体。术语“细胞因子”是用于一个细胞群体所释放的蛋白质的类属术语，所述蛋白质作为细胞间介质作用于另一种细胞。此类细胞因子的例子是淋巴因子类、单核因子类和常规的多肽激素。细胞因子当中包括生长激素如人生长激素、n-甲硫酰人生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素类如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和促黄体激素(lh)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(tpo)；神经生长因子类如ngf-β；血小生长因子；转化生长因子(tgf)如tgf-α和tgf-β；胰岛素样生长因子-i和-ii；促红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子类(csf)如巨噬细胞-csf(m-csf)；粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)；和粒细胞-csf(gcsf)；白介素(il)如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12；肿瘤坏死因子如tnf-α或tnf-β；和其他多肽因子，包括lif和kit配体(kl)。如本文所用，术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等同物。术语“fmlp”指由n-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽。在一个实施方案中，效应子部分是fmlp或其衍生物。术语“前体药物”指药学活性物质的前体或衍生物形式，其中与母体药物相比，所述前体或衍生物对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性并且能够酶促地被活化或转变成更有活性的母体形式。参见，例如，wilman,“prodrugsincancerchemotherapy(癌症化疗中的前体药物)”biochemicalsocietytransactions,第14卷,615thmeetingbelfast(1986),第375-382页和stella等人,“prodrugs:achemicalapproachtotargeteddrugdelivery(前体药物：定向药物递送的化学手段)”,directeddrugdelivery,borchardt等人(编著),第247-267页,humanpress(1985)。可以作为效应子部分使用的前体药物包括但不限于含有磷酸酯的前体药物、含有硫代磷酸酯的前体药物、含有硫酸酯的前体药物、含有肽的前体药物、d-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含有β-内酰胺的前体药物，任选地含有置换的苯氧乙酰胺的前体药物或任选地置换的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前体药物，这些前体药物可以转变成细胞毒性更强的游离药物。可以衍生成用于本发明中的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于本文所述的那些化疗剂。术语“细胞毒部分”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仓、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和本文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为对齐序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序align-2产生氨基酸序列同一性％值。align-2序列比较计算机程序由genentech,inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区美国版权办公室，在那里它以美国版权登记号txu510087登记。align-2程序从genentech,inc.,southsanfrancisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将align-2程序汇编在unix操作系统(包括数字式unixv4.0d)上使用。全部序列比较参数由align-2程序设定并且不变动。在使用align-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列a与、同或针对给定氨基酸序列b(这可以备选地描述为与、同或针对给定氨基酸序列b具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列a)的氨基酸序列同一性％是：100乘以分数x/y其中x是由序列比对程序align-2在该程序的a和b比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中y是b中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度时，a相对于b的氨基酸序列同一性％将不等于b相对于a的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用align-2计算机程序获得。术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这种形式，从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效，并且不含有对将会施用该制剂的受试者造成不可接受毒性的额外组分。“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。“多肽”是由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生或合成产生。小于约20个氨基酸残基的多肽可以称作“肽”，而由两条或更多条多肽组成或包含超过100个氨基酸残基的一条多肽的分子可以称作“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，如糖基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由在细胞中表达多肽的细胞添加并且可以随细胞类型变动。多肽在本文中根据它们的氨基酸主链结构或编码它们的核酸限定。添加物如糖基团通常不予指定，但然而可以存在。全部多肽序列根据普遍接受的习惯书写，因而α-n端氨基酸残基在左侧并且α-c端氨基酸残基在右侧。如本文所用，术语“n末端”指多肽中氨基酸的游离α-氨基，并且术语“c末端”指多肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。n端以某个基团终止的多肽指在n端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的多肽。n端以某个基团终止的氨基酸指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。除非另外指明，否则通过“d”前缀，例如，d-ala或n-me-d-ile或以小写字母样式书写，例如a、i、1(d形式的ala、ile、leu)，本说明书和所附权利要求书中描述的多肽中的氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立体化学是天然构型或“l”构型。cahn-ingold-prelog“r”和“s”命名用来规定在多肽的n末端处某些酰基取代基中的手性中心的立体化学。命名“r,s”意在指示两种对映异构形式的外消旋混合物。这种命名法遵循cahn,r.s.等人,angew.chem.int.ed.engl.5(1966)385-415中描述的命名法。术语“单链fv”，简写为“scfv”，指包含抗体vh域和vl域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在一个实施方案中，fv多肽还包含在vh域和vl域之间的多肽接头，所述多肽接头能够使scfv形成用于抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，见plueckthun,引自thepharmacologyofmonoclonalantibodies,第113卷,rosenburg和moore(编著),springer-verlag,newyork,第269-315页(1994)。术语“茶碱”，简写为“theo”，指1,3-二甲基-7h-嘌呤-2,6-二酮。茶碱又称作二甲基黄嘌呤。术语“治疗”(和其语法变型如“医治”或“处理”)指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。术语“x-价”，例如“单价”或“二价”或“三价”或“四价”，指抗体分子中存在指定数目(即“x”个)的结合位点。就这一点而论，术语“二价”、“四价”和“六价”指抗体分子中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。如本文中报道的双特异性抗体至少是“二价的”并且可以是“三价”或“多价的”(例如“四价”或“六价”)。在一个实施方案中，如本文中报道的双特异性抗体是二价、三价或四价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是四价的。在某些方面和实施方案中，如本文中报道的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异的。即，这些抗体可以是双特异性的，甚至在存在多于两个结合位点的情况下(即该抗体是三价或多价的)也是如此。术语双特异性抗体例如包括，多价单链抗体、双体抗体和三体抗体(triabodies)，以及具有全长抗体的恒定域结构的抗体，其中通过一个或多个肽接头与其他抗原结合位点(例如，单链fv、vh域和/或vl域、fab或(fab)2)连接。抗体可以是来自单一物种的全长抗体或经嵌合化或人源化。对于具有多于两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要该蛋白质具有针对两种不同抗原的结合位点。即，在第一结合位点对半抗原特异的情况下，第二结合位点对非半抗原性抗原特异，并且反之亦然。术语“可变区”指抗体重链或轻链的参与抗体结合其抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变域(分别是vh和vl)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(fr)和三个高变区(hvr)。(参见，例如，kindt,t.j.等人,kubyimmunology，第6版，w.h.freemanandco.，n.y.(2007)第91页)。单个vh域或vl结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的vh或vl结构域分离以分别筛选互补性vl结构域或vh域文库。参见，例如，portolano,s.等人,j.immunol.150(1993)880-887；clackson,t.等人,nature352(1991)624-628)。术语“载体”指能够增殖与之连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入宿主细胞的基因组中的载体，其中已经向所述细胞中引入所述载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。ii.如本文中报道的缀合物在一个方面，本发明基于如下研究结果：可以通过以下方式获得包含抗原和与该抗原特异性结合的抗体的共价缀合物：在抗原中恰当安置的官能团和抗体可变域中尤其抗体cdr2中包含官能团的氨基酸残基之间形成共价键，其中根据kabat的重链可变域编号法确定cdr2。在某些实施方案中，该抗原是半抗原。在一个实施方案中，该半抗原是生物素、或洋地黄毒苷、或荧光素、或茶碱、或碳硼烷。在一个实施方案中，该抗原是半抗原化化合物。在一个实施方案中，该半抗原化化合物是包含半抗原、接头和有效载荷的缀合物。在一个实施方案中，该半抗原是生物素、或洋地黄毒苷、或荧光素、或茶碱、或碳硼烷。在某些实施方案中，该官能团可以含有缺电子双键或巯基。在一个实施方案中，该官能团是马来酰亚胺或半胱氨酸。在本发明的某些方面，提供与洋地黄毒苷特异性结合的抗体。在本发明的某些方面，提供与生物素特异性结合的抗体。在本发明的某些方面，提供与茶碱特异性结合的抗体。由于可以使用如本文中报道的缀合物作为人类中的治疗药，本文还提供上述针对洋地黄毒苷、生物素和茶碱的抗体的人源化变体。半抗原-多肽缀合物(半抗原化化合物)和抗半抗原抗体的共价缀合物可以向多肽赋予良好的生物物理特性和改进的pk特性。另外，在使用多肽双特异性抗体的情况下，该缀合物可以用来将多肽靶向至细胞，其中所述细胞展示被双特异性抗体的第二结合特异性识别的抗原。这类缀合物由一种抗半抗原结合特异性和一种(非半抗原性)抗原结合特异性组成。抗体对半抗原-多肽缀合物的化学计量比取决于双特异性抗体的样式并且可以是1:1、1:2、2:1、2:2、2:4和4:2(抗体:半抗原-多肽)。想要的是多肽保留良好生物学活性，尽管与半抗原缀合以及与抗体缀合。还想要的是(在双特异性靶向模块的情况下)，双特异性抗体的细胞表面靶结合位点在共价缀合的半抗原化化合物存在下保留其结合特异性和亲和力。抗原(半抗原)中的反应基团在可以是任何反应基团，如例如马来酰亚胺，例如n-乙基马来酰亚胺(nem)、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其他反应性缀合配偶物(参见例如haugland,2003,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley,1992,bioconjugatechem.3:2；garman,1997,non-radioactivelabeling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；hermanson,g.引自bioconjugatetechniques(1996)academicpress,sandiego,第40-55页和第643-671页)。抗体上的反应基团限于可以选择性即位置特异性生成的那些。因此，它限于氨基酸残基半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的侧链基团。为了在抗体和抗原/半抗原之间形成共价缀合物，不得不通过引入反应基团修饰两种化合物。一旦抗体结合抗原/半抗原，则使得两个反应基团紧邻，引起共价键形成。在一个实施方案中，这种修饰是在每种化合物中引入巯基功能。在一个实施方案中，该巯基化合物是半胱氨酸残基。待突变的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应当靠近结合区以利用抗原/半抗原安置效应以定向偶联，和(ii)突变位置和偶联位置必须以不影响抗原/半抗原结合本身的方式安置。找到合适位置的这些要求是事实上彼此‘矛盾’，因为要求(i)由接近于结合位点的位置最佳满足，同时要求(ii)最安全地由远离结合位点的位置实现。尽管这些实际上排他性的要求，仍鉴定到可以在不影响半抗原安置的情况下突变，然而同时允许定向共价偶联的位置。根据重链可变域的kabat编号法，第一位置分别位于位置vh52b处或位置vh53处。如果抗体具有不含有居间残基(如52a、52c、52c和52d)的短vhcdr2，则该位置是53(根据kabat的抗体重链可变域编号方案和规则编号和对齐)。如果抗体具有包含残基52a和52b并且还任选包含残基如52c和52d等的长vhcdr2，则该位置是52b(根据kabat的抗体重链可变域编号方案和规则编号和对齐)。根据kabat编号法，第二位置是位于位置vh28处。例如，在抗洋地黄毒苷抗体结构中，半抗原结合于疏水性残基形成的深口袋中。在这项结晶学研究中使用荧光洋地黄毒苷-cy5缀合物，其中荧光团以及洋地黄毒苷和cy5之间的接头在结构中不可见，原因在于高度灵活性和所致的晶体中无序性。然而，接头和cy5与指向重链的cdr2方向的洋地黄毒苷的o32连接。在洋地黄毒苷的o32与根据kabat的位置52b中氨基酸残基的cα之间的距离是约已经发现该位置是“通用”位置，即，该位置适用于任何(抗半抗原)抗体并且因此，不需要每次从零开始，不得不通过提供晶体结构和确定能够进行半抗原定向共价偶联的适宜位置，修饰新(抗半抗原)抗体。根据kabat编号方案，突变vh52bc或vh53c分别可以出乎意料地用于每种所分析的结合半抗原的抗体。即使抗体及其结合袋的结构相当多样，仍已经显示vh52bc/vh53c突变可以用于抗原/半抗原与结合洋地黄毒苷、生物素、荧光素以及茶碱的抗体共价接合。因此，已经进一步发现在无需进一步结构设计或知晓具体抗体结构并且不干扰抗体可变域内在结合特性的情况下，将根据kabat编号法的位置vh52b/vh53处的氨基酸残基(该残基位于抗体重链的cdr2内部)变成半胱氨酸适用于其他(抗半抗原)抗体。如本文中报道的修饰的抗体保留其亲本(即野生型)抗体对应物的半抗原(抗原)结合能力。因此，该工程化抗体能够结合，在一个实施方案中，它能够与特异性结合半抗原(抗原)。术语“结合特异性”或“与…结合的抗体”指包含结合特异性的分子或可以与其他分子以特异性方式形成复合物的抗体。这种结合可以在体外测定法中如在等离子体共振测定法(biacore，ge-healthcareuppsala，瑞典)中检测到。复合物形成的亲和力由术语ka(化合物缔合以形成复合物的速率常数)、kd(解离常数，复合物解离)和kd(kd/ka)定义。结合或特异性结合意指约10-8m或更小、在一个实施方案中约10-8m至约10-13m、在一个实施方案中约10-9m至约10-13m的结合亲和力(kd)。因此，与半抗原结合以形成如本文中报道的复合物的抗体以约10-8mol/l或更小、在一个实施方案中约10-8mol/l至约10-13mol/l、在一个实施方案中以约10-9mol/l至10-13mol/l的结合亲和力(kd)与半抗原特异性结合。已经发现如果形成的键是二硫键，当不要求添加还原剂和/或氧化剂的情况下抗体与半抗原结合时，则在半胱氨酸修饰的抗体和半胱氨酸修饰的半抗原-多肽缀合物之间形成共价键，其中所述半胱氨酸修饰的半抗原-多肽缀合物在半抗原和多肽之间的接头中携带半胱氨酸残基。因此，当形成非共价复合物时，两种化合物之间的二硫键自发地形成。因此，一种用于形成如本文中报道的共价复合物的方法仅需要混合这两种化合物。形成二硫键的唯一先决条件是两种化合物彼此正确取向。如本文中报道的工程化抗体可以位点特异地和有效地与包含反应基团的半抗原偶联。将(根据kabat编号方案)在位置vh52b和vh53处的氨基酸残基分别替换为cys残基，产生了具有在抗洋地黄毒苷抗体-vh52bc的seqidno:20和28中、抗茶碱抗体-vh53c的seqidno:84和92、抗生物素抗体-vh53c的seqidno:52和60中和抗荧光素抗体-vh52bc的seqidno:10中列出的重链可变区序列的抗体衍生物。将(根据kabat编号方案)在位置vh28处的重链可变域氨基酸残基替换为cys残基，产生了具有分别在seqidno:116、124、132、140、148、156和164中列出的重链可变区序列的抗体衍生物。如本文中报道的一个方面是作为人源化抗体的抗洋地黄毒苷抗体。在如本文中报道的一个方面，提供一种抗洋地黄毒苷抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:09或25的氨基酸序列的重链cdr1、(b)包含seqidno:10或26的氨基酸序列的重链cdr2、(c)包含seqidno:11或27的氨基酸序列的重链cdr3、(d)包含seqidno:13或29的氨基酸序列的轻链cdr1、(e)包含seqidno:14或30的氨基酸序列的轻链cdr2和(f)包含seqidno:15或31的氨基酸序列的轻链cdr3。如本文中报道的一个方面是作为人源化抗体的抗生物素抗体。在如本文中报道的一个方面，提供一种抗生物素抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:41或57的氨基酸序列的重链cdr1、(b)包含seqidno:42或58的氨基酸序列的重链cdr2、(c)包含seqidno:43或59的氨基酸序列的重链cdr3、(d)包含seqidno:45或61的氨基酸序列的轻链cdr1、(e)包含seqidno:46或62的氨基酸序列的轻链cdr2和(f)包含seqidno:47或64的氨基酸序列的轻链cdr3。如本文中报道的一个方面是一种抗荧光素抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:105或113的氨基酸序列的重链cdr1、(b)包含seqidno:106或114的氨基酸序列的重链cdr2、(c)包含seqidno:107或115的氨基酸序列的重链cdr3、(d)包含seqidno:109或117的氨基酸序列的轻链cdr1、(e)包含seqidno:110或118的氨基酸序列的轻链cdr2和(f)包含seqidno:111或119的氨基酸序列的轻链cdr3。如本文中报道的一个方面是抗茶碱抗体。在一个实施方案中，该抗茶碱是人源化抗体。在一个实施方案中，提供一种抗茶碱抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:73或89的氨基酸序列的重链cdr1、(b)包含seqidno:74或90的氨基酸序列的重链cdr2、(c)包含seqidno:75或91的氨基酸序列的重链cdr3、(d)包含seqidno:77或93的氨基酸序列的轻链cdr1、(e)包含seqidno:78或94的氨基酸序列的轻链cdr2和(f)包含seqidno:79或95的氨基酸序列的轻链cdr3。如本文中报道的一个方面是一种抗洋地黄毒苷抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vhcdr序列的vh域：(i)包含seqidno:09或25的氨基酸序列的重链cdr1、(ii)包含seqidno:10或26的氨基酸序列的重链cdr2和(iii)包含seqidno:11或27的氨基酸序列的重链cdr3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vlcdr序列的vl域：(i)包含seqidno:13或29的氨基酸序列的轻链cdr1、(ii)包含seqidno:14或30的氨基酸序列的轻链cdr2和(iii)包含seqidno:15或31的氨基酸序列的轻链cdr3。如本文中报道的一个方面是一种抗生物素抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vhcdr序列的vh域：(i)包含seqidno:41或57的氨基酸序列的重链cdr1、(ii)包含seqidno:42或58的氨基酸序列的重链cdr2和(iii)包含seqidno:43或59的氨基酸序列的重链cdr3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vlcdr序列的vl域：(i)包含seqidno:45或61的氨基酸序列的轻链cdr1、(ii)包含seqidno:46或62的氨基酸序列的轻链cdr2和(iii)包含seqidno:47或63的氨基酸序列的轻链cdr3。如本文中报道的一个方面是一种抗荧光素抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vhcdr序列的vh域：(i)包含seqidno:105或113的氨基酸序列的重链cdr1、(ii)包含seqidno:106或114的氨基酸序列的重链cdr2和(iii)包含seqidno:107或115的氨基酸序列的重链cdr3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vlcdr序列的vl域：(i)包含seqidno:109或117的氨基酸序列的轻链cdr1、(ii)包含seqidno:110或118的氨基酸序列的轻链cdr2和(iii)包含seqidno:111或119的氨基酸序列的轻链cdr3。如本文中报道的一个方面是一种抗茶碱抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vhcdr序列的vh域：(i)包含seqidno:73或89的氨基酸序列的重链cdr1、(ii)包含seqidno:74或90的氨基酸序列的重链cdr2和(iii)包含seqidno:75或91的氨基酸序列的重链cdr3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的vlcdr序列的vl域：(i)包含seqidno:77或93的氨基酸序列的轻链cdr1、(ii)包含seqidno:78或94的氨基酸序列的轻链cdr2和(iii)包含seqidno:79或95的氨基酸序列的轻链cdr3。在前述任一方面和实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体和/或抗生物素抗体和/或抗茶碱抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体包含如前述任一方面和/或实施方案中的cdr，并且还包含人接纳体构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在一个实施方案中，抗生物素抗体包含如前述任一方面和/或实施方案中的cdr，并且还包含人接纳体构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在一个实施方案中，抗茶碱抗体包含如前述任一方面和/或实施方案中的cdr，并且还包含人接纳体构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。如本文中报道的另一个方面是包含与seqidno:04或12或20或28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(vh)序列的抗洋地黄毒苷抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。在某些实施方案中，已经在seqidno:01或09或17或25中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在cdr外部的区域内(即，在fr中)。任选地，抗洋地黄毒苷抗体包含在seqidno:01或09或17或25中的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是包含与seqidno:08或16或24或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)的抗洋地黄毒苷抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。在某些实施方案中，已经在seqidno:08或16或24或32中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在cdr外部的区域内(即，在fr中)。任选地，抗洋地黄毒苷抗体包含在seqidno:08或16或24或32中的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是包含与seqidno:36或44或52或60的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(vh)序列的抗生物素抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗生物素抗体保留与生物素结合的能力。在某些实施方案中，已经在seqidno:36或44或52或60中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在cdr外部的区域内(即，在fr中)。任选地，抗生物素抗体包含在seqidno:36或44或52或60中的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是包含与seqidno:108或116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(vh)序列的抗荧光素抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗荧光素抗体保留与荧光素结合的能力。在某些实施方案中，已经在seqidno:108或116中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在cdr外部的区域内(即，在fr中)。任选地，抗荧光素抗体包含seqidno:108或116中的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是包含与seqidno:68或76或84或92的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(vh)序列的抗茶碱抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。在某些实施方案中，已经在seqidno:68或76或84或92中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在cdr外部的区域内(即，在fr中)。任选地，抗茶碱抗体包含在seqidno:68或76或84或92中的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是一种抗洋地黄毒苷抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vh和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vl。在一个实施方案中，该抗体包含分别在seqidno:04或12或20或28和seqidno:08或16或24或32中的vh和vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是一种抗生物素抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vh和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vl。在一个实施方案中，该抗体包含分别在seqidno:36或44或52或60和seqidno:40或48或56或64中的vh和vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是一种抗荧光素抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vh和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vl。在一个实施方案中，该抗体包含分别在seqidno:108或116和seqidno:112或120中的vh和vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。如本文中报道的另一个方面是一种抗茶碱抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vh和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的vl。在一个实施方案中，该抗体包含分别在seqidno:68或76或84或92和seqidno:72或80或88或96中的vh和vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。被鉴定为修饰点的又一个位置是根据kabat编号的第vh28位置。将根据kabat的在位置vh28处的氨基酸替换为cys，产生了具有作为抗洋地黄毒苷抗体-vh28c的seqidno:124和132、抗茶碱抗体-vh28c的seqidno:156和164、抗生物素抗体-vh28c的seqidno:140和148和抗荧光素抗体-vh28c的seqidno:116列出的重链可变区序列的抗体衍生物。esi-ms分析显示半抗原化治疗性肽的共价抗体缀合产生具有所定义的大小的缀合物，所述缀合物大于未复合的抗体或未复合的肽。表1：tic表1)hcwn端焦谷氨酸2)hcw/oc端lys3)在糖基化位点处因去糖基化所致的hcwn->d4)lcwn端焦谷氨酸抗体亲和力在某些实施方案中，如本文中报道的抗体本身或如本文中报道的复合物中的抗体具有≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如约10-8m或更小，例如从约10-8m至约10-13m，例如，从约10-9m至约10-13m)的解离常数(kd)。在一个实施方案中，通过放射标记的抗原结合测定法(ria)测量kd，所述测定法用目的抗体的fab形式和其抗原如以下测定法所述那样进行。通过以下方式测量fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最低浓度的(125i)的标记抗原平衡fab，随后用抗fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，chen,y.等人，j.mol.biol.293(1999)865-881)。为了建立用于测定法的条件，将多孔板(thermoscientific)用50mm碳酸钠(ph9.6)中的5μg/ml抗fab捕获抗体(cappellabs)包被过夜并随后用pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭2至5小时。在不吸附性平板(nunc#269620)中，将100pm或26pm[125i]-抗原与目的fab的连续稀释物(例如，与presta,l.g.等人,cancerres.57(1997)4593-4599中评估抗vegf抗体fab-12一致)混合。随后将目的fab温育过夜；然而，温育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温温育(例如，1小时)。随后移除溶液并将平板用pbs中的0.1％聚山梨醇酯20()洗涤8次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁体(microscint-20tm；packard)，并且将平板在topcounttmγ计数器(packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种fab的浓度用于竞争性结合测定法中。根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法，例如使用-2000或-3000(biacore,inc.,piscataway,nj)在25℃采用固定抗原cm5芯片以约10个响应单位(ru)，测量kd。简而言之，根据供应商说明书，以盐酸n-乙基-n'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(cm5，biacore，inc.)。抗原用10mm乙酸钠，ph4.8稀释至5μg/ml(约0.2μm)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(ru)。在抗原上样后，注入1m乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μl/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(tween-20tm)表面活性剂的pbs(pbst)中的fab2倍连续稀释物(例如，0.78nm至500nm)。使用简单一对一langmuir结合模型(评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(kd)计算为koff/kon比。参见，例如，chen,y.等人,j.mol.biol.293(1999)865-881。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106m-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流阀(stop-flow)的分光光度计(avivinstruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列slm-amincotm分光光度计(thermospectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述荧光猝灭技术在25℃测量在pbs,ph7.2中的20nm抗抗原抗体(fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。抗体片段在某些实施方案中，本文提供的或在如本文中报道的缀合物中的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于fab、fab’、fab’-sh、f(ab’)2、fv和scfv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，见hudson,p.j.等人,nat.med.9(2003)129-134。关于scfv片段的综述，见例如plueckthun,a.,引自thepharmacologyofmonoclonalantibodies,第113卷,rosenburg和moore(编著),(springer-verlag,newyork(1994),第269-315页；还见wo93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的fab和f(ab')2片段的讨论，见us5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是二价或双特异的。见，例如，ep0404097；wo1993/01161；hudson,p.j.等人，nat.med.9(2003)129-134；和holliger,p.等人，proc.natl.acad.sci.usa90(1993)6444-6448。三体抗体和四体抗体还在hudson,p.j.等人,nat.med.9(20039129-134)中描述。单一结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；参见，例如，us6,248,516)。可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。嵌合抗体和人源化抗体在某些实施方案中，本文提供的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在us4,816,567；和morrison,s.l.等人，proc.natl.acad.sci.usa81(1984)6851-6855)中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中hvr(例如，cdr)(或其部分)衍生自非人类抗体并且fr(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些fr残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生hvr残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体和制造它们的方法例如在almagro，j.c.和fransson,j.,front.biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且例如在riechmann,i.等人,nature332(1988)323-329；queen,c.等人,proc.natl.acad.sci.usa86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；kashmiri,s.v.等人,methods36(2005)25-34(描述sdr(a-cdr)移植)；padlan,e.a.,mol.immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；dall'acqua,w.f.等人,methods36(2005)43-60(描述“fr改组”)；和osbourn,j.等人,methods36(2005)61-68以及klimka,a.等人,br.j.cancer83(2000)252-260(描述针对fr改组的“导向选择”方案)中进一步描述。可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”方法选择的构架区(例如，见sims,m.j.等人,j.immunol.151(1993)2296-2308)；从特定亚组的人抗体的轻链可变区或重链可变区的共有序列衍生的构架区(例如，见carter,p.等人,proc.natl.acad.sci.usa89(1992)4285-4289；和presta,l.g.等人,j.immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(例如，见almagro,j.c.和fransson,j.,front.biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选fr文库衍生的构架区(例如，见baca,m.等人,j.biol.chem.272(1997)10678-10684和rosok,m.j.等人,j.biol.chem.271(1996)22611-22618)。人抗体在某些实施方案中，本文提供的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在vandijk,m.a.和vandewinkel,j.g.,curr.opin.pharmacol.5(2001)368-374以及lonberg,n.,curr.opin.immunol.20(2008)450-459中描述。可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见lonberg,n.,nat.biotech.23(2005)1117-1125。例如，还参见描述xenomousetm技术的us6,075,181和us6,150,584；描述技术的us5,770,429；描述k-m技术的us7,041,870和描述技术的us2007/0061900。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(例如，参见kozbor,d.,j.immunol.133(1984)3001-3005；brodeur,b.r.等人,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,marceldekker,inc.,newyork(1987),第51-63页；和boerner,p.等人,j.immunol.147(1991)86-95)。在li,j.等人，proc.natl.acad.sci.usa103(2006)3557-3562中也描述了借助人b-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(其描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人igm抗体)和ni,j.,xiandaimianyixue26(2006)265-268(其描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。在vollmers,h.p.和brandlein,s.,histology和histopathology20(2005)927-937和vollmers,h.p.和brandlein,s.,methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology27(2005)185-191中也描述了人杂交瘤技术(三体瘤技术)。也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库选出的fv克隆可变域序列产生人抗体。这类可变域序列随后可以与所需的人恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。文库衍生的抗体可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如在h.r.等人,methodsinmolecularbiology178(2001)1-37中综述并且例如在mccafferty,j.等人,nature348(1990)552-554；clackson,t.等人,nature352(1991)624-628；marks,j.d.等人,j.mol.biol.222(1992)581-597；marks,j.d.和bradbury,a.,methodsinmolecularbiology248(2003)161-175；sidhu,s.s.等人,j.mol.biol.338(2004)299-310；lee,c.v.等人,j.mol.biol.340(2004)1073-1093；fellouse,f.a.,proc.natl.acad.sci.usa101(2004)12467-12472和lee,c.v.等人,j.immunol.methods284(2004)119-132中进一步描述。在某些噬菌体展示法中，vh基因库和vl基因库分别由聚合酶链反应(pcr)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合性噬菌体，如winter,g.等人,ann.rev.immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链fv(scfv)片段或展示为fab片段。来自已免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以便在不作任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原和另外针对广泛类型自身抗原的抗体的单一来源，如griffiths,a.d.等人,emboj.12(1993)725-734所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的v-基因区段并使用含有随机序列的pcr引物以编码高度可变的cdr3区并实现体外重排，合成地产生天然文库，如hoogenboom,h.r.和winter,g.,j.mol.biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。抗体样式上文概述的抗体和抗体片段可以按多种方式组合以产生不同的抗体样式。例如，一个或多个scfv抗体片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的c端融合。scfv抗体片段可以尤其与每个重链c端或与每个轻链c端融合。例如，一个或多个fab抗体片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的c端融合。fab抗体片段可以尤其与每个重链c端或与每个轻链c端融合。例如，一个scfv和一个抗体fab片段可以与抗体fc区的n端融合。例如，一个scfv和一个抗体fab片段可以与抗体fc区的n端融合，且一个scfv或抗体fab片段可以与抗体fc区的相应另一条链的c端融合。多特异性抗体已经开发了类型广泛的重组抗体样式，例如由如igg抗体样式与单链结构域融合的四价双特异性抗体(见例如coloma,m.j.等人,naturebiotech15(1997)159-163；wo2001/077342；和morrison,s.l.,naturebiotech25(2007)1233-1234)。另外，已经开发了其中不再留下抗体核心结构(iga、igd、ige、igg或igm)的几种其他样式，如双体、三体或四体抗体、微型抗体、能够结合两种或更多种抗原的几种单链形式(scfv、双scfv)(holliger,p.等人,naturebiotech23(2005)1126-1136；fischer,n.,léger,o.,pathobiology74(2007)3-14；shen,j.等人,journalofimmunologicalmethods318(2007)65-74；wu,c.等人,naturebiotech.25(2007)1290-1297)。全部这类样式均使用接头以使抗体核心(iga、igd、ige、igg或igm)与其他结合蛋白(例如scfv)融合或以使例如两个fab片段或scfv融合(fischer,n.和léger,o.,pathobiology74(2007)3-14)。应当牢记通过维持与天然存在抗体的高程度相似性，可能想要保留通过fc受体结合介导的效应子功能，例如补体依赖的细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞毒作用(adcc)。在wo2007/024715中报道了作为工程化多价和多特异性结合蛋白的双重可变域免疫球蛋白。在us6,897,044中报道了一种用于制备生物学上有活性的抗体二聚体的方法。在us7,129,330中报道了具有至少4个可变域的多价fv抗体构建体，所述可变域各自通过肽接头连接。在us2005/0079170中报道了结合抗原的二聚体和多聚体结构。在us6,511,663中报道了包含彼此通过连接结构共价连接的3个或4个fab片段的三价或四价单特异性抗原结合蛋白，所述蛋白质不是天然免疫球蛋白。在wo2006/020258中报道了可以在原核细胞和真核细胞中高效表达并且可用于治疗方法和诊断方法中的四价双特异性抗体。在us2005/0163782中报道了一种分离或偏好地合成二聚体的方法，其中所述二聚体通过源于不借助来自下述混合物的至少一个链间二硫键连接的二聚体中的至少一个链间二硫键连接，所述混合物包含两种类型的多肽二聚体。在us5,959,083中报道了双特异性四价受体。在wo2001/077342中报道了具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体。在wo1997/001580中报道了结合抗原的多特异性和多价多肽。wo1992/004053报道了同型缀合物，一般从与相同抗原决定簇结合并且通过合成性交联过程共价连接的igg类单克隆抗体制备。在wo1991/06305中报道了对抗原具有高亲合力的寡聚单克隆抗体，其中分泌寡聚物(一般为igg类)，所述寡聚物具有缔合在一起以形成四价或六价igg分子的两个或更多个免疫球蛋白单体。在us6,350,860中报道了来自绵羊的抗体和工程化抗体构建体，它们可以用来治疗其中干扰素γ活性致病的疾病。在us2005/0100543中报道了可靶向构建体，它们是双特异性抗体的多价载体，即，可靶向构建体的每个分子可以充当两个或更多个双特异性抗体的载体。在wo1995/009917中报道了基因修饰的双特异性四价抗体。在wo2007/109254中报道了由稳定化scfv组成或包含稳定化scfv的稳定化结合分子。在某些实施方案中，本文提供的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一针对半抗原并且另一种特异性针对任何其他(非半抗原性)抗原。双特异性抗体也可以用来将细胞毒性剂定位至细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(见milstein,c.和cuello,a.c.,nature305(1983)537-540,wo93/08829和traunecker,a.等人,emboj.10(1991)3655-3659)和“隆突入穴(knob-in-hole)”工程化(例如，见美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体fc-异二聚体分子(wo2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，见美国专利号4,676,980，和brennan,m.等人，science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，见kostelny,s.a.等人，j.immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，见holliger,p.等人，proc.natl.acad.sci.usa90(1993)6444-6448)；和使用单链fv(sfv)二聚体(例如，见gruber,m.等人，j.immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如tutt,a.等人，j.immunol.147(1991)60-69)中所述那样。在一个实施方案中，通过“隆突进入穴(knob-into-hole)”技术改变双特异性抗体的重链的ch3域，所述技术以例如wo96/027011、wo98/050431、ridgwayj.b.等人,proteineng.9(1996)617–621、merchant,a.m.等人,natbiotechnol16(1998)677-681中的几个例子详述。在这种方法中，改变两个ch3域的相互作用表面以增加含有这两个ch3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个ch3域的一者可以是“隆突”，而另一者是“穴”。二硫键的引入使异二聚体稳定化(merchant,a.m等人,naturebiotech16(1998)677-681，atwell,s.等人,j.mol.biol.270(1997)26–35)并增加产量。在全部方面的一个实施方案中，双特异性抗体特征在于-一条重链的ch3域和另一条重链的ch3域各自在包含抗体ch3域之间的初始界面的界面处会合，其中改变所述界面以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于a)改变一条重链的ch3域，从而在双特异性抗体内部的、会合另一条重链的ch3域的初始界面的一条重链的ch3域的初始界面内部，将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，由此在一个重链的ch3域的界面内部产生突出部分，所述突出部分是在另一个重链的ch3域的界面内部的空穴中可放置的。和b)改变另一条重链的ch3域，从而在双特异性抗体内部的、会合第一ch3域的初始界面的第二ch3域的初始界面内部，将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二ch3域的界面内部产生空穴，所述空穴内部是在第一ch3域的界面内部的突出部分可放置的。因此，在一个实施方案中，如本文中报道的抗体特征在于-全长抗体的第一重链的ch3域和全长抗体的第二重链的ch3域各自在包含抗体ch3域之间的初始界面中的改变的界面处会合，其中i)在第一重链的ch3域中将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，因而在一个重链的ch3域的界面内部产生突出部分，所述突出部分是在另一个重链的ch3域的界面内部的空穴中可放置的。并且其中ii)在第二重链的ch3域中将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二ch3域的界面内部产生空穴，在所述空穴内部突出部分是在第一ch3域的界面内部可放置的。在一个实施方案中，具有更大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)。在一个实施方案中，具有更小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、缬氨酸(v)。在一个实施方案中，通过以下方式进一步改变两个ch3域：引入半胱氨酸(c)作为每个ch3域的相应位置中的氨基酸，从而两个ch3域之间的二硫键可以形成。在一个实施方案中，双特异性抗体在“隆突链”的ch3域中包含t366w突变并且在“穴链”的ch3域中包含t366s、l368a、y407v突变。也可以使用ch3域之间的额外链间二硫键((merchant,a.m等人,naturebiotech16(1998)677-681)，例如通过向“隆突链”的ch3域引入y349c突变并向“穴链”的ch3域引入e356c突变或s354c突变(根据kabat等人的eu索引编号,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。在一个实施方案中，双特异性抗体在两个ch3域之一中包含y349c、t366w突变并且在两个ch3域的另一者中包含e356c、t366s、l368a、y407v突变。在一个实施方案中，双特异性抗体在两个ch3域之一中包含y349c、t366w突变并且在两个ch3域的另一者中包含s354c、t366s、l368a、y407v突变(在一个ch3域中的额外y349c突变和另一个ch3域中的额外e356c或s354c突变形成链间二硫键)(根据kabat等人的eu索引编号，(kabat,e.a.等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)))。可以备选地或额外地使用如ep1870459a1所描述的其他的隆突入穴技术。因此，双特异性抗体的另一个例子是在“隆突链”的ch3域中的r409d、k370e突变和在“穴链”的ch3域中的d399k、e357k突变)(根据kabat等人的eu索引编号；(kabat,e.a.等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。在一个实施方案中，双特异性抗体包含在“隆突链”的ch3域中的t366w突变和在“穴链”的ch3域中的t366s、l368a、y407v突变以及额外地在“隆突链”的ch3域中的r409d、k370e突变和在“穴链”的ch3域中的d399k、e357k突变。在一个实施方案中，双特异性抗体包含在两个ch3域之一中的y349c、t366w突变和在两个ch3域的另一者中的s354c、t366s、l368a、y407v突变，或者双特异性抗体包含在两个ch3域之一中的y349c、t366w突变和在两个ch3域的另一者中的s354c、t366s、l368a、y407v突变以及额外地在“隆突链”的ch3域中的r409d、k370e突变和在“穴链”的ch3域中的d399k、e357k突变。ch3域中的这类隆突突变和穴突变一般用于seqidno:169、seqidno:170、seqidno:171或seqidno:172(人igg1亚类同种异型(高加索人种和非洲裔美国人或突变体l234a/l235a和l234a/l235a/p329g)、seqidno:173、seqidno:174或seqidno:175(人igg4亚类或突变体s228p、l235e和s228p/l235e/p329g)的人重链恒定区中(根据kabat等人的eu索引编号，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md(1991)。在一个实施方案中，双特异性抗体包含seqidno:169、seqidno:170、seqidno:171,或seqidno:172、seqidno:173、seqidno:174,或seqidno:175的人重链恒定区，还包含ch3域中的这类“隆突”突变和“穴”突变(例如在两个ch3域之一中的y349c、t366w突变和在两个ch3域的另一者中的s354c、t366s、l368a、y407v突变)(根据kabat等人的eu索引编号，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(octopusantibody)”(见，例如us2006/0025576)。本文的抗体或片段还包括“双重功能fab(dualactingfab)”或“daf”，其包含与半抗原以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，us2008/0069820)。本文中的抗体或片段也包括在wo2009/080251、wo2009/080252、wo2009/080253、wo2009/080254、wo2010/112193、wo2010/115589、wo2010/136172、wo2010/145792和wo2010/145793中描述的多特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体的第一结合特异性针对半抗原并且第二结合特异性针对非半抗原性抗原。在一个实施方案中，非半抗原性抗原选自白细胞标记：cd2、cd3、cd4、cd5、cd6、cd7、cd8、cd11a、b、c、cd13、cd14、cd18、cd19、cd22、cd23、cd27及其配体、cd28及其配体b7.1、b7.2、b7.3、cd29及其配体、cd30及其配体、cd40及其配体gp39、cd44、cd45和同工型、cd56、cd58、cd69、cd72、ctla-4、lfa-1和tcr；组织相容性抗原：mhci类或ii类、lewisy抗原、slex、sley、slea和sleb；整联蛋白：vla-1、vla-2、vla-3、vla-4、vla-5、vla-6、αvβ3和lfa-1、mac-1和pl50.95、αvβ1、gpiibiiia、αrβ3、α6β4、αvβ5、αvβ6和αv627；选凝素：l-选凝素、p-选凝素和e-选凝素及其反受体vcam-1、icam-1、icam-2和lfa-3；白介素：il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14和il-15；白介素受体，选自il-1r、il-2r、il-3r、il-4r、il-5r、il-6r、il-7r、il-8r、il-9r、il-10r、il-11r、il-12r、il-13r、il-14r和il-15r；趋化因子选自pf4、rantes、mip1α、mcp1、nap-2、groα、groβ和il-8；生长因子选自tnfα、tgfβ、tsh、vegf/vpf、vegfa、vegfb、vegf111、vegf121、vegf165、vegf189、vegf206、pthrp、egf家族、pdgf家族、内皮素、纤维化蛋白(fsf-1)、人层粘连蛋和胃泌素释放肽(grp)、plgf、hgh、hghr；生长因子受体选自tnfα、rgfβr、tshr、vegfr/vpfr、egfr、pthrpr、pdgfr家族、epo-r、gcsf-r和其他造血受体；干扰素受体选自ifncαr、ifnβr和ifnλr；ig和其受体选自ige、fcγri和fcγrii；肿瘤抗原选自her2-neu、黏蛋白、cea和内皮唾液酸蛋白(endosialin)；变应原选自屋尘螨抗原、lolp1(草)抗原和漆酚；病毒多肽选自cmv糖蛋白b、h和gciii、hiv-1包膜糖蛋白、rsv包膜糖蛋白、hsv包膜糖蛋白、hpv包膜糖蛋白、肝炎家族表面抗原(hepatitisfamilysurfaceantigen)；毒素选自假单胞菌(pseudomonas)内毒素和骨桥蛋白(osteopontin)/尿桥蛋白(uropontin)、蛇毒液、蜘蛛毒液和蜂毒液、芋螺毒素；血液因子选自补体c3b、补体c4a、补体c4b-9、rh因子、纤维蛋白原、纤维蛋白和髓鞘质相关的生长抑制剂；并且酶选自胆固醇酯转移多肽、膜结合型基质金属蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(gad)。抗体变体在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以实现最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合。a)置换变体、插入变体和缺失变体在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括hvr和fr。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc。表2.氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu；ile；(2)中性亲水：cys、ser、thr、asn；gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；((5)影响链方向的残基：gly、pro；(6)芳族：trp、tyr、phe。非保守性置换将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，为进一步研究所选择的产生的变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个hvr残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。可以在hvr中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在hvr“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(见，例如，chowdhury,p.s.,methodsmol.biol.207(2008)179-196)和/或sdr(a-cdr)中做出，同时对所产生的变体vh或vl测试结合亲和力。已经例如在hoogenboom,h.r.等人，引自methodsinmolecularbiology178(2002)1-37中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错pcr、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及hvr指导的方案，其中将几种hvr残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的hvr残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。尤其经常靶向重链cdr3和轻链cdr3。在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个hvr内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在hvr中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以在hvr“热点”或sdr外部。在上文提供的变体vh和vl序列的某些实施方案中，每个hvr或者不予改变，或者含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。一种用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如cunningham,b.c.和wells,j.a.,science244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，将残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)鉴定并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的n末端或c末端与酶(例如针对adept的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。b)糖基化变体在某些实施方案中，改变本文提供的或包含于如本文所报道的缀合物中的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。在抗体包含fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助n连接至fc区的ch2结构域的asn297。参见，例如，wright,a.和morrison,s.l.,tibtech15(1997)26-32。低聚糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、n-乙酰葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎”中glcnac连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过maldi-tof质谱法所测量的与asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内部asn297处岩藻糖的平均量，例如，如wo2008/077546中所述。asn297指位于fc区内约第297位置处的天冬酰胺残基(fc区残基的eu编号)；然而，asn297也可以位于第297位置的上游或下游±3个氨基酸附近，即，第294和300位置之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的adcc功能。参见，例如，us2003/0157108；us2004/0093621。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki,a.等人,j.mol.biol.336(2004)1239-1249；yamane-ohnuki,n.等人,biotech.bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的lec13cho细胞(ripka,j.等人,arch.biochem.biophys.249(1986)533-545；us2003/0157108；和wo2004/056312，特别在实施例11处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因fut8敲除cho细胞(例如，见yamane-ohnuki,n.等人，biotech.bioeng.87(2004)614-622；kanda,y.等人，biotechnol.bioeng.94(2006)680-688；和wo2003/085107)。还可以提供具双分低聚糖的抗体变体，例如，其中与抗体fc区连接的双天线状低聚糖由glcnac对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的adcc功能。这类抗体变体的例子例如在wo2003/011878；美国专利号6,602,684；和us2005/0123546中描述。也提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的cdc功能。这类抗体变体例如在wo1997/30087；wo1998/58964和wo1999/22764中描述。c)fc区变体在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的fc区中，因而产生fc区变体。该fc区变体可以包含人fc区序列(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4fc区)，所述人fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用所希望的候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和adcc)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实cdc和/或adcc活性降低/耗尽。例如，可以实施fc受体(fcr)结合测定法以确保抗体缺少fcγr结合(因此可能缺少adcc活性)，但是保留fcrn结合能力。介导adcc的原代细胞－nk细胞表达fc(仅riii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达汇总于ravetch,j.v.和kinet,j.p.,annu.rev.immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。评估目的分子的adcc活性的体外测定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(参见，例如，hellstrom,i.等人,proc.natl.acad.sci.usa83(1986)7059-7063；和hellstrom,i.等人,proc.natl.acad.sci.usa82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见bruggemann,m.等人,j.exp.med.166(1987)1351-1361))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(见，例如，用于流式细胞术的actitm非放射性细胞毒性测定法(celltechnology,inc.mountainview,ca；和cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega,madison,wi)。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(pbmc)和天然杀伤(nk)细胞。备选地或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在clynes,r.等人,proc.natl.acad.sci.usa95(1998)652-656公开的动物模型中评估目的分子的adcc活性。也可以实施c1q结合测定法以证实抗体不能结合c1q并因此缺少cdc活性。参见，例如，wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以进行cdc测定法(参见，例如，gazzano-santoro,h.等人,j.immunol.methods202(1996)163-171；cragg,m.s.等人,blood101(2003)1045-1052；以及cragg,m.s.和m.j.glennie,blood103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法确定fcrn结合和体内清除率/半寿期(参见，例如，petkova,s.b.等人，int.immunol.18(2006:1759-1769)。效应子功能减少的抗体包括置换一个或多个fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这类fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“dana”fc突变体(美国专利号7,332,581)。描述了具有fcr结合改善或削弱的某些抗体变体。(见，例如，美国专利号6,737,056；wo2004/056312，和shields,r.l.等人,j.biol.chem.276(2001)6591-6604)。在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善adcc的一个或多个氨基酸置换(例如，在fc区的第298、333和/或334位置处的置换)(残基的eu编号)的fc区。在一些实施方案中，在fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的c1q结合和/或补体依赖细胞毒性(cdc)，例如，如美国专利号6,194,551、wo99/51642和idusogie,e.e.等人，j.immunol.164(2000)4178-4184中所述。在us2005/0014934a1(hinton等人)中描述了半寿期增加和新生fc受体(fcrn)结合改善的抗体，所述新生fc受体负责转移母源igg至胎儿(guyer,r.l.等人,j.immunol.117(1976)587-593和kim,j.k.等人,j.immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的fc区，其中所述置换改善fc区与fcrn的结合。这类fc变体包括在一个或多个fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，fc区残基434的置换)的那些(美国专利号7,371,826)。关于fc区变体的其他例子，还参见duncan,a.r.和winter,g.,nature322(1988)738-740；us5,648,260；us5,624,821和wo94/29351。d)半胱氨酸工程化抗体变体在某些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代mab”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的v205(kabat编号)；重链的a118(eu编号)；和重链fc区的s400(eu编号)。半胱氨酸工程化的抗体可以例如美国专利号7,521,541中所述那样产生。e)抗体衍生物在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于所定义的疾病的疗法中等等。在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(kam,n.w.等人,proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部分加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。半抗原化化合物在如本文中报道的缀合物中的半抗原，如果它本身不是分子之一，可以缀合至治疗剂(药物)、细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像性金属或放疗性金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽或者另一种碳水化合物或亲脂物质。这种缀合物命名为半抗原化化合物。这种缀合可以直接进行或借助间插接头进行。a)治疗性部分半抗原-药物缀合物(adc，半抗原化药物)的药物部分(d)可以是具有细胞毒作用或抑制细胞作用的任何化合物、部分或基团。药物部分包括：(i)可以充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或dna嵌入剂的化疗剂；(ii)可以以酶促方式发挥作用的蛋白质毒素；和(iii)放射性同位素。示例性药物部分包括但不限于美坦生类、澳瑞司他汀(auristatin)、多拉司他汀、单端孢霉烯族化合物、cc1065、刺孢霉素和其他烯二炔类抗生素、紫杉烷、蒽环类及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。蛋白质毒素包括白喉毒素a链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白a链(vitetta等人(1987)science,238:1098)、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒蛋白a链、α-帚曲菌素、油桐(aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-5)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物(wo93/21232)。治疗性放射性同位素包括32p、33p、90y、125i、131i、131in、153sm、186re、188re、211at、212b、212pb和lu的放射性同位素。放射性同位素或其他标记物可以按已知方式掺入(fraker等人(1978)biochembiophysrescommun.80:49-57；"monoclonalantibodiesinimmunoscintigraphy"chatal,crcpress1989)。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(mx-dtpa)是将放射性核素与复合物缀合的示例性螯合剂(wo94/11026)。b)标记物半抗原化化合物可以是半抗原化标记物。能够使用可以与半抗原共价连接的任何标记物部分(参见例如singh等人(2002)anal.biochem.304:147-15；harlowe.和lane,d.(1999)usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.；lundbladr.l.(1991)chemicalreagentsforproteinmodification,第2版,crcpress,bocaraton,fla.)。标记物可以发挥以下作用：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以调整第一或第二标记物提供的可检测信号，例如，以产生fret(荧光共振能量转移)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率例如电泳迁移率或细胞通透性，或(iv)提供捕获部分例如以调节离子络合过程。包含如本文中报道的半抗原化标记物的缀合物可以用于诊断测定法中，例如，用于检测特定细胞、组织或血清中目的抗原的表达。对于诊断性应用，将使用其中第一结合特异性与靶结合并且第二结合特异性与半抗原化标记物结合的双特异性抗体。半抗原一般将用可检测部分标记。许多标记物是可用的，它们通常可以划分成以下类别：(a)放射性同位素(放射性核素)，如3h、11c、14c、18f、32p、35s、64cu、68gn、86y、89zr、99tc、111in、123i、124i、125i、131i、133xe、177lu、211at或131bi。放射性同位素标记的缀合物用于受体靶向的成像实验中。使用currentprotocolsinimmunology,第1和第2卷,coligen等人编著,wiley-interscience,newyork,n.y.,pubs中所述的技术，抗原(半抗原)可以用结合、螯合物或络合放射性同位素金属的配体试剂标记。可以络合金属离子的螯合配体包括dota、dotp、dotma、dtpa和teta(macrocyclics,dallas,tex.)。放射性核素可以通过用如本文中报道的复合物复合进行靶向(wu等人,naturebiotechnology23(9)(2005)1137-1146)。采用放射性核素标记复合物的受体靶成像法可以通过检测和量化复合物或相应的治疗抗体在肿瘤组织中的进行性积累而提供途径活化的标记(albert等人(1998)bioorg.med.chem.lett.8:1207-1210)。合适作为成像实验用标记物的金属-螯合物复合物(us2010/0111856；us5,342,606；us5,428,155；us5,316,757；us5,480,990；us5,462,725；us5,428,139；us5,385,893；us5,739,294；us5,750,660；us5,834,456；hnatowich等人,j.immunol.methods65(1983)147-157；meares等人,anal.biochem.142(1984)68-78；mirzadeh等人,bioconjugatechem.1(1990)59-65；meares等人,j.cancer(1990),suppl.10:21-26；izard等人,bioconjugatechem.3(1992)346-350；nikula等人,nucl.med.biol.22(1995)387-90；camera等人,nucl.med.biol.20(1993)955-62；kukis等人,j.nucl.med.39(1998)2105-2110；verel等人,j.nucl.med.44(2003)1663-1670；camera等人,j.nucl.med.21(1994)640-646；ruegg等人,cancerres.50(1990)4221-4226；verel等人,j.nucl.med.44(2003)1663-1670；lee等人,cancerres.61(2001)4474-4482；mitchell等人,j.nucl.med.44(2003)1105-1112；kobayashi等人bioconjugatechem.10(1999)103-111；miederer等人,j.nucl.med.45(2004)129-137；denardo等人,clinicalcancerresearch4(1998)2483-90；blend等人,cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals18(2003)355-363；nikula等人j.nucl.med.40(1999)166-76；kobayashi等人,j.nucl.med.39(1998)829-36；mardirossian等人,nucl.med.biol.20(1993)65-74；roselli等人,cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals,14(1999)209-20)。(b)荧光标记物如稀土元素螯合物(铕螯合物)、荧光素型荧光标记物，包括fitc、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型荧光标记物，包括tamra；丹磺酰；丽丝胺；花箐；藻红蛋白；得克萨斯红；及其类似物。荧光标记物可以使用在例如ccurrentprotocolsinimmunology,上文中公开的技术与抗原(半抗原)缀合。荧光染料和荧光标记物试剂包括从invitrogen/molecularprobes(eugene，oregon，美国)和piercebiotechnology,inc(rockford,ill.)市售的那些。检测标记物如荧光染料和化学发光染料(briggs等人(1997)“synthesisoffunctionalisedfluorescentdyesandtheircouplingtoaminesandaminoacids(官能化荧光染料的合成和它们与胺和氨基酸的偶联)”,j.chem.soc.,perkin-trans.1(1997)1051-1058)提供了可检测信号，并且通常适用于标记，特别具有以下特性：(i)标记的缀合物应当在低背景情况下产生极高信号，从而可以在无细胞和基于细胞的测定法中灵敏地检测到少量缀合物；和(ii)标记的缀合物应当是光稳定的，从而可以观察、监测并记录荧光信号，而没有明显的光漂白过程。对于涉及标记的缀合物与膜或细胞表面(尤其活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物应当(iii)具有良好的水溶性以实现有效的缀合物浓度和检测灵敏度并且(iv)对活细胞无毒，从而不破坏细胞的正常代谢过程或造成过早细胞死亡。(c)多种酶-底物标记物是可获得或公开的(参见，例如us4,275,149)。酶通常催化生色底物的化学改变，其中可以使用多种技术测量所述化学改变。例如，酶可以催化底物中可以按分光光度形式测量的颜色变化。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物因化学反应被电子激发并且可以随后发射(例如使用化学发光计)可测量的光或馈赠能量至荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；us4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于酶与多肽缀合的技术在o'sullivan等人(1981)“methodsforthepreparationofenzyme-antibodyconjugatesforuseinenzymeimmunoassay(制备用于酶免疫测定法中的酶缀合物的方法)”，引自methodsinenzym.(j.langone和itvanvunakis编著),academicpress,newyork,73(1981)147-166中描述。酶-底物组合的例子(us4,275,149；us4,318,980)例如包括：(i)辣根过氧化物酶(hrp)和作为底物的过氧化氢酶，其中所述过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(opd)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(tmb))；(ii)碱性磷酸酶(ap)和作为生色底物的对硝基苯磷酸酯；和(iii)β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)和生色底物(例如，对硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-d-半乳糖苷酶。如本文中报道的标记缀合物可以用于任何已知的测定法中，如elisa、竞争性结合分析、直接和间接夹心测定法和免疫沉淀测定(zola,monoclonalantibodies:amanualoftechniques(1987)第147-158页,crcpress,inc.)。如本文中报道的标记缀合物由生物医学成像和分子成像的多种方法和技术用作成像性生物标记和探针，如：(i)mri(磁共振成像术)；(ii)microct(计算机断层成像)；(iii)spect(单光子发射计算机断层成像)；(iv)pet(正电子发射断层摄影术)tinianow,j.等人,nuclearmedicineandbiology,37(3)(2010)289-297；chen等人,bioconjugatechem.15(2004)41-49；us2010/0111856；(v)生物发光法；(vi)荧光法；和(vii)超声法。免疫闪烁照相术是一种成像方法，其中将放射性物质标记的缀合物施用至动物或人患者并且拍摄身体内缀合物存在的部位的画面(us6,528,624)。成像性生物标记物可以客观地测量并且作为正常生物学过程、发病过程或治疗性介入的药理学反应的指示物进行评价。生物标记物可以具有几个类型：0型标记物是疾病的自然历史标记物并且与已知的临床指标纵向相关，例如类风湿性关节炎中滑膜炎症的mri评价；i型标记物根据作用机制捕获介入的效果，即便该机制可能与临床结局不相关；ii型标记物充当替代终点，其中生物标记物的变化或来自生物标记物的信号预测出“确认”靶向反应的临床益处，如类风湿性关节炎中通过ct测量的骨侵蚀。成像性生物标记物因而可以提供关于以下方面的药效动力学(pd)治疗信息：(i)靶蛋白的表达、(ii)治疗剂与靶蛋白的结合(即选择性)、和(iii)清除率和半寿期药物代谢动力学数据。相对于基于标记物的生物标记物而言，体内成像性生物标记物的优点包括：非侵入性治疗、可定量、全身评估、反复给药和评估(即多个时间点)和从临床前结果(小动物)至临床结果(人类)的潜在可转移效果。对于一些应用，生物成像法取代了临床前研究中的动物实验或使其数目最小化。肽标记方法是熟知的。参见haugland(2003)molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley(1992)bioconjugatechem.3:2；garman,(1997)non-radioactivelabeling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；glazer等人chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.work和e.work编著)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.和noyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,第i卷和第ii卷,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)"chemicalmodificationofproteins",modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche编著,walterdegruyter,berlinandnewyork；以及wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguez等人,chem.eur.j.10(2004)1149-1155；lewis等人,bioconjugatechem.12(2001)320-324；li等人,bioconjugatechem.13(2002)110-115；mier等人bioconjugatechem.16(2005)240-237。抗体缀合物在如本文中报道的缀合物中的抗体，如果它本身不是分子之一，还可以缀合至治疗剂(药物)、细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像性金属或放疗性金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽或者另一种碳水化合物或亲脂物质。免疫缀合物本发明也提供免疫缀合物，所述缀合物包含如本文中报道的抗体或如本文中报道的与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素)或放射性同位素缀合的缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(adc)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(参见us5,208,020、us5,416,064和ep0425235b1)；澳瑞司他汀，如单甲基澳瑞司他汀药物部分de和df(mmae和mmaf)(参见us5,635,483、us5,780,588和us7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(参见us5,712,374、us5,714,586、us5,739,116、us5,767,285、us5,770,701、us5,770,710、us5,773,001和5,877,296；hinman,l.m.等人,cancerres.53(1993)3336-3342；和lode,h.n.等人,cancerres.58(1998)2925-2928；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(参见kratz,f.等人,curr.med.chem.13(2006)477-523；jeffrey,s.c.等人,bioorg.med.chem.lett.16(2006)358-362；torgov,m.y.等人,bioconjug.chem.16(2005)717-721；nagy,a.等人,proc.natl.acad.sci.usa97(2000)829-834；dubowchik,g.m.等人,bioorg.&med.chem.letters12(2002)1529-1532；king,h.d.等人,j.med.chem.45(2002)4336-4343；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇、紫杉醇、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和ortataxel；单端孢霉烯族化合物；和cc1065。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素a链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒蛋白a链、α-帚曲菌素、油桐(aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-5)、苦瓜(momordicacharantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的抗体或如本文中报道的与放射性原子缀合以形成放射缀合物的复合物。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或i123，或核磁共振(nmr)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，mri)，又如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。可以使用多种双官能蛋白质偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物(smcc)、亚氨基硫烷(it)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如vitetta,e.s.等人,science238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见wo94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(chari,r.v.等人,cancerres.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。免疫缀合物或adc在本文中明确地构思，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于可商业获得的bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自piercebiotechnology,inc.，rockford，伊利诺伊州，美国)。接头术语“接头”指可以用来将抗原(例如半抗原)与其他部分如可检测标记物或药物缀合(连接)的双官能或多官能部分。可以使用具有与药物、与抗原(半抗原)和与抗半抗原抗体结合的反应性官能的接头便利地制备抗原(半抗原)缀合物。在一个实施方案中，接头具有反应位点，所述反应位点具有与抗半抗原抗体上存在的亲核基团反应的亲电基团。抗体上的例如半胱氨酸巯基与接头上的亲电基团反应并且与接头形成共价键。有用的亲电基团包括但不限于另一个巯基、马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。(参见例如在klussman等人，bioconjugatechemistry15(4)(2004)765-773的第766页的缀合方法)。巯基官能团的例子包括但不限于巯基、马来酰亚胺、α-卤代乙酰基、活化酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。接头可以包含将抗原(半抗原)与有效载荷连接的氨基酸残基。氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括天然存在的那些以及非天然存在的氨基酸类似物，如例如瓜氨酸或β-氨基酸，如例如β-丙氨酸，或ω-氨基酸如4-氨基-丁酸。在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，所述反应性官能团具有与抗原(半抗原)或抗体(抗半抗原抗体)上存在的亲电基团反应的亲核基团。有用的亲电基团包括但不限于醛基和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与半抗原或抗体上的亲电基团反应并与抗原(半抗原)或抗体形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、硫代半卡巴腙、肼羧化物和芳酰肼。抗原(半抗原)上的亲电基团为接合至接头提供了便利位点。一般地，肽型接头可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可以例如根据肽化学领域熟知的液相合成方法制备(e.schroder和k.lubke"thepeptides",第1卷(1965)76-136,academicpress)。在另一个实施方案中，接头可以用调节溶解度或反应性的基团替换。例如，带电取代基如磺酸盐(-so3-)或铵或聚合物如peg，可以增加试剂的水溶解度并且促进接头试剂与抗原(半抗原)或药物部分的偶联反应，或根据所用的合成途经，促进偶联反应。明确构思了如本文中报道的包含药物或标记物的缀合物，但是不限于用以下接头试剂制备的复合物：bmpeo、bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，并且包括双马来酰亚胺试剂：dtme、bmb、bmdb、bmh、bmoe、bm(peo)3和bm(peo)4，它们从piercebiotechnology,inc.可商业获得。双马来酰亚胺试剂允许例如巯基以依次或同时方式与含巯基的药物部分、标记物或接头中间体接合。除马来酰亚胺之外，与例如巯基反应的其他官能团还包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。示例性接头包括含有马来酰亚胺伸张物和对氨基苄基氨甲酰基(pab)自毁性间隔团的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂和具有马来酰亚胺伸张物单元和对氨基苄基自毁性间隔团的phe-lys(mtr)二肽接头试剂。半胱氨酸巯基是亲核的，并且通过硫化物交换，能够与接头试剂和半抗原化化合物上的亲电基团反应以形成共价键，其中所述接头试剂和药物-接头中间体包括：(i)活性酯如nhs酯、hobt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基；和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物。半抗原化化合物上的亲核基团包括但不限于能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、硫代半卡巴腙、肼羧化物和芳酰肼基。iii.核酸可以通过本领域已知的多种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的dna，所述抗体如本文中报道或如包含于如本文所报道的缀合物中。这些方法包括但不限于通过位点定向(或寡核苷酸介导)诱变、pcr诱变和盒诱变较早制备的编码所述多肽的dna来制备。也可以通过限制性片段操作或通过采用合成性寡核苷酸的重叠延伸pcr，构建重组抗体的变体。诱变引物编码了半胱氨酸密码子替换。标准的诱变技术可以用来产生编码此类修饰的工程化抗体的dna。一般指导可以在sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989；和ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwiley-interscience，newyork,n.y.,1993中找到。iv.表达和纯化可以例如使用重组方法和组合物产生抗体，如us4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗体的分离核酸。这种核酸可以编码包含抗体vl的氨基酸序列和/或包含抗体vh的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用其转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的vl的氨基酸序列和包含抗体的vh的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的vl的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的vh的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴样细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生如本文中报道的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。为了重组产生如本文中报道的抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和fc效应子功能时。对于细菌中表达抗体片段和多肽，例如，参见us5,648,237、us5,789,199和us5,840,523。(还参见charlton,k.a.，引自methodsinmolecularbiology，第248卷，lo,b.k.c.(编著)，humanapress,totowa,nj(2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊状物中以可溶性级分分离并且可以进一步纯化。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见gerngross,t.u.,nat.biotech.22(2004)1409-1414；和li,h.等人,nat.biotech.24(2006)210-215。表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的众多杆状病毒毒株。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(如在例如graham,f.l.等人，j.genvirol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠支持细胞(如在例如mather,j.p.,biol.reprod.23(1980)243-252中所述的tm4细胞那样)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；布法罗大鼠肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺瘤(mmt060562)；如在例如mather,j.p.等人,annalsn.y.acad.sci.383(1982)44-68中所述的tri细胞；mrc5细胞；和fs4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，其中包括dhfr-cho细胞((urlaub,g.等人，proc.natl.acad.sci.usa77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如y0、ns0和sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，例如，见yazaki,p.和wu,a.m.,methodsinmolecularbiology,第248卷,lo,b.k.c.(编著),humanapress,totowa,nj(2004),第255-268页。v.用于诊断和检测的方法和组合物在某些实施方案中，如本文中报道的任一种抗体、尤其双特异性抗体和缀合物，可用于检测生物样品中一个或多个靶分子的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在一个实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的如本文中报道的抗体或缀合物。在某些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文中报道的抗体或缀合物在允许该抗体或缀合物与靶结合的条件下接触，并且检测该抗体或缀合物与靶之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在某些实施方案中，提供标记的抗体或缀合物。标记物包括但不限于直接检测的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记物)，以及间接检测的部分(例如借助酶促反应或分子相互作用间接检测)，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32p、14c、125i、3h和131i、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(us4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如hrp、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。vi.药物制剂通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文报道的抗体或缀合物的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体或缀合物与一种或多种任选的可药用载体混合(remington'spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.(编著)(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(peg)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如，人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuph20(baxterinternational,inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20。在一个方面，shasegp与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。在us6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水质抗体制剂包括在us6,171,586和wo2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地含有这些有效成分，它们具有并未相互不利影响的互补活性。这种有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在remington'spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.(编著)(1980)中公开。可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体或缀合物的固态疏水性聚合物半透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。vii.治疗方法和组合物本文中报道的任何抗体或缀合物可以用于治疗方法中。在一个方面，提供如本文中报道的抗体或缀合物用作药物。在其他方面，提供如本文中报道的抗体或缀合物用于治疗疾病。在某些实施方案中，提供如本文中报道的抗体或缀合物用于治疗方法中。在某些实施方案中，本发明提供如本文中报道的抗体或缀合物用于治疗个体的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的抗体或缀合物。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。在又一个方面，本发明提供如本文中报道的抗体或缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有疾病的个体施用有效量的药物。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。在又一个方面，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的如本文中报道的抗体或缀合物。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如下文描述的至少一种额外的治疗剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。在又一个方面，本发明提供了包含如本文中报道的任何抗体或缀合物的药物制剂，例如，用于前述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含如本文中报道的任何抗体或缀合物和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含如本文中报道的任何抗体或缀合物和至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。如本文中报道的抗体和缀合物可以在疗法中单独或与其他制剂组合使用。例如，如本文中报道的抗体或缀合物可以与至少一种额外的治疗剂共施用。上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后进行。如本文中报道的抗体和缀合物也可以与放射疗法组合使用。如本文中报道的抗体或缀合物(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、快速浓注(bolus)施用和脉冲输注。如本文中报道的抗体或缀合物以符合医学规范的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药剂的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体或缀合物不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药剂的有效量取决于该制剂中存在的抗体或缀合物的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。为了预防或治疗疾病，如本文中报道的抗体或缀合物的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体或缀合物的类型、疾病的严重性和过程，抗体或缀合物是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体或缀合物的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)抗体或缀合物可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常持续直至所需的疾病症状抑制作用出现。抗体或缀合物的一个示例性剂量处于约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以断续地施用，例如，每周或每3周(例如，从而患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的抗体)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。可以理解，可以使用本发明的免疫缀合物替代如本文中报道的抗体或缀合物，或如本文中报道的抗体或缀合物之外还使用本发明免疫缀合物来实施前述任一种制剂或治疗方法。viii.制造品在本发明的另一个方面，提供一种制造品，所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装物插页。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以自多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一个活性物质是如本文中报道的抗体或复合物。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含如本文中报道的抗体或复合物；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定疾病的包装物插页。备选地或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。可以理解，替代如本文中报道的抗体或缀合物或除如本文中报道的抗体或缀合物之外，前述任一者制造品还可以包含本发明的免疫缀合物。本文提到的全部参考文献的公开内容因此通过引用的方式完整并入。提供以下实施例、附图和序列以辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解，可以对所述方法作出修改而不脱离本发明的精神。实施例实施例1分离和表征编码来自小鼠杂交瘤的具有κ轻链的igg1类鼠抗洋地黄毒苷抗体和鼠抗生物素抗体的vh域和vl域的cdna分别在wo2011/003557和wo2011/003780中描述了分离和表征编码抗洋地黄毒苷抗体vh域和vl域的cdna、rna制备、产生dna片段、克隆该dna片段至质粒中和测定dna序列和氨基酸序列。从杂交瘤克隆直接获得结合半抗原的鼠抗体的vh域和vl域的蛋白质序列和(dna)序列信息。随后进行的实验步骤是(i)从产生抗体的杂交瘤细胞分离rna，(ii)将这种rna转化至cdna中、转移至携带vh和vl的pcr片段中，和(iii)将这些pcr片段整合入用于大肠杆菌中增殖的质粒载体并测定它们的dna序列(和推导的)蛋白质序列。来自杂交瘤细胞的rna制备物：采用rneasy-kit(qiagen)，从5x106个表达抗体的杂交瘤细胞制备rna。简而言之，将沉淀的细胞在pbs中洗涤1次并沉淀并且随后重悬以便在500μlrlt-缓冲剂(+β-me)中裂解。如制造商的手册中所述，通过穿过qiashredder(qiagen)并且随后经历基质介导的纯化过程(etoh，rneasy柱)，使细胞彻底裂解。在最后的洗涤步骤后，将rna从柱回收于50μl无rna酶的水中。通过对1:20稀释的样品的a260和a280定量确定回收的rna的浓度。通过在甲酰胺-琼脂糖凝胶上的变性rna凝胶电泳，分析所分离的rna样品的完整性(质量、降解程度)(参见maniatis手册)。获得了代表完整18s和28s核糖体rna的独立条带并且这些条带的完好性(和大约2:1强度比)指示rna制备物的良好质量。将从杂交瘤分离的rna冷冻并以等分试样贮存在-80℃。通过racepcr产生编码vh和vl的dna片段、将这些dna片段克隆至质粒中并测定它们的dna序列和氨基酸序列通过采用如国际专利申请pct/ep2011/074273中所述的技术，从rna制备物中制备用于后续(race-)pcr反应的cdna。随后，将编码vh和vl的pcr片段通过琼脂糖凝胶提取法分离并随后通过标准分子生物学技术纯化。通过采用pcrbluntiitopo试剂盒(invitrogen)，完全遵循制造商的说明书，将pwo生成的纯化pcr片段插入载体pcrbluntiitopo中。将topo-连接反应转化至大肠杆菌topo10-one-shot感受态细胞中。此后，将含有载体的大肠杆菌克隆作为lb-卡那霉素琼脂平板上的菌落鉴定，所述载体具有含vl或vh的插入物。从这些菌落制备质粒并且通过用ecori限制酶切消化证实载体中所需插入物的存在。因为载体主链含有在插入物每一侧分布的ecori限制性识别位点，所以通过具有ecori可释放的约800bp(对vl而言)或600bp(对vh而言)插入物定义携带插入物的质粒。通过对vh和vl的多个克隆的自动化dna测序，测定vl和vh的dna序列和推导的蛋白质序列。在seqidno:40中描述抗生物素抗体的鼠vl序列。在seqidno:36中描述抗生物素抗体的鼠vh序列。在seqidno:08中描述抗洋地黄毒苷抗体的鼠vl序列。在seqidno:04中描述抗洋地黄毒苷抗体的鼠vh序列。实施例2分离和表征编码来自小鼠杂交瘤的具有κ轻链的igg1类鼠抗茶碱抗体的vh域和vl域的cdna如实施例1中所概述那样获得抗茶碱抗体的序列。在seqidno:72中描述抗茶碱抗体的鼠vl序列。在seqidno:68中描述抗茶碱抗体的鼠vh序列。实施例3鼠抗洋地黄毒苷抗体和抗生物素抗体vh域和vl域的人源化已经在wo2011/003557和wo2011/003780中详细描述结合洋地黄毒苷的抗体的人源化变体的产生。结合生物素的鼠抗体mum33以相似的方式如下人源化：在wo2011/003557和wo2011/003780中描述了产生和表征包含来自小鼠杂交瘤的具有κ轻链的igg1类鼠抗生物素抗体的vh域和vl域的编码序列和氨基酸序列。基于这种信息，相应的人源化抗生物素抗体(hum33)基于人种系构架ighv1-69-02和igkv1-27-01组合产生。对于vl，不必需在人igkv1-27-01的构架和igkj2-01种系的人j元件中集成任何回复突变。人源化vh基于人ighv1-69-02种系和ighj4-01-3种系的人j元件。引入两个回复突变至构架区1中第24位置处(a24s)和构架区3中第73位置处(k73t)。人源化vh的氨基酸序列在seqidno:44中描述并且人源化vl的氨基酸序列在seqidno:48中描述。实施例4鼠抗茶碱抗体的vh域和vl域的人源化结合茶碱的鼠抗体如下人源化：基于人种系构架ighv4-31-02和igkv2-30-01组合产生人源化抗茶碱抗体。人源化vh基于人ighv4-31-02种系和ighj4-01-3种系的人j元件。引入一个回复突变至构架区3中第71位置处(v71r)。人源化vl基于人ighv2-30-01种系和igkj2-01种系的人j元件。引入一个回复突变至构架区2中第46位置处(r46l)。人源化vh的氨基酸序列在seqidno:76中描述并且人源化vl的氨基酸序列在seqidno:80中描述。实施例5在洋地黄毒苷存在下鼠抗洋地黄毒苷fv区的结合区和在生物素存在下鼠抗生物素fv区的结合区的结晶和x射线结构测定结合洋地黄毒苷的抗体的fab片段结构的测定已经在wo2011/003557和wo2011/003780中详细描述，还在metz,s.等人,proc.natl.acad.sci.usa108(2011)8194-8199中发表(3ra7)。测定鼠抗生物素抗体的结构。因此，采用现有技术的熟知方法(木瓜蛋白酶消化法)，通过蛋白酶消化纯化的igg并随后纯化，产生fab片段。为了结晶，将20mmhis-hcl，140mmnacl，ph6.0中的apofab片段(纯化的fab)浓缩至13mg/ml。通过在蒸气扩散坐滴实验中将0.2μl蛋白质溶液与0.2μl储液混合，在21℃建立结晶液滴。晶体在5日内从0.1mtrisph8.5，0.01m氯化钴、20％聚乙烯吡咯烷酮k15显现并且在8日内长成至最终尺寸0.3mmx0.06mmx0.03mm。晶体收获，同时以15％丙三醇作为低温保护剂，并且随后在液氮中快速冷冻。衍射图用pilatus6m检测器在温度100k以swiss光源的光束线x10sa采集并且用程序xds(kabsch,w.,j.appl.cryst.26(1993)795-800)处理，并以scala(从brukeraxs获得)放大，产生达分辨率的数据。这个fab片段晶体属于单斜晶空间群p21，晶胞尺度和β＝117.53°，并且每个结晶学非对称单元含有4个fab分子(参见表3)。通过分子置换以pdb项3pqp作为检索模型，使用来自ccp4软件套件的标准结晶学程序解析结构，以计算电子密度并修正x射线结构(ccp4,collaborativecomputationalproject,actacrystallogr.d,760-763(1994))。将结构模型使用coot重建成电子密度(emsley,p.等人,actacrystallogr.dbiol.crystallogr.60(2010)486-501)。坐标用refmac5(murshudov,g.n.等人,actacrystallogr.dbiol.crystallogr.53(1997)240-55)并用autobuster(globalphasingltd.)修正。表3：单斜晶mum33fab片段apo-晶体的数据集合和结构修正统计结果1括号中的值指最高分辨率库(bins)。2rmerge＝∑|i-<i>|/∑i，其中i是强度。3rcryst＝∑|fo-<fc>|/∑fo其中fo是观察的结构因子振幅并且fc是计算的结构因子幅度。4rfree基于修正期间省略的5％总数据而计算的。5用procheck[laskowski,r.a.等人,j.appl.crystallogr.26,283-291(1993)]计算。为了使与生物素衍生物复合的fab片段结晶，用于浸泡实验的fab片段的apo晶体在筛选后3日内从0.8m琥珀酸衍生并且在5日内长成至最终尺寸0.25mmx0.04mmx0.04mm。将生物胞素酰胺以100mm溶解于水中。随后，将该化合物在结晶溶液中稀释至10mm工作浓度并施加至结晶液滴中的晶体。晶体用2μl10mm化合物溶液洗涤3次并且在21℃与生物胞素酰胺一起最终温育16小时。收获晶体，同时以15％丙三醇作为低温保护剂，并且随后在液氮中快速冷冻。衍射图用pilatus6m检测器在温度100k以swiss光源的光束线x10sa采集并且用程序xds(kabsch,w.,j.appl.cryst.26(1993)795-800)处理，并以scala(从brukeraxs获得)放大，产生达分辨率的数据。这个fab片段晶体属于单斜晶空间群p21，晶胞尺度和β＝117.15°，并且每个结晶学非对称单元含有4个fab分子(参见表4)。通过分子置换以apofab片段的坐标作为检索模型，使用来自ccp4软件套件的标准结晶学程序解析结构，以计算电子密度并修正x射线结构至分辨率将结构模型使用coot(emsley,p.,lohkamp,b.,scott,w.g.和cowtan,k.features)和coot的改进型(actacrystallogr.dbiol.crystallogr.60,486-501(2010))重建成电子密度。坐标用refmac5(murshudov,g.n.等人,actacrystallogr.dbiol.crystallogr.53,240-255(1997))并用autobuster(globalphasingltd.)修正。表4：单斜晶mum33fab片段生物胞素酰胺(biocytinamid)复合物晶体的数据集合和结构修正统计结果1括号中的值指最高分辨率库(bins)。2rmerge＝∑|i-<i>|/∑i，其中i是强度。3rcryst＝∑|fo-<fc>|/∑fo其中fo是观察的结构因子振幅并且fc是计算的结构因子幅度。4rfree基于修正期间省略的5％总数据计算。5用procheck[laskowski,r.a.,macarthur,m.w.,moss,d.s.和thornton,j.m.procheck:aprogramtocheckthestereochemicalqualityofproteinstructure(procheck：检验蛋白结构的立体化学属性的程序).j.appl.crystallogr.26,283-291(1993)]计算。在图33中显示实验性结构测定的结果。复合物的晶体形式在非对称单元中含有4个独立的生物胞素酰胺:抗生物素fab复合物，其中生物胞素酰胺由全部fab分子类似地结合。生物胞素酰胺在重链cdr1和3和全部3个轻链cdr形成的袋中结合。配体的结合袋由来自重链的残基asn29、asp31、thr32、phe33、gln35、trp99和trp106和来自轻链的asn31、tyr32、leu33、ser34、tyr49、ser50、phe91和tyr96限定。生物素头部基团在口袋的一个末端与cdr2和cdr1的残基形成氢键：生物胞素酰胺的n3与ser50的羟基氧相互作用，而o22与相同残基的主链酰胺氮接触。此外，生物胞素酰胺的o22还与ser34的羟基氧形成氢键。除此之外，还在生物胞素酰胺和内衬结合袋的芳族侧链之间观察到疏水相互作用。在生物素的(ch2)4脂族尾末端的酰胺键堆叠到重链cdr1的phe33上和并由phe33和asp31的主链酰胺氮的额外氢键稳定化。这定位了作为活性实体的连接位点的酰胺氮，其方式是跟随于氮后的原子从结合袋向外指向溶剂。以分辨率实验性测定结合区的结果使得表征配体与其抗体的结合模型成为可能，这是详细建模并通过重组生物素结合模块的蛋白质工程作出进一步改进的前提。实施例6具有为共价缀合引入的官能性的抗半抗原抗体的定义和产生进行上文描述的抗半抗原抗体的人源化vh序列和vl序列的衍生化以产生允许抗原/半抗原在定义的位置与抗体共价偶联的化合物。实验测定的与洋地黄毒苷结合的抗洋地黄毒苷fab片段的结构(3ra7)(metz,s.等人,proc.natl.acad.sci.usa108(2011)8194-8199)用来鉴定这样的位置，在所述位置中的改变过程使得位点定向偶联反应在抗体和其复合的抗原/半抗原之间发生成为可能。与生物胞素酰胺结合的抗生物素fab片段的结构(参见实施例5)用来证实对于结合生物素的抗体片段而言引入的半胱氨酸残基的正确位置并且提供所鉴定位置的一般适用性的证据。待突变的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应当靠近结合区以利用抗原/半抗原安置效应以定向偶联，和(ii)突变位置和偶联位置必须以不影响抗原/半抗原结合本身的方式安置。找到合适位置的这些要求是事实上彼此‘矛盾’，因为要求(i)由接近于结合位点的位置最佳满足，同时要求(ii)最安全地由远离结合位点的位置实现。尽管这些实际上排他性的要求，我们仍能够鉴定到可以在不影响半抗原安置的情况下突变，然而同时允许定向共价偶联半抗原化化合物的位置。根据kabat编号法，第一位置位于位置vh52b或vh53处，这取决于相应抗体的cdr2的实际长度。在抗洋地黄毒苷抗体结构中，半抗原结合于疏水性残基形成的深口袋中。在这项结晶学研究中使用荧光洋地黄毒苷-cy5缀合物，其中荧光团以及洋地黄毒苷和cy5之间的接头在结构中不可见，原因在于高度灵活性和所致的晶体中无序性。然而，接头和cy5与指向重链的cdr2方向的洋地黄毒苷的o32连接。在洋地黄毒苷的o32(见上文)与根据kabat编号法的位置52b中氨基酸残基的cα之间的距离是将位置vh52b/vh53处的氨基酸替换为cys，产生了具有如抗洋地黄毒苷抗体-vh52bc的seqidno:20和28、抗茶碱抗体-vh53c的seqidno:84和92、抗生物素抗体-vh53c的seqidno:52和60和抗荧光素抗体-vh52bc的seqidno:108中列出的重链可变区序列的抗体衍生物。被鉴定为修饰点的又一个位置是根据kabat编号的第vh28位置。因此，我们在kabat位置vh28引入一个半胱氨酸。将位置vh28处的氨基酸替换为cys，产生了具有作为抗洋地黄毒苷抗体-vh28c的seqidno:124和132、抗茶碱抗体-vh28c的seqidno:156和164、抗生物素抗体-vh28c的seqidno:140和148和抗荧光素抗体-vh28c的seqidno:116列出的重链可变区序列的抗体衍生物。已经发现这些位置中的一个位置是“通用”位置，即，这个位置适用于任何抗体并且因此，不需要每次从零开始，不得不通过提供晶体结构和确定能够进行半抗原定向共价偶联的适宜位置来修饰新抗体。根据kabat重链可变区编号法，突变vh52bc或vh53c分别可以出乎意料地用于每种结合半抗原的抗体(抗半抗原抗体)。即使抗体及其结合袋的结构相当多样，仍已经显示vh52bc/vh53c突变可以用于抗原/半抗原与结合洋地黄毒苷、生物素、荧光素以及茶碱的抗体共价接合。可以表达并用标准蛋白a层析和大小排阻层析纯化由这些序列组成的结合实体(参见实施例7)。所产生的分子是完全有功能的并按照与其未修饰的母分子相同的方式保留针对其相关半抗原的亲和力。通过表面等离子体共振(spr)实验展示这一点(参见实施例9)。实施例7重组抗半抗原抗体的组成、表达和纯化将鼠和人源化抗半抗原抗体可变区与人源的恒定区组合以形成单特异性或双特异性嵌合抗体或人源化抗体。产生特异性结合半抗原以及不同的非半抗原靶(例如受体酪氨酸激酶或igf-1r)的单特异性人源化抗半抗原抗体和双特异性人源化抗半抗原抗体要求(i)为这类分子设计和定义氨基酸和核苷酸序列，(ii)在转染的培养哺乳动物细胞中表达这些分子，和(iii)从转染细胞的上清液纯化这些分子。这些步骤如先前在pct/ep2011/074273中所描述那样进行。通常，为了产生具有(原始)鼠抗半抗原抗体的结合特异性的igg类人源化抗体，将人源化vh序列以符合可读框方式与igg1亚类的人fc区的ch1-铰链区-ch2-ch3的n末端融合。类似地，将人源化vl序列以符合可读框方式与人clκ恒定区的n末端融合。为了产生含有半抗原结合特异性以及针对其他靶(抗半抗原抗体)的特异性的双特异性抗体衍生物，将scfv或fab片段以符合可读框方式与前述抗体的重链c末端融合。在许多情况下，通过引入先前已经描述的vh44-vl100二硫键(例如reiter,y.等人,naturebiotechnology14(1996)1239-1245)进一步稳定所应用的抗半抗原scfv。表达质粒在哺乳动物细胞表达载体中分别装配包含用于表达重链和轻链的表达盒的表达质粒。因而，编码各个元件的基因区段如上文概述那样连接。可以从中推导出密码子选择的关于人轻链和重链核苷酸序列的一般信息在kabat,e.a.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白质的序列),第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublicationno91-3242中给出。κ-轻链的转录单位包含以下元件：-来自人巨细胞病毒(hcmv)的立即早期增强子和启动子，-包含kozak序列的合成性5'-ut，-包含信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，-克隆的可变轻链cdna，其在5'端配置独特的bsmi限制性位点并且在3'端配置剪接供体位点和独特的noti限制性位点，-基因组人κ-基因恒定区，包含内含子2小鼠ig-κ增强子(picard,d.和schaffner,w.nature307(1984)80-82)，和-人免疫球蛋白κ-聚腺苷酸化(“polya”)信号序列。γl-重链的转录单位包含以下元件：-来自人巨细胞病毒(hcmv)的立即早期增强子和启动子，-包含kozak序列的合成性5'-ut，-包含信号序列内含子的修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，-克隆的单特异性可变重链cdna或克隆的双特异性融合物scfv-可变重链cdna，其在5'端配置独特的bsmi限制性位点并且在3'端配置剪接供体位点和独特的noti限制性位点，-基因组人γl-重链基因恒定区，包含小鼠igμ-增强子(neuberger,m.s.,emboj.2(1983)1373-1378)，和-人γl-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“polya”)信号序列。除了κ-轻链表达盒或γ1-重链表达盒外，这些质粒还含有-潮霉素抗性基因，-epstein-barr病毒(ebv)的复制起点orip，-来自载体puc18的允许这个质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，和-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。重组dna技术使用如sambrook等人,1999(上文)中所述的标准克隆技术进行克隆。全部分子生物学试剂(如果不另外指出的话)均是市售的并且根据制造商的说明书使用。含有编码序列、突变或其他遗传元件的dna由雷根斯堡geneartag合成。通过在sequiserve(sequiservegmbh，德国)进行的双链测序法测定dna序列。dna和蛋白质序列分析和序列数据管理vectorntiadvance套装9.0版用于序列生成、作图、分析、注释和图示。抗半抗原抗体和衍生物的表达通过瞬时转染悬浮的人胚肾293(hek293)细胞表达抗半抗原抗体。为此，在如上文概述的携带原核和真核选择标记的表达载体中构建对应单特异性抗体或双特异性抗体的轻链和重链。将这些质粒在大肠杆菌中扩增、纯化并随后应用于瞬时转染。标准细胞培养物技术用于操做细胞，如currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.和yamada,k.m.(编著),johnwiley&sons,inc.中所述。将细胞在37℃/8％co2于适宜的表达培养基中培育。在转染当日，将细胞以密度1-2x106个活细胞/ml接种在新鲜培养基中。在opti-memi培养基(invitrogen，美国)中准备250ml转染终体积的dna-复合物和转染试剂，其包含1:1摩尔比的250μg重链和轻链质粒dna。在转染后7日通过以14,000g离心30分钟并经无菌滤器(0.22μm)过滤，澄清含有单特异性或双特异性抗体的细胞培养上清液。将上清液贮存在-20℃直至纯化。为了确定细胞培养上清液中抗体和衍生物的浓度，使用hplc亲和层析。为此，将含有结合于蛋白a的单特异性或双特异性抗体或其衍生物的细胞培养上清液施加至包含200mmkh2po4、100mm柠檬酸钠、ph7.4的溶液中的appliedbiosystemsporosa/20柱上。通过施加包含200mmnacl，100mm柠檬酸，ph2.5的溶液从层析材料洗脱。使用ultimate3000hplc系统(dionex)。通过紫外吸光度和峰面积积分对洗脱的蛋白质定量。纯化的igg1抗体用作标准品。纯化结合洋地黄毒苷、荧光素、茶碱或生物素的抗半抗原抗体在转染后7日收获hek293细胞上清液。使用蛋白a-琼脂糖凝胶tm亲和层析(gehealthcare，瑞典)和superdex200大小排阻层析，通过亲和层析在两个步骤从上清液纯化其中所含的重组抗体(或抗体衍生物)。简而言之，含有抗体的澄清培养上清液施加在用pbs缓冲剂(10mmna2hpo4、1mmkh2po4、137mmnacl和2.7mmkcl，ph7.4)平衡的mabselectsure蛋白a(5-50ml)柱上。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋白质。用50mm柠檬酸盐缓冲液ph3.2洗脱抗体(或抗体衍生物)。含有蛋白质的级分用0.1ml2mtris缓冲液，ph9.0中和。随后，将洗脱的蛋白质级分汇集，用amiconultra离心滤器装置(mwco：30k，millipore)浓缩并加载于用20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0平衡的superdex200hiload26/60凝胶过滤柱(gehealthcare，瑞典)上。根据pace等人,proteinscience4(1995)2411-2423，通过使用基于氨基酸序列所计算的摩尔消光系数，以320nm处的od作为背景校正，在280nm处测量光密度(od)确定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。将单聚抗体级分汇集、急冻并贮存在-80℃。提供样品的部分用于后续的蛋白质分析和表征。在还原剂(5mm1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过sds-page并用考马斯亮兰染色，证实抗体的均一性。根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(invitrogen，美国)(4-20％tris-甘氨酸凝胶)。在还原条件下，在sds-page后，在与计算分子量相似的表观分子大小处鉴定到与igg相关的多肽链。通过蛋白a分析全部构建体的表达水平。在这类未优化的瞬时表达实验中，平均蛋白质产率在6mg和35mg纯化的蛋白质/升细胞培养上清液之间。实施例8半抗原化化合物的产生为了产生用于非共价复合以及用于缀合(共价复合物)的化合物需要(i)通过合适的接头将半抗原偶联至化合物(＝有效载荷)，和(ii)确保偶联以允许化合物保留其官能团的方式发生。a)半抗原-多肽缀合物：任何多肽可以在n末端或c末端或在侧链位置由携带半抗原的接头衍生化，只要可以将反应性残基，如半胱氨酸残基引入多肽和半抗原之间的接头中。特别地，多肽可以包含非天然氨基酸残基。下表5中列出示例性半抗原化化合物。表5.缩写：4abu＝4-氨基-丁酸ahx＝氨基己酸btn＝生物素基cme＝羧甲基cy5＝吲哚二羰花青、花青苷-5dadoo＝1,8-二氨基-3,6-二氧代辛烷dcm＝二氯甲烷dig(osu)＝洋地黄毒苷-3-羧甲基-n-羟琥珀酰亚胺dy636＝荧光团eda＝乙二胺fluo＝5-羧基-荧光素hatu＝0-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐hfip＝1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇mmt＝4-甲氧三苯甲基mr121＝嗪荧光团mtbe＝叔丁基甲基醚nmm＝n-甲基吗啉nmp＝n-甲基-2-吡咯烷酮peg2＝8-氨基-3,6-二氧杂辛酸peg3＝12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸o2oc＝8-氨基-3,6-二氧杂辛酸pip＝哌啶pqa＝4-氧代-6-哌嗪-1-基-4h-喹唑啉-3-基)-乙酸tbtu＝2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐tcep＝磷酸三(2-氯乙基)酯tfe＝2,2,2-三氟乙醇tis＝三异丙基硅烷在图30、图31和图32中显示偶联程序的示意图和所用的试剂。已经在本文中使用的示例性多肽是神经肽-2受体激动剂衍生物。这种多肽是如wo2007/065808中报道的肽酪氨酸-酪氨酸或胰腺肽yy短pyy(3-36)类似物。通过位置2中的氨基酸残基赖氨酸使其洋地黄毒苷化。洋地黄毒苷化的pyy多肽在下文中称作dig-pyy，无论将多肽与洋地黄毒苷残基连接的侧链是什么。其他示例性化合物是非肽荧光染料cy5、dy636和mr121。这些化合物可以通过nhs-酯化学与含有洋地黄毒苷或生物素的接头系统偶联。i.用于产生pyy(3-36)衍生的多肽缀合前体的一般方法自动化多重合成仪上用于pyy衍生物的标准方案：合成仪：多重合成仪syroi(multisyntechgmbh，witten)具有涡旋搅拌系统树脂：200mgtentagelsram(0.25mmol/g)，rapp聚合物，tubingen，10ml带特富龙釉料(teflonfrit)的塑料注射器作为反应容器母液：偶联：fmoc-解封闭：解封闭试剂：1200μl反应时间：5分钟+12分钟洗涤：溶剂：1200μl体积：1300μl反应时间：5×1分钟终末切割：切割试剂：8mltfa/茴香硫醚/甲苯硫酚/tis(95:2.5:2.5:3)反应时间：4小时精心制作：将切割溶液过滤和浓缩至1-2ml并通过添加mtbe沉淀肽。通过离心收集白色固体，用mtbe洗涤2次并干燥。ac-ik-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂(seqidno:176)通过树脂结合肽序列ac-ik(mmt)-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(tbu)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagel-ram树脂的自动化固相合成，获得pyy(3-36)-多肽衍生物(称作pyy)。因此使用fmoc化学，在具有涡旋搅拌系统的多重合成仪syroi(multisyntechgmbh，witten)中进行肽合成。使用tentagelram树脂(载量：0.25mmol/g；rapp聚合物，德国)，通过依次偶联相应的fmoc-氨基酸，以反复的循环装配肽序列(规模：0.05mmol)。在每个偶联步骤中，通过用二甲基甲酰胺(dmf)中的30％哌啶处理树脂(5分钟+12分钟)，移除n端fmoc基团。使用在第1、13、14和15位置处通过tbtu(0.25mmol)活化的受fmoc保护的氨基酸(0.25mmol)和nmp中的50％nmm，实施偶联(双重偶联2x30分钟涡旋)。在全部其他位置，使用hatu(0.25mmol)和nmp中的50％nmm作为活化剂。在每个偶联步骤之间将树脂用dmf洗涤5x1分钟。在合成线性前体后，通过与dmf/dipea/ac2o反应15分钟并用dmf洗涤，进行乙酰化，产生ac-ik(mmt)-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂。为了移除mmt基团，将肽用dcm/hfip/tfe/tis(6.5:2:1:0.5)处理2x1小时，在用dmf洗涤后产生部分解封闭的前体ac-ik-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂。ac-pyy(peg3-dig)/ac-ik(peg3-dig)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2(seqidno:177)合成还见wo2012/093068。向肽ac-ik(h2n-teg)-pqa-rhylnwvtrq(n-甲基)ry(100mg，40.6μmol)在水(5ml)中的溶液添加溶解于nmp(1ml)中的洋地黄毒苷-3-羧甲基-n-羟琥珀酰亚胺(26.6mg，48.8μmol)。添加三乙胺(13.6l，97.6μmol)并且将混合物在室温翻滚2小时。随后，添加溶解于nmp(0.5ml)中的额外洋地黄毒苷-3-羧甲基-n-羟琥珀酰亚胺(13.3mg，24.4μmol)以及三乙胺(6.8μl，48.8μmol)，并将溶液翻滚15小时。将粗产物通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化以提供作为无色固体的dig-pyy肽(29mg，10.0μmol，25％)。为了分析性表征肽衍生物，我们应用以下条件并且接收到以下数据：分析性hplc：tr＝11.3分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80:20，25分钟)；esi-ms(正离子模式)：m/z：c140h207n35o32计算值：2892.4；测定值：964.9[m+2h]2+；计算值：965.1。直至与抗体复合的时刻，我们均将洋地黄毒苷化肽作为冻干物存储在4℃。图2c显示dig-mopyy的结构。ii)用含有半胱氨酸的接头产生洋地黄毒苷化的pyy(3-36)衍生多肽ac-ik(peg3-cys-4abu-nh2)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2(seqidno:178)始于前体ac-ik-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂(seqidno:176)，采用以下步骤继续肽合成：用1.2mldmf中的66.5mg(3当量)fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(peg3-间隔团)、57.0mg(3当量)hatu和16.7μl(3当量)nmm手工双重偶联2x30分钟。用dmf(5x1分钟)洗涤后，用30％pip/dmf切去fmoc基团并且使用标准方案以dmf洗涤树脂。借助如针对自动化多重合成仪上pyy衍生物的标准方案中所述的方案，在syro1合成仪中自动进行fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-4-abu-oh的以下双重偶联。最后，将树脂用dmf、etoh、mtbe洗涤并且干燥。用8mltfa/茴香硫醚/甲苯硫酚/tis(95:2.5:2.5:3)进行从树脂切下4小时。将切割溶液过滤和浓缩至1-2ml并通过添加mtbe来沉淀肽。将白色固体通过离心收集，用mtbe洗涤2次并干燥。通过制备性反相hplc纯化粗产物，产生无色固体。产率：28.0mg。纯化方案hplc：具有紫外-vis检测器spd-6a的shimadzulc-8a溶剂a：水中的0.05％tfa溶剂b：80％乙腈/水中的0.05％tfa柱：ultrasepes，rp-18，10μm，250×20mm(sepserv，柏林)流速：15ml/分钟检测：230nm梯度：30分钟20-50％b分析性数据：hplc：具有光电二极管阵列检测器spd-m6a的shimadzulc-9a溶剂a：水中的0.05％tfa溶剂b：80％乙腈/水中的0.05％tfa柱：ultrasepes，rp-18，7μm，250×3mm(sepserv，柏林)流速：0.6ml/分钟梯度：30分钟5-80％b质谱：shimadzu飞行时间质谱仪aximalinear(maldi-tof)，将分子量计算为平均质量m/z：c122h185n37o28s计算值＝2650.13；测定值：2650.3ac-ik(peg3-cys-4abu-dig)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2(seqidno:179)向15mg肽ac-ik(peg3-cys-4abu-nh2)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-酰胺(seqidno:180)在50μldmso中的溶液添加250μlpbs缓冲液ph7.4并将溶液搅拌过夜。通过hplc控制二聚体形成。在18小时后，形成大约90％的二聚体。向这种溶液添加溶解于100μldmf中的7.3mg洋地黄毒苷-3-羧基-甲基-n-羟琥珀酰亚胺(dig-osu)并将混合物在室温搅拌5小时。随后，添加溶解于100μldmf中的额外16.9mgdig-osu并搅拌2小时。添加在100μldmf中另外量的6.9mg并搅拌18小时。为了减少二聚体，添加tcep，搅拌3小时，并且借助制备性反相hplc直接纯化溶液。分析性数据：条件与针对seqidno:178所描述的条件相同制备性hplc的梯度：30分钟38-58％b产率：5.3mgm/z：c147h219n37o34s计算值＝3080.7；测定值：3079.8peg3-ik(peg3-cys-4abu-dig)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2(seqidno:180)自动化固相合成树脂结合的pyy序列：peg2-ik(ivdde)-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(tbu)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagel-ram树脂(seqidno:181)在自动化appliedbiosystemsabi433a肽合成仪中使用fmoc化学，根据建立的方案(fastmoc0.25mmol)进行肽合成。使用tentagelram树脂(载量：0.18mmol/g；rapp聚合物，德国)，通过依次偶联相应的fmoc-氨基酸，以反复的循环装配肽序列(规模：0.25mmol)。在每个偶联步骤中，通过用n-甲基吡咯烷酮(nmp)中的20％哌啶处理树脂(3x2.5分钟)，移除n端fmoc基团。使用通过dmf中的hbtu/hobt(各1mmol)和dipea(2mmol)活化的受fmoc保护的氨基酸(1mmol)，实施偶联(45-60分钟涡旋)。分别在第2、3和14位置处，将氨基酸衍生物fmoc-lys(ivdde)-oh、fmoc-pqa-oh和fmoc-n-me-arg(mtr)-oh掺入合成序列中。在每个偶联步骤后，通过用nmp中ac2o(0.5m)、dipea(0.125m)和hobt(0.015m)的混合物处理(10分钟涡旋)，将未反应的氨基封端。在每个步骤之间，用n-甲基吡咯烷酮和dmf充分洗涤树脂。以自动化双重偶联完成空间位阻氨基酸的掺入。为此目的，将树脂在偶联循环之间无封端步骤的情况下用1mmol活化的结构单元处理2次。在靶序列完成后，用nmp中的20％哌啶移除n端fmoc基团并且将2-[2-(甲氧基乙氧基)-乙氧基]乙酸(4mmol)用hbtu/hobt(各2mmol)和dipea(4mmol)活化后偶联。随后，将树脂转移至烧结的固相反应器中用于进一步操作。peg2-ik(peg3-cys-abu-nh2)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2(seqidno:182)为移除ivdde基团，将肽树脂(peg2-ik(ivdde)-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(tbu)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagel-ram树脂；seqidno:181)用dmf溶胀30分钟，并且随后用肼水合物在dmf(60ml)中的2％溶液处理2小时。用异丙醇和dmf充分洗涤树脂后，添加fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(peg3-间隔团)(887mg，2mmol)、hbtu(2mmol)、hobt(2mmol)和2m二异丙基乙基胺(2ml，4mmol)在dmf(3ml)中的溶液，并将混合物振摇3小时。将树脂用dmf洗涤并用20％吡啶在dmf中的混合物切去fmoc基团。随后，将树脂用fmoc-cys(trt)-oh(1.2g；2mmol)、hbtu/hobt(各2mmol)和dipea(4mmol)的混合物处理2小时。将树脂用dmf洗涤并用20％吡啶在dmf中的混合物切去fmoc基团，并且偶联用hbtu/hobt(各2mmol)和dipea(4mmol)活化的fmoc-4-氨基丁酸(0.65g，2mmol)(2小时)。用nmp中的20％哌啶移除n端fmoc基团并用dmf反复洗涤树脂。随后，将树脂用三氟醋酸、水和三异丙基硅烷(19ml:0.5ml:0.5ml)的混合物处理2.5小时。将切割溶液过滤并通过添加冷(0℃)二异丙醚(300ml)使肽沉淀以提供无色固体，所述无色固体用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再溶解于乙酸/水的混合物中，冻干并且通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化。分析性hplc：tr＝8.6分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟)；esi-ms(正离子模式)：m/z：c127h195n37o31s计算值：2768.3；测定值：1385.0[m+2h]2+，计算值：1385.1；923.7[m+3h]3+，计算值：923.8；693.1[m+4h]4+，计算值：693.1。peg2-ik(peg3-cys-4abu-dig)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2(peg2-pyy(peg3-cys-4abu-dig)(seqidno:183)向肽peg2-ik(peg3-cys-abu-nh2)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2(seqidno:182，4.1mg，1.48μmol)在dmf(3ml)中的溶液添加溶解于nmp(1ml)中的洋地黄毒苷-3-羧甲基-n-羟琥珀酰亚胺(0.81mg，1.48μmol)。添加dmf中的三乙胺(0.41μl，97.6μmol)并且将混合物在室温翻滚2小时。将粗产物通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化以提供作为无色固体的peg3-cys-4abu-dig肽(1.2mg，0.375μmol，25％)。分析性hplc：tr＝10.2分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟)；esi-ms(正离子模式)：m/z：c152h229n37o37s计算值：3198.8；测定值：1067.3[m+2h]3+，计算值：1067.3。iii)用生物素或用含有生物素和半胱氨酸的接头产生pyy(3-36)衍生的多肽：ac-ik(peg2-生物素)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-酰胺/ac-pyy(peg2-biot)(seqidno:184)始于常规的前体肽树脂(seqidno:176)，将肽用1.2mldmf中的57.8mg(3当量)fmoc-8-氨基二氧杂辛酸(peg2间隔团)、48.2mg(3当量)tbtu和33.3μl(6当量)nmm手工偶联2次，每次30分钟，并用dmf洗涤。使用针对seqidno:176所述的标准方案，以30％pip/dmf切去fmoc基团，将树脂用dmf洗涤并用nmp中的生物素-obt溶液处理2小时(1.2mlnmp中的48.9mg生物素(4当量)、64.2mgtbtu(4当量)和44.4μlnmm(8当量)，预活化3分钟)。用dmf、etoh和mtbe洗涤后，干燥肽树脂。如上文所述进行最终切割。使用梯度30分钟22-52％b，通过制备性反相hplc纯化粗产物，产生固体。产率：42mg。纯化方案hplc：具有紫外-vis检测器spd-6a的shimadzulc-8a溶剂a：水中的0.05％tfa溶剂b：80％乙腈/水中的0.05％tfa柱：ultrasepes，rp-18，10μm，250×20mm(sepserv，柏林)流速：15ml/分钟检测：230nm分析性数据：hplc：具有光电二极管阵列检测器spd-m6a的shimadzulc-9a溶剂a：水中的0.05％tfa溶剂b：80％乙腈/水中的0.05％tfa柱：ultrasepes，rp-18，7μm，250×3mm(sepserv，柏林)流速：0.6ml/分钟梯度：30分钟5-80％b质谱：shimadzu飞行时间质谱仪aximalinear(maldi-tof)，将分子量计算为平均质量m/z：c122h181n37o27s计算值＝2630.10；测定值：2631.5ac-ik(peg3-cys-β-ala-生物素)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2/ac-pyy(peg3-cys-β-ala-biot)(seqidno:185)始于前体ac-ik-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂(seqidno:176)，将肽用1.2mldmf中的66.5mg(3当量)fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(peg3-间隔团)、57.0mg(3当量)hatu和16.7μl(3当量)nmm手工偶联2次30分钟。用dmf洗涤后，用30％pip/dmf切去fmoc基团并且使用标准方案以dmf洗涤树脂。在syro1合成仪中借助标准方案自动进行fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-β-ala-oh的双重偶联后，手工添加生物素-obt在nmp中的溶液(从1.2mlnmp中的48.9mg生物素(4当量)、64.2mgtbtu(4当量)和44.4μlnmm(8当量)制备，预活化3分钟)并且在室温搅拌。在2小时后，将树脂用dmf、etoh、mtbe洗涤并且干燥。如上文所述进行最终切割。如对seqidno:184所述那样，通过制备性反相hplc纯化粗产物，产生无色固体。产率：41.4mg分析性数据：制备性hplc的梯度：30分钟28-58％bm/z：c131h197n39o30s2计算值＝2862.4；测定值：2862.4ac-ik(peg3-cys-peg2-生物素)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2/ac-pyy(peg3-cys-peg2-biot)(seqidno:186)始于前体ac-ik-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂(seqidno:176)，采用以下步骤继续肽合成：用fmoc-peg3-oh(借助标准方案)双重偶联，fmoc-cys(trt)-oh(借助标准方案)的双重偶联，用1.2mldmf中的57.8mg(3当量)fmoc-8-氨基二氧杂辛酸(peg2间隔团)、48.2mg(3当量)tbtu和33.3μl(6当量)nmm双重偶联fmoc-peg2-oh，2x30分钟，并且用1.2mlnmp中的48.9mg生物素(4当量)、64.2mgtbtu(4当量)和44.4μlnmm(8当量)的溶液进行生物素酰化，(预活化3分钟)，单次偶联2小时。如seqidno:184中所述那样进行从树脂切割、纯化和分析。产率：47.7mg分析性数据：与用于seqidno:184的条件相同。制备性hplc的梯度：30分钟25-45％bm/z：c134h203n39o32s2计算值＝2936.5；测定值：2937.8iv)用荧光素或用含有荧光素和半胱氨酸的接头产生pyy(3-36)衍生的多肽：ac-ik(peg3-cys-4-abu-5-fluo)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2/ac-pyy(peg3-cys-4-abu-5-fluo)(seqidno:187)始于前体ac-ik-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂(seqidno:176)，以类似于seqidno:179的方式继续进行肽合成：为了标记，添加54.2mg5-羧基荧光素、33.1mghobt和35.6μldic在dmf中的溶液并在室温搅拌18小时。如seqidno:179中所述那样进行从树脂切割、纯化和分析。产率：41.6mg分析性数据：制备性hplc的梯度：30分钟29-49％bm/z：c143h195n37o34s计算值＝3008.44；测定值：3007.2ac-ik(peg3-cys-peg2-5-fluo)-pqa-rhylnwvtrq-mearg-y-nh2/ac-pyy(peg3-cys-peg2-5-fluo)(seqidno:188)始于前体ac-ik-pqa-r(pbf)h(trt)y(tbu)ln(trt)w(boc)vt(but)r(pbf)q(trt)-mearg(mtr)-y(tbu)-tentagelsram树脂(seqidno:176)，采用以下步骤继续肽合成：用fmoc-peg3-oh(借助标准方案)双重偶联，fmoccys(trt)-oh(借助标准方案)的双重偶联，双重偶联fmoc-peg2-oh(参见seqidno:186)。为了标记，将肽树脂与56.7mg5-羧基荧光素、34.6mghobt和37.3μldic在dmf中的溶液一起搅拌18小时。如seqidno:185中所述那样进行从树脂切割、纯化和分析。产率：41.7mg分析性数据：制备性hplc的梯度：30分钟34-64％bm/z：c145h199n37o36s1计算值＝3068.5；测定值：3069.2b)半抗原-标记的荧光染料：i)洋地黄毒苷化cy5的产生合成参见wo2012/093068。ii)dig-cys-mr121的产生在锥形烧瓶中，将1,2-二氨基丙烷三苯甲基树脂(250mg，0.225mmol，载量0.9mmol/g)用dmf(5ml)溶胀30分钟。随后，向树脂添加fmoc-cys(trt)-oh(395mg，0.675mmol)在dmf(2ml)中的溶液和hatu(433mg，1.2375mmol)和hoat(164mg，1.2375mmol)在dmf(8ml)中的溶液。向这种悬液添加dipea(385μl，2.25mmol)并将混合物在环境温度涡旋搅拌16小时，过滤并用dmf反复洗涤。在偶联步骤后，通过用ac2o(20％)在dmf中的混合物处理，将未反应的氨基封端，随后是dmf洗涤步骤。通过用dmf中的哌啶(20％)处理树脂2小时，完成移除n端fmoc基团。此后，将树脂用dmf和异丙醇彻底洗涤，并再次用dmf彻底洗涤并且随后用mr121(25mg，0.05mmol)在1％dipea中的溶液在dmf(10ml)中处理16小时。在过滤并用dmf洗涤后，将树脂用三氟醋酸、水和三异丙基硅烷(9ml:9ml:1ml)的混合物处理3小时。将切割溶液过滤，在降低的压力下浓缩，并且将所产生的固体通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化并且冻干。分析性hplc：tr＝7.7分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟。随后，将这种中间体的一部分(10.0mg，17.6μmol)溶解于dmf(1ml)中并且添加洋地黄毒苷-3-羧基-甲基-n-羟琥珀酰亚胺(9.6mg，17.6μmol)在dmf(1ml)中的溶液和dmf(2ml)中的1％三乙胺，并将混合物翻滚16小时。此后浓缩溶液，并将靶化合物通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化。产率：1.0mg。分析性hplc：tr＝10.1分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：996.3；测定值：995.8[m]1+。iii)dig-cys-ahx-cy5的产生在锥形烧瓶中，将1,2-二氨基丙烷三苯甲基树脂(250mg，0.225mmol，载量0.9mmol/g)用dmf(5ml)溶胀30分钟。随后，向树脂添加fmoc-cys(trt)-oh(395mg，0.675mmol)在dmf(2ml)中的溶液和hatu(433mg，1.2375mmol)和hoat(164mg，1.2375mmol)在dmf(8ml)中的溶液。向这种悬液添加dipea(385μl，2.25mmol)并将混合物在环境温度涡旋搅拌16小时，过滤并用dmf反复洗涤。在偶联步骤后，通过用ac2o(20％)在dmf中的混合物处理，将未反应的氨基封端，随后是dmf洗涤步骤。通过用dmf中的哌啶(20％)处理树脂，完成移除n端fmoc基团。此后，将树脂用dmf和异丙醇彻底洗涤，并再次用dmf彻底洗涤并且随后用cy5-mononhs-酯(25mg，0.0316mmol)在1％dipea中的溶液在dmf(10ml)中处理16小时。在过滤并用dmf洗涤后，将树脂用三氟醋酸、水和三异丙基硅烷(9ml:9ml:1ml)的混合物处理3小时。将切割溶液过滤，在降低的压力下浓缩，并且将所产生的固体再溶解于水中并冻干。通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)完成中间体的纯化，冻干后产生蓝色固体。分析性hplc：tr＝6.2分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟。随后，将这种中间体的一部分(6.5mg，7.9μmol)溶解于dmf(1ml)中并且添加dig-amcap-osu(5.2mg，7.9μmol)在dmf中(1ml)的溶液和dmf(2ml)中的1％三乙胺，并将混合物翻滚16小时。此后浓缩溶液，并将靶化合物通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化。产率：3mg。分析性hplc：tr＝8.7分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：1360.0；测定值：1360.7[m]1+。iv)生物素-eda-dy636的产生向生物素-乙二胺氢溴酸盐(2.14mg，5.83μmol)在0.1mk3po4缓冲剂(ph8.0，500μl)中的溶液添加dy636-osu(5mg，5.83μmol)在0.1mk3po4缓冲剂(ph8.0，500μl)中的溶液，并且将所产生的混合物在环境温度翻滚2小时，过滤，并将靶化合物通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)分离。在冻干后，获得作为无色固体的dy636-乙二胺-bi缀合物(2.8mg，48％)。分析性hplc：tr＝8.52分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x4.6mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟)；esi-ms(正离子模式)：m/z：c50h65n6o10s3计算值：1006.3；测定值：1007.3[m+h]+。v)生物素-ser-dy636的产生步骤1：生物素-o2oc-ser-o2oc-dadoo-nh2在o-双-(氨乙基)乙二醇三苯甲基树脂(176mg，0.125mmol，载量0.71mmol/g，novabiochem)上连续偶联fmoc-o2oc-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-o2oc-oh(均来自irisbiotech)和dmtr-d-生物素(roche)。在自动化appliedbiosystemsabi433a肽合成仪中使用fmoc化学(如对seqidno:180所述那样)，根据建立的方案(fastmoc0.25mmol)进行肽合成。在合成后，将树脂用dmf、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并在真空下干燥。随后，将树脂置于锥形烧瓶中并用三氟醋酸、水和三异丙基硅烷(9.5ml:250μl:250μl)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过滤并通过添加冷(0℃)二异丙醚(80ml)使肽沉淀以提供无色固体，所述无色固体用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再溶解于水中，冻干并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产率：56mg(60％)。分析性hplc：tr＝5.3分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：751.9；测定值：752.4[m+h]+；376.9[m+2h]2+。步骤2：生物素-o2oc-ser-o2oc-dadoo-dy-636(bi-ser-dy-636)将肽(5.3mg，7.0μmol)溶解于200mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(583μl)中。将dy-636nhs-酯(4mg，4.7μmol，dyomics)溶解于水(583μl)中并添加至肽溶液。将反应液在室温搅拌2小时并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产率：3.9mg(55％)。分析性hplc：tr＝8.3分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：1472.8；测定值：1472.8[m+h]+；737.0[m+2h]2+。vi)生物素-cys-dy636的产生步骤1：生物素-o2oc-cys-o2oc-dadoo-nh2在o-双-(氨乙基)乙二醇三苯甲基树脂(352mg，0.25mmol，载量0.71mmol/g，novabiochem)上连续偶联fmoc-o2oc-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-o2oc-oh(均来自irisbiotech)和dmtr-d-生物素(roche)。在自动化appliedbiosystemsabi433a肽合成仪中使用fmoc化学(如对seqidno:180所述那样)，根据建立的方案(fastmoc0.25mmol)进行肽合成。在合成后，将树脂用dmf、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并在真空下干燥。随后，将树脂置于锥形烧瓶中并用三氟醋酸、水和三异丙基硅烷(9.5ml:250μl:250μl)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过滤并通过添加冷(0℃)二异丙醚(100ml)使肽沉淀以提供无色固体，所述无色固体用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再溶解于水中，冻干并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产率：79mg(41％)。分析性hplc：tr＝5.3分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：767.9；测定值：768.4[m+h]+；384.8[m+2h]2+。步骤2：生物素-o2oc-cys(tnb)-o2oc-dadoo-nh2将肽(30mg，39μmol)溶解于100mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(4ml)中并添加5,5′‐二硫代双(2-硝基苯甲酸)(77mg，195μmol)。将混合物在室温搅拌30分钟并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生黄色固体。产率：31mg(83％)。分析性hplc：tr＝5.4分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：965.1；测定值：965.4[m+h]+；483.3[m+2h]2+。步骤3：生物素-o2oc-cys(tnb)-o2oc-dadoo-dy-636将tnb保护的肽(1.35mg，1.4μmol)溶解于200mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(291μl)中。将dy-636nhs-酯(1mg，1.2μmol，dyomics)溶解于水(291μl)并添加至肽溶液中。将反应液在室温搅拌1小时并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产率：1mg(50％)。分析性hplc：tr＝9.0分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：1686.0；测定值：1686.7[m+h]+；844.2[m+2h]2+。步骤4：生物素-o2oc-cys-o2oc-dadoo-dy-636(bi-cys-dy-636)将tnb保护且染料标记的肽(1mg，0.6μmol)溶解于200mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(250μl)和水(192μl)的混合物中。添加100mm三(2-羧乙基)膦)盐酸盐溶液(58μl)并将反应混合物在室温搅拌30分钟。通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)进行纯化，冻干后产生蓝色固体。产率：0.7mg(79％)。分析性hplc：tr＝8.6分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：1488.9；测定值：1488.6[m+h]+；745.1[m+2h]2+。vii)生物素-cys-cy5的产生步骤1：生物素-o2oc-cys-o2oc-dadoo-nh2在o-双-(氨乙基)乙二醇三苯甲基树脂(352mg，0.25mmol，载量0.71mmol/g，novabiochem)上连续偶联fmoc-o2oc-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-o2oc-oh(均来自irisbiotech)和dmtr-d-生物素(roche)。在自动化appliedbiosystemsabi433a肽合成仪中使用fmoc化学(如对seqidno:180所述那样)，根据建立的方案(fastmoc0.25mmol)进行肽合成。在合成后，将树脂用dmf、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并在真空下干燥。随后，将树脂置于锥形烧瓶中并用三氟醋酸、水和三异丙基硅烷(9.5ml:250μl:250μl)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过滤并通过添加冷(0℃)二异丙醚(100ml)使肽沉淀以提供无色固体，所述无色固体用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再溶解于水中，冻干并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产率：79mg(41％)。分析性hplc：tr＝5.3分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80：20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：767.9；测定值：768.4[m+h]+；384.8[m+2h]2+。步骤2：生物素-o2oc-cys(tnb)-o2oc-dadoo-nh2将肽(30mg，39μmol)溶解于100mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(4ml)中并添加5,5′‐二硫代双(2-硝基苯甲酸)(77mg，195μmol)。将混合物在室温搅拌30分钟并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生黄色固体。产率：31mg(83％)。分析性hplc：tr＝5.4分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：965.1；测定值：965.4[m+h]+；483.3[m+2h]2+。步骤3：生物素-o2oc-cys(tnb)-o2oc-dadoo-cy5将tnb保护的肽(9.9mg，10.3μmol)溶解于200mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(1026μl)中。将cy5-mononhs-酯(6.5mg，8.2μmol，gehealthcare)溶解于水(1026μl)中并添加至肽溶液。将反应液在室温搅拌2小时并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产率：10mg(80％)。分析性hplc：tr＝7.2分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：1603.9；测定值：1604.9[m+h]+；803.1[m+2h]2+。步骤4：生物素-o2oc-cys-o2oc-dadoo-cy5(bi-cys-cy5)将tnb保护且染料标记的肽(10mg，6.1μmol)溶解于200mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(1522μl)和水(1218μl)的混合物中。添加100mm三(2-羧乙基)膦)盐酸盐溶液(304μl)并将反应混合物在室温搅拌30分钟。通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)进行纯化，冻干后产生蓝色固体。产率：7.6mg(86％)。分析性hplc：tr＝6.4分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：1406.8；测定值：1406.8[m+h]+；704.0[m+2h]2+。viii)生物素-ser-cy5的产生步骤1：生物素-o2oc-ser-o2oc-dadoo-nh2在o-双-(氨乙基)乙二醇三苯甲基树脂(176mg，0.125mmol，载量0.71mmol/g，novabiochem)上连续偶联fmoc-o2oc-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-o2oc-oh(均来自irisbiotech)和dmtr-d-生物素(roche)。在自动化appliedbiosystemsabi433a肽合成仪中使用fmoc化学(如对seqidno:180所述那样)，根据建立的方案(fastmoc0.25mmol)进行肽合成。在合成后，将树脂用dmf、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并在真空下干燥。随后，将树脂置于锥形烧瓶中并用三氟醋酸、水和三异丙基硅烷(9.5ml:250μl:250μl)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过滤并通过添加冷(0℃)二异丙醚(80ml)使肽沉淀以提供无色固体，所述无色固体用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再溶解于水中，冻干并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产率：56mg(60％)。分析性hplc：tr＝4.5分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.1％tfa→乙腈/水+0.1％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：751.9；测定值：752.4[m+h]+；376.9[m+2h]2+。步骤2：生物素-o2oc-ser-o2oc-dadoo-cy5(bi-ser-cy5)将肽(5.7mg，7.6μmol)溶解于200mm磷酸钾缓冲液，ph7.5(789μl)中。将cy5-mononhs-酯(5mg，6.3μmol，gehealthcare)溶解于水(789μl)中并添加至肽溶液。将反应液在室温搅拌2小时并且随后通过使用含有0.1％tfa的乙腈/水梯度的制备性反相hplc(merckchromolithpreprp-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产率：6mg(58％)。分析性hplc：tr＝6.1分钟(merckchromolithperformancerp-18e，100x3mm，水+0.025％tfa→乙腈/水+0.023％tfa80:20，25分钟。esi-ms(正离子模式)：m/z：[m]计算值：1390.72；测定值：1391.2[m+h]+。实施例9重组人源化抗生物素抗体与生物素标记的化合物(半抗原化化合物)的结合为了确定人源化过程和后续导入半胱氨酸突变是否产生保留完整结合活性的衍生物，进行以下实验。使用octetqk仪(fortebioinc.)，通过生物双层干涉测量(bli)技术分析重组抗生物素抗体衍生物的结合特性。该系统是经充分建立的用于研究分子相互作用的系统。bli技术基于测量从生物传感器尖端和内参的表面反射的白光的干涉图样。分子与生物传感器尖端的结合导致可以测量的干涉图样偏移。为了分析上文描述的人源化过程是否削弱抗生物素抗体与生物素结合的能力，将嵌合形式和人源化形式的抗体的特性就它们与生物素酰化的蛋白质结合的能力直接比较。通过在抗huiggfc抗体捕获(ahc)生物传感器上(fortebioinc.)捕获抗生物素抗体进行结合研究。首先，在20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中浓度为0.5mg/ml的抗体溶液中温育生物传感器1分钟。此后，将生物传感器在1xpbsph7.4中温育1分钟以达到稳定基线。在20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中含有浓度0.06mg/ml的生物素酰化蛋白质的溶液中温育抗体包被的生物传感器5分钟，测量结合。在1xpbsph7.4中监测解离5分钟。直接比较嵌合抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体的所得结合曲线。人源化形式的抗体显示与嵌合抗体相等或甚至较之更好的生物素酰化抗原结合。在kabat位置vh53处具有cys突变的人源化抗体也是如此。生物素酰化的蛋白质显示与生物传感器的残余非特异性结合，生物传感器用不结合生物素的赫赛汀包被时，这种结合减少。因此，抗生物素抗体的功能保留在其人源化变体中(其由如seqidno:44和48、seqidno:60和64中所述的序列限定)。表面等离子体共振法在t200仪器(gehealthcarebiosciencesab，瑞典)上在25℃进行表面等离子体共振测量。通过使用gehealthcare供应的标准胺偶联试剂盒(br-1000-50)在ph5.0在cm3芯片(gehealthcare，br-1005-36)上偶联来自人抗体捕获试剂盒，br-1008-39，gehealthcarebiosciencesab，瑞典)的约4300共振单位(ru)捕获系统(10μg/ml抗人捕获物(iggfc)。用于胺偶联的运行缓冲液是hbs-n(10mmhepes，ph7.4，150mmnacl，gehealthcare，br-1006-70)。用于以下结合研究的运行和稀释缓冲液是pbs-t(包含0.05％tween20的10mm磷酸盐缓冲盐水)ph7.4。通过以流速5μl/分钟注射2nm溶液60秒捕获人源化抗生物素抗体。将生物素酰化的sirna用pbs-t稀释为0.14-100nm的浓度(1:3稀释系列)。通过以流速30μl/分钟注射每个浓度180秒，解离时间600秒，测量结合。通过用3mmgcl2溶液以流速5μl/分钟洗涤30秒使表面再生。使用bia评价软件(gehealthcarebiosciencesab，瑞典)评价数据。通过扣减从抗人iggfc表面获得的响应，修正主体折射率差异。还扣减空白注射(＝双参考)。为了计算kd和动力学参数，使用朗格缪尔1:1模型。通过表面等离子体共振(spr)对人源化抗生物素抗体seqidno:44和48和人源化抗生物素抗体vh53cseqidno:60和64实施动力学结合分析。通过与cm3传感芯片结合的抗人iggfc抗体捕获2nm浓度的抗生物素抗体。在浓度0.41、1.23、3.7、11.1、33.3、100和300nm处记录到生物素酰化sirna(mw：13868da)的结合。一式两份实施测量。人源化抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体vh53c的计算kd分别是0.633nm和0.654nm。实施例10用抗半抗原抗体产生半抗原化化合物的非共价复合物一般方法：产生抗半抗原抗体与半抗原化化合物(＝与有效载荷缀合的半抗原)的复合物应当导致确定的复合物并且应当确保这些复合物中的化合物(＝有效载荷)保留其活性。为了产生半抗原化化合物与相应的抗半抗原抗体的复合物，将半抗原化化合物溶解于h2o中至终浓度1mg/ml。将抗体在20mm组氨酸缓冲液，140mmnacl，ph＝6.0中浓缩至终浓度1mg/ml(4.85μm)。通过上下抽吸并且在室温温育15分钟，将半抗原化的有效载荷和抗体按2:1摩尔比(化合物对抗体)混合。备选地，将半抗原化化合物溶解于100％dmf中至终浓度10mg/ml。将抗体在50mmtris-hcl，1mmedta，ph＝8.2中浓缩至终浓度10mg/ml。通过上下抽吸并且在室温以350转/分钟温育60分钟，将半抗原化化合物和抗体按2.5:1摩尔比(化合物对抗体)混合。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的复合物–非共价洋地黄毒苷-cy5复合物的示例性方法使用人源化和鼠抗洋地黄毒苷抗体或双特异性抗洋地黄毒苷抗体衍生物作为抗体组分。为了产生洋地黄毒苷化cy5与抗洋地黄毒苷抗体的复合物，将cy5-洋地黄毒苷缀合物溶解于pbs中至终浓度0.5mg/ml。抗体以缓冲液中1mg/ml(约5μm)的浓度使用，所述缓冲液由20mm组氨酸和140mmnacl，ph6组成。将洋地黄毒苷化cy5和抗体按2:1摩尔比(洋地黄毒苷化cy5对抗体)混合。这个过程产生组合确定的复合物的均一制备物。可以通过在大小排阻柱上确定抗体缔合的荧光团的荧光(650/667nm)监测复合反应。这些实验的结果显示，复合仅在抗体含有洋地黄毒苷结合特异性时发生。无洋地黄毒苷结合特异性的抗体不结合洋地黄毒苷-cy5缀合物。可以对二价抗洋地黄毒苷抗体观察到增加的信号直至洋地黄毒苷-cy5缀合物对抗体的比率为2:1。此后，组成依赖性荧光信号达到平顶(plateau)。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的复合物–生物素-cy5/嵌合抗生物素抗体(人igg亚类)复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酰化接头的生物素衍生化-cy5(生物素-cys-cy5)的复合物，将0.16mg生物素-cys-cy5溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg抗体以缓冲液中10.1mg/ml(约69μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将生物素-cys-cy5和抗体以2.5:1摩尔比(生物素-cys-cy5对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。如实施例11a中所述，通过sds-page分析所产生的缀合物。如实施例11a中所述实施荧光的检测。用于形成生物素酰化荧光染料和抗生物素抗体缀合物–生物素-ser-cy5/人源化抗生物素抗体的示例性方法为了产生在接头内部含有丝氨酸残基的生物素衍生化-cy5(生物素-ser-cy5)的复合物，将0.61mg生物素-ser-cy5溶解于20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中至浓度10mg/ml。18.5mg人源化抗生物素抗体以缓冲液中10mg/ml(约69μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将生物素-ser-cy5和抗体以2.5:1摩尔比(生物素-ser-cy5对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。随后使用superdex20016/60高载量制备级柱(gehealthcare)以流速1.5ml/分钟和20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0作为流动相，对样品进行大小排阻层析。将峰级分收集并通过sds-page分析纯度。通过以下方式计算染料对抗体比：(1)在波长280nm(蛋白质)和650nm(cy5)处测量样品的吸光度；(2)使用以下式：标记的蛋白质的a650/ε(cy5)*蛋白质浓度(m)＝摩尔染料/摩尔蛋白质，其中ε(cy5)＝250000m-1cm-1，复合物的a650＝47.0并且蛋白质浓度是86.67μm。所得的染料对抗体分子比是2.17，这表明全部抗体的抗原互补位均以生物素-cy5分子饱和。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物–洋地黄毒苷-pyy(3-36)/抗洋地黄毒苷抗体的复合物的示例性方法为了产生洋地黄毒苷化多肽与抗洋地黄毒苷抗体的非共价复合物，将鼠杂交瘤衍生的抗体(来自10mmkpo4，70mmnacl；ph7.5的冻干物)溶解于12ml水中并针对包含20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0的溶液透析以在11ml缓冲液中产生300mg(2x10-6mol)(浓度＝27.3mg/ml)。将洋地黄毒苷-pyy(3-36)缀合物(11.57mg，4x10-6mol，2当量)在1小时内以4个2.85mg部分添加并且在室温温育另一个小时。在复合反应完成后，通过大小排阻层析，借助superdex20026/60gl柱(320ml)在20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中以流速2.5ml/分钟纯化复合物。将洗脱的复合物以4ml级分收集，汇集并经0.2μm滤器除菌以产生浓度为14.3mg/ml的234mg复合物。以相似方式，为了产生人源化抗洋地黄毒苷抗体的复合物，将该抗体在20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中调节至浓度10.6mg/ml(9.81mg，0.93ml中的6.5x10-8mol)。将0.57mg＝1.97x10-7mol＝3.03当量洋地黄毒苷化多肽(dig-pyy)作为冻干物添加至抗体溶液。将多肽和抗体在室温温育1.5小时。通过大小排阻层析，借助superose610/300gl柱在20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中以流速0.5ml/分钟移除过量多肽。将洗脱的复合物以0.5ml级分收集、合并并经0.2μm滤器除菌以产生浓度为1.86mg/ml的4.7mg复合物。借助大小排阻层析中单峰的出现，将所产生的半抗原化多肽-抗半抗原抗体复合物确定为单聚体igg样分子。将所产生的复合物确定为单聚体igg样分子，携带两个洋地黄毒苷-pyy衍生物/抗体分子。通过大小排阻层析证实这些肽复合物的确定组成，所述大小排阻层析还表明不存在蛋白质聚集物。进一步通过sec-mals(大小排阻层析-多角度光散射法)证实这些双特异性肽复合物的确定组成(和2:1多肽对蛋白质比)。对于sec-mals分析，将100-500μg相应的样品施加至superdex20010/300gl大小排阻栏上，流速0.25-0.5ml/分钟，以1xpbsph7.4作为流动相。用wyattminidawntreos/qels检测器检测光散射，用wyattoptilabrex-检测器测量折射率。使用软件astra(版本5.3.4.14)，分析所得数据。secmalls分析的结果提供关于复合物质量、半径和尺寸的信息。这些数据随后与相应的未复合抗体的那些数据比较。这些实验的结果显示，洋地黄毒苷化-pyy暴露于抗洋地黄毒苷抗体产生了每一个抗体分子含有两个洋地黄毒苷-pyy衍生物的复合物。因此，洋地黄毒苷化pyy可以与抗洋地黄毒苷抗体在确定的位点(结合区)并以确定的化学计量复合。通过表面等离子体共振研究对复合物的特征提供了额外证据：复合反应生成确定和完全复合的分子。抗洋地黄毒苷抗体可以与spr芯片结合，这导致信号增加。后续添加洋地黄毒苷-pyy缀合物导致信号进一步增加直至全部结合位点被完全占据。在这些情况下下，添加更多的洋地黄毒苷-pyy不进一步增加信号。这表示复合反应是特异的并且信号不由洋地黄毒苷化多肽的非特异性粘合引起。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物–ac-pyy-peg3-cys-β-ala-biot/嵌合抗生物素抗体复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酰化接头的生物素化pyy-多肽的非共价复合物，将0.19mgac-pyy-peg3-cys-β-ala-biot溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。抗体以缓冲液中10.7mg/ml(约73μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy-peg3-cys-β-ala-biot和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy-peg3-cys-β-ala-biot对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。借助大小排阻层析中单峰的出现，将所产生的复合物确定为单聚体igg样分子(95％单体)。通过sds-page和后续的蛋白质印迹分析法进一步分析所产生的复合物。将10μg复合物与4xlds样品缓冲液(invitrogen)混合并在95℃温育5分钟。将样品施加至4-12％bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(nupage，invitrogen)，后者以200v和120ma运行35分钟。将聚丙烯酰胺凝胶中分离的分子在25v和160ma持续40分钟转移至pvdf膜(0.2μm孔径，invitrogen)。将膜在室温于1xpbst(1xpbs+0.1％tween20)中的1％(w/v)脱脂乳中封闭1小时。将膜在1xpbst中洗涤3次持续5分钟并随后与按1:2000稀释使用的链霉亲和素-pod-缀合物(2900u/ml，roche)温育。使用lumi-light蛋白质印迹底物(roche)，实施与膜上生物素结合的链霉亲和素-pod的检测。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物–ac-pyy-peg3-cys-peg2-biot)/嵌合抗生物素抗体复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酰化接头的生物素衍生化pyy-多肽的非共价复合物，将0.16mgac-pyy-peg3-cys-peg2-biot溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。抗体以缓冲液中10.7mg/ml(约73μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy-peg3-cys-peg2-biot和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy-peg3-cys-peg2-biot对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。借助大小排阻层析，将所产生的复合物确定为63％单聚体igg样分子和37％二聚体可溶性聚集物。通过sds-page和后续的蛋白质印迹分析法进一步分析所产生的复合物。将10μg复合物与4xlds样品缓冲液(invitrogen)混合并在95℃温育5分钟。将样品施加至4-12％bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(nupage，invitrogen)，后者以200v和120ma运行35分钟。将聚丙烯酰胺凝胶中分离的分子在25v和160ma持续40分钟转移至pvdf膜(0.2μm孔径，invitrogen)。将膜在室温于1xpbst(1xpbs+0.1％tween20)中的1％(w/v)脱脂乳中封闭1小时。将膜在1xpbst中洗涤3次持续5分钟并随后与按1:2000稀释使用的链霉亲和素-pod-缀合物(2900u/ml，roche)温育。使用lumi-light蛋白质印迹底物(roche)，实施与膜上生物素结合的链霉亲和素-pod的检测。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物–ac-pyy(peg3-cys-peg2-5-fluo)/嵌合抗荧光素抗体复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酰化接头的荧光素缀合-pyy-多肽的非共价复合物，将0.33mgac-pyy(peg3-cys-peg2-5-fluo)溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。抗体以缓冲液中9.99mg/ml(约68μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy(peg3-cys-peg2-5-fluo和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy(peg3-cys-peg2-5-fluo对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。借助大小排阻层析，将所产生的复合物确定为76％单聚体igg样分子和24％二聚体可溶性聚集物。通过sds-page进一步分析所产生的复合物并随后检测聚丙烯酰胺凝胶中荧光素相关的荧光。将8μg复合物与4xlds样品缓冲液(invitrogen)混合并在95℃温育5分钟。使用lumiimagerf1仪(roche)在645nm激发波长记录荧光素相关的荧光。实施例11在氧化还原剂存在下产生半抗原化染料或多肽与抗半抗原抗体vh52bc/vh53c的确定的共价缀合物用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物–dig-cys-ahx-cy5/抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的示例性方法含有半胱氨酸接头的抗半抗原抗体和半抗原化荧光染料的共价缀合物的产生导致确定的缀合物，其中二硫键在抗半抗原抗体cdr2中的vh52bc和接头中的半胱氨酸之间的一个特定位置形成，其中所述接头位于半抗原和荧光染料之间。在氧化还原试剂存在下实施缀合反应。将dig-cys-ahx-cy5溶解于20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中。通过逐滴添加添加添加10％(v/v)乙酸促进溶解。将终浓度调节至0.4mg/ml。使20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中的抗洋地黄毒苷抗体vh52bc达到浓度10mg/ml。将抗洋地黄毒苷抗体作为对照使用并且按照与抗洋地黄毒苷抗体vh52bc相同的方式处理。将4.7nmol每种抗体与2.5摩尔当量的dig-cys-ahx-cy5混合。通过每隔15分钟以4部分(每部分2.9nmol)添加11.7nmol这种物质实现这一点。在这些添加之间，将样品在25℃温育，同时温和振摇。在添加最后部分后，将0.64nmol每种抗体-dig-cys-ahx-cy5复合物转移至含有以下氧化还原试剂的缓冲液：3mmdte(二硫赤藓糖醇)+10mmgssg(氧化型谷胱甘肽)、0.3mmdte+1mmgssg和0.03mmdte+0.1mmgssg。全部样品均在这些条件温育15分钟。在温育后，将样品分成两半(每一半0.34nmol)并准备用于sds凝胶电泳。为此，添加4xlds样品缓冲液(invitrogen)。对于每份样品，还通过添加10xnupage样品还原剂(invitrogen)制备还原形式。将全部样品在70℃温育5分钟，之后在4-12％bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(nupage，invitrogen)上用1xmops缓冲液(invitrogen)电泳。用lumiimagerf1装置(roche)在激发波长645nm处检测凝胶中的cy5相关荧光。在检测荧光后，凝胶用simplybluesafestain(invitrogen)染色。图8中显示凝胶。当使用cdr2中无半胱氨酸的抗洋地黄毒苷抗体时(泳道2a-c)，显示抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的位点特异性二硫键形成(图8，在上部的凝胶，泳道1a-c)，同时具有低的背景荧光信号低。对照反应中的背景信号可以由dig-cys-ahx-cy5与正常情况下通常参与抗体链间二硫键形成的半胱氨酸偶联来解释。渐增量增加量的氧化还原试剂大幅度还原连接抗体重链和轻链的二硫键，主要产生3/4抗体(-1xlc)、hc-二聚体(-2xlc)和/和1/2抗体(1xhc+1xlc)。在凝胶底部，可以检测到不与抗体共价连接的dig-cys-ahx-cy5的荧光。在图8底部的凝胶显示当还原样品时，在抗体重链和轻链附近不可检测到cy5相关的荧光，这表明共价键的确由二硫键形成。每块凝胶的考马斯染料染色显示每条泳道中总蛋白质的量相等。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物–dig-cys-cy5/抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的示例性方法将dig-cys-cy5溶解于8.3mmhcl，10％(v/v)dmf中至终浓度3.25mg/ml。使20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0中的抗洋地黄毒苷抗体vh52bc抗体达到浓度15mg/ml。将抗洋地黄毒苷抗体作为对照使用并且按照与抗洋地黄毒苷抗体vh52bc相同的方式处理。在1mmgsh(还原型谷胱甘肽)和5mmgssg(还原型谷胱甘肽)存在下，将13.3nmol每种抗体与2摩尔当量dig-cys-cy5在抗体终浓度10mg/ml时混合。通过每隔5分钟以2部分添加26.6nmol这种物质实现这一点。在这些添加之间，将样品在室温温育，同时温和搅拌。在添加最后部分后，将样品在室温温育1小时。通过sds-page评价偶联反应的效率并随后记录cy5相关的荧光信号。制备每份样品5、10和20μg用于sds-page。为此，添加4xlds样品缓冲液(invitrogen)。将全部样品在70℃温育5分钟，之后在4-12％bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(nupage，invitrogen)上用1xmops缓冲液(invitrogen)电泳。用lumiimagerf1装置(roche)在激发波长645nm处检测凝胶中的cy5相关荧光。在检测荧光后，凝胶用simplybluesafestain(invitrogen)染色。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物–peg3-pyy(peg3-cys-4abu-dig)/人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的示例性方法为了产生含有半胱氨酰接头的洋地黄毒苷衍生化-pyy-多肽的缀合物，将1.4mgpeg3-pyy(peg3-cys-4abu-dig)溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg抗体以缓冲液中10mg/ml(约68μm)的浓度使用，所述缓冲液由5mmtris-hcl，1mmedta，1mmgsh，5mmgssg，ph8.2组成。将peg3-pyy(peg3-cys-4abu-dig)和抗体以2:1摩尔比(peg3-pyy(peg3-cys-4abu-dig)对抗体)混合并在室温温育60分钟，以100转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定43％检测到的种类为与2个多肽分子偶联的抗体，46％是与1个多肽分子偶联的抗体并且鉴定11％为未偶联的抗体。实施例12用抗半抗原抗体vh52bc/vh53c在缺少氧化还原剂下产生半抗原化染料和多肽的确定的共价缀合物为了产生共价性抗半抗原抗体/半抗原化多肽或半抗原化染料二硫键连接的缀合物，需要(i)借助含有合适反应基团(如例如半胱氨酸、马来酰亚胺)的接头将半抗原(例如洋地黄毒苷、荧光素、生物素或茶碱)与多肽或染料如此偶联，从而允许多肽暴露在抗体表面上并因此保留其活性，和(ii)用具有半胱氨酸突变的抗半抗原抗体(＝抗体vh52bc/vh53c)产生半抗原化多肽的共价性位点特异性缀合物，其中保留多肽的生物学活性，以及(iii)在还原剂不存在的情况下实施反应以避免还原抗体链间二硫键。一般方法：产生抗半抗原抗体与半抗原化化合物的缀合物应当产生具有确定化学计量的缀合物并应当确保这些缀合物中的化合物保留其活性。为了产生半抗原化化合物与相应的抗半抗原抗体的缀合物，将半抗原化化合物溶解于100％dmf中至终浓度10mg/ml。使抗半抗原抗体vh52bc/vh53c在50mmtris-hcl，1mmedta，ph＝8.2中达到浓度10mg/ml。通过上下抽吸并且在室温并以350转/分钟温育60分钟，将半抗原化化合物和抗半抗原抗体vh52bc/vh53c按2.5:1摩尔比(化合物对抗体)混合。借助含有半胱氨酸的接头与半抗原缀合的多肽在下文中称作半抗原-cys-多肽或多肽-cys-半抗原。该多肽可以具有游离n末端或封端的n末端，例如用乙酰基封端(产生ac-多肽-cys-半抗原)或用peg-残基封端(产生peg-多肽-cys-半抗原)。借助含有半胱氨酸的接头与半抗原缀合的荧光染料在下文中称作染料-cys-半抗原或半抗原-cys-染料。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物–dig-cys-ahx-cy5/抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的示例性方法样品完全如实施例11a中所述那样制备，不同之处在于将抗体-dig-cys-ahx-cy5复合物转移至含有或不含氧化还原型化合物0.1mmgssg(氧化型谷胱甘肽)或1mmgssg的缓冲液。图9中显示所得的荧光扫描的和考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。全部三种条件均以低水平背景反应(图9，泳道2a-c)显示位点特异性二硫键形成的相似特异性(图9，顶部凝胶，泳道1a-c)。这证实二硫键的形成可以在不需要还原剂的情况下完成。这显著地稳定抗体/减少抗体分解，因为与实施例11相比，检测到仅3/4抗体(-1xlc)、hc-二聚体(-2xlc)和1/2抗体(1xhc+1xlc)的残留量。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物–dig-cys-cy5/抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的示例性方法样品完全如实施例11b中所述那样制备，不同之处在于13.3nmol抗体在氧化还原试剂不存在的情况下与2摩尔当量的dig-cys-cy5在抗体终浓度10mg/ml时混合。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物–生物素-cys-cy5/嵌合抗生物素抗体vh53c的示例性方法为了产生含有半胱氨酰化接头的生物素衍生化-cy5的缀合物，将0.16mg生物素-cys-cy5溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg抗生物素抗体vh53c以缓冲液中9.7mg/ml(约68μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将生物素-cys-cy5和抗体以2.5:1摩尔比(ac-生物素-cys-cy5对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。如实施例11a中所述，通过sds-page分析所产生的缀合物。如实施例11a中所述实施荧光的检测。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物–生物素-cys-cy5/人源化抗生物素抗体vh53c的示例性方法为了产生含有半胱氨酰化接头的生物素衍生化-cy5的缀合物，将0.16mg生物素-cys-cy5溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg人源化抗生物素抗体vh53c以缓冲液中7.4mg/ml(约51μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将生物素-cys-cy5和抗体以2.5:1摩尔比(ac-生物素-cys-cy5对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。如实施例11a中所述，通过sds-page分析所产生的缀合物。如实施例11a中所述实施荧光的检测。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物–ac-pyy(peg3-cys-4abu-dig)/人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的示例性方法为了产生含有半胱氨酰化接头的洋地黄毒苷衍生化-pyy-多肽的缀合物，将2.4mgac-pyy(peg3-cys-4abu-dig)溶解于20％乙酸酯中至浓度5mg/ml。10mg人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc(68.4nmol)以缓冲液中19.5mg/ml(约133μm)的浓度使用，所述缓冲液由20mm组氨酸，140mmnacl，ph6.0组成。将ac-pyy(peg3-cys-4abu-dig)和抗体以2:1摩尔比(ac-pyy(peg3-cys-4abu-dig)对抗体)混合并在室温温育60分钟，以100转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定7.4％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体，40％是与1个肽分子偶联的抗体并且鉴定52％为未偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物–ac-pyy(peg3-cys-βala-biot)/嵌合抗生物素抗体vh53c的示例性方法为了产生含有半胱氨酰接头的生物素衍生化-pyy-多肽的缀合物，将0.19mgac-pyy(peg3-cys-βala-biot)溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg嵌合抗生物素抗体vh53c以缓冲液中9.7mg/ml(约67μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy[peg3-cys-βala-biot和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy[peg3-cys-βala-biot]对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定87.7％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体，鉴定12.3％的种类为与1个肽分子偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物ac-pyy(peg3-cys-peg2-biot)/嵌合抗生物素抗体vh53c的示例性方法为了产生含有半胱氨酰接头的生物素衍生化-pyy-多肽的缀合物，将0.16mgac-pyy(peg3-cys-peg2-biot)溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg嵌合抗生物素抗体vh53c以缓冲液中9.9mg/ml(约68μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy[peg3-cys-peg2-biot和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy[peg3-cys-peg2-biot]对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定100％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物ac-pyy(peg3-cys-βala-biot)/人源化抗生物素抗体vh53c的示例性方法为了产生含有半胱氨酰接头的生物素衍生化-pyy-多肽的缀合物，将0.06mgac-pyy(peg3-cys-βala-biot)溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。0.8mg人源化抗生物素抗体vh53c以缓冲液中9mg/ml(约62μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy[peg3-cys-βala-biot和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy[peg3-cys-βala-biot]对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定62.2％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体，鉴定33.9％的种类为与1个肽分子偶联的抗体并且鉴定3.9％的种类为未偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物–ac-pyy(peg3-cys-peg2-biot)/人源化抗生物素抗体vh53c的示例性方法为了产生含有半胱氨酰接头的生物素衍生化-pyy-多肽的缀合物，将0.08mgac-pyy(peg3-cys-peg2-biot)溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。0.8mg人源化抗生物素抗体vh53c以缓冲液中9mg/ml(约62μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy[peg3-cys-peg2-biot和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy[peg3-cys-peg2-biot]对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定71.4％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体，鉴定26％的种类为与1个肽分子偶联的抗体并且鉴定2.5％的种类为未偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物–ac-pyy(peg3-cys-peg2-fluo)/抗荧光素抗体vh52bc的示例性方法为了产生含有半胱氨酰接头的生物素衍生化-pyy-多肽的缀合物，将0.33mgac-pyy[peg3-cys-peg2-fluo溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg抗荧光素抗体vh52bc以缓冲液中9.3mg/ml(约63μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy[peg3-cys-peg2-fluo和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy[peg3-cys-peg2-fluo对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定95％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体，鉴定5％的种类为与1个肽分子偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物–ac-pyy(peg3-cys-peg2-fluo)/抗荧光素抗体vh28c的示例性方法为了产生含有半胱氨酰接头的生物素衍生化-pyy-多肽的缀合物，将0.33mgac-pyy[peg3-cys-peg2-fluo溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。1mg抗荧光素抗体vh28c以缓冲液中9.5mg/ml(约63μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy[peg3-cys-peg2-fluo和抗体以2.5:1摩尔比(ac-pyy[peg3-cys-peg2-fluo对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。鉴定100％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体。实施例13共价性茶碱-抗茶碱抗体复合物的产生为了评价利用茶碱和结合茶碱的抗体作为半抗原识别系统的共价性抗体复合物的形成，总体上使用已经对洋地黄毒苷-cys-cy5或生物素-cys-cy5描述的合成和纯化技术，产生茶碱-cys-cy5作为荧光有效载荷，不同之处在于已经将半抗原交换为茶碱(参见实施例8和图13、图14和图22)。图43a)中显示已经合成茶碱的-cys-cy5衍生物的组成。为了展示共价二硫键的形成，产生了结合茶碱的抗体，所述抗体在重链可变区第54或55位置处含有设计的cys(抗茶碱抗体-cys)。在图43b)中对y54c变体示例性显示这些抗体的纯度。这些抗体衍生物与茶碱-cys-cy5复合并且随后在如实施例12中所述的非还原性和还原条件下进行sds-page。在非还原性条件下，二硫键连接的复合cy5的抗茶碱抗体按照与实施例12中描述相同的方式，通过凝胶内部其h链相关的荧光检测。这在图43c)中描述，该图表明由于按照与使用洋地黄毒苷、荧光素或生物素作为半抗原时观察到的二硫键相同的方式进行简单的加载反应，在抗体之间已经形成共价复合物。如预期的那样，在还原后，这些复合物解离，即，仅当二硫键还原时才从h链释放有效载荷(图43c))。实施例14在类体内条件下产生共价的半抗原-抗体复合物和体内定向二硫键形成的证据为了评价类体内条件下共价半抗原-抗体复合物的形成，将抗生物素抗体-cys在37℃在鼠血清中与生物素-cys-cy5温育60分钟。随后，通过蛋白a从鼠血清捕获抗体。此后，将捕获的抗体在如实施例12中所述的非还原条件和还原条件下进行sds-page。二硫键连接的抗体复合的cy5按照与实施例12中描述相同的方式，通过凝胶内部其h链相关的荧光检测。图44表明抗体之间的共价复合物在血清中在37℃，即，在类似于体内条件的条件下形成。如预期的那样，在还原后，这些复合物解离，即，仅当二硫键还原时才从h链释放有效载荷(图44)。以下观察结果出乎意料：一旦半抗原定位，则抗体和有效载荷之间的定向二硫键可以形成，甚至在血清存在下也是如此，因为血清含有高量的蛋白质、肽和其他化合物(它们可以干扰二硫键形成反应)。以下观察结果：一旦半抗原定位则抗体和有效载荷之间的定向二硫键可以在37℃在血清中形成，还打开了在预靶向(pre-targeting)设定中利用这种pk-调节系统的可能性：分别施加抗体和半抗原-有效载荷，随后体内装配抗体复合物并后续形成二硫键。为了进一步评价体内‘预靶向’的潜在应用，通过如实施例18中所述的动物眼的非侵入式光学成像技术在预靶向条件下确定生物素-cy5的药物代谢动力学。在这些实验中，通过揭示毛细管中cy5荧光的动物眼光学成像，以非侵入方式确定cy5的存在。将我们在注射生物素-cy5后10分钟于小鼠眼中检测到的cy5介导的荧光值设定为100％值，并且相对该值表示在后续时间点测量的荧光值。在这个实验中，将1mg抗体(抗生物素抗体或抗生物素抗体-cys(＝抗生物素抗体的cys-突变体))在注射生物素-cy5并开始眼成像之前24小时施加。对照组不用抗生物素抗体预先注射。图45中显示这些实验的结果：生物素-cy5向未接受预先注射的抗体的动物中的注射以低血清半寿期和低暴露水平消除(菱形)。向预先注射抗生物素抗体(无cys突变)24小时的动物注入生物素-cy5的血清水平和半寿期大大增加。这显示该抗体捕获循环中的(带有效载荷的)其抗原，并延长抗原(并同样延长缀合的有效载荷)的血清半寿期。向用抗生物素抗体-cys(即，含有如本文中报道用于共价偶联有效载荷的cys突变的抗体)预先注射24小时的动物注入的生物素-cys-cy5的相对血清水平和半寿期甚至进一步增加。在这些样品中，相对cy5水平不仅高于未复合的化合物的那些水平，还高于复合(但是未经二硫键结合)的cy5的水平。因此，半抗原复合的二硫键连接的有效载荷(其在预靶向条件下在体内形成)在循环中更稳定，并且可以达到比非共价复合的有效载荷更高的暴露水平。实施例15在缀合物中和在具有抗半抗原抗体的复合物中的多肽保留官能性我们先前已经显示，作为非共价半抗原-多肽缀合物的部分和在具有抗半抗原抗体的复合物中的多肽保留官能性(wo2011/003557、wo2011/003780和pct/ep2011/074273)。为了显示共价二硫键偶联时偶联的肽还保留官能性，比较了复合抗洋地黄毒苷抗体的多肽和它们与抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的二硫键缀合物的生物学活性。pyy衍生肽的治疗所需的官能团与其相关受体npy2结合并干扰其相关受体npy2的信号传导。借助npy2受体的信号传导参与和/或调节代谢过程。为了分别评价多肽dig-pyy与抗洋地黄毒苷抗体的复合或ss-缀合或者多肽dig-cys-pyy与抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的缀合是否影响其活性，我们在表达npy2受体的hek293细胞中评价其抑制毛喉素刺激的camp积累的能力(camp测定法)。下表6显示camp-测定法的结果，其中进行所述camp-测定法以评估pyy(3-36)、其y2受体特异修饰的类似物mopyy、其复合抗体的dig-变体和其二硫键缀合的dig-cys-衍生物的生物学活性。表6第1日第2日样品ec50[nm]ec50[nm]pyywt0.090.1mopyy0.140.15mopyy(cys-dig)-二硫键缀合的抗洋地黄毒苷抗体vh52bc5.385.33mopyy(dig)-抗洋地黄毒苷抗体复合物9.2612.55对于camp激动剂测定法，使用以下材料：384孔平板；tropixcamp-筛选试剂盒；campelisa系统(appliedbiosystems，目录号t1505；cs20000)；毛喉素(calbiochem目录号344270)；细胞：hek293/hnpy2r；生长培养基：dulbecco改良eagle培养基(d-mem，gibco)；10％胎牛血清(fbs，gibco)，热灭活；1％青霉素/链霉素(青霉素10000单位/ml：链霉素10000mg/ml，gibco)；500μg/mlg418(遗传霉素(geneticin)，gibco目录号11811-031)；和铺板培养基：dmem/f12w/o酚红(gibco)；10％fbs(gibco，目录号10082-147)，热灭活；1％青霉素/链霉素(gibco，目录号15140-122)；500μg/mlg418(遗传霉素，gibco，目录号11811-031)。为进行测定法，在第1日，弃去培养基，并将单层细胞用10mlpbs/瓶(t225)洗涤。用pbs滗析后，将5mlversene(gibco，目录号1504006)用来移除细胞(在37℃5分钟)。温和地拍打培养瓶并汇集细胞悬液。将每只培养瓶用10ml铺板培养基淋洗并以1000转/分钟离心5分钟。汇集悬液并计数。对于hek293/hnpy2r，将悬液以密度2.0x105个细胞/ml重悬于铺板培养基中。使用多点分液器，将50微升细胞(hek293/hnpy2r–10,000个细胞/孔)转移至384孔平板中。平板在37℃孵育过夜。在第2日，检查细胞是否到75-85％汇合度。使培养基和试剂达到室温。在制备稀释物之前，使二甲基亚砜(dmso，sigma，目录号d2650)中的刺激用化合物母液加温至32℃持续5-10分钟。在含有0.5mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx，calbiochem，目录号410957)和0.5mg/mlbsa的dmem/f12中制备稀释物。刺激培养基中的dmso终浓度是1.1％，毛喉素浓度为5μm。在纸巾上温和翻转细胞平板拍去细胞培养。每孔放置50μl刺激培养基(每个浓度一式四份进行)。将平板在室温温育30分钟，并且在显微镜下就毒性检查细胞。在30分钟处理后，弃去刺激培养基并添加(在tropix试剂盒中提供的)50μl/孔测试用裂解缓冲液。将平板在37℃温育45分钟。将20μl裂解物从刺激平板转移至来自tropix试剂盒的预包被抗体平板(384孔)。添加10μlap缀合物和20μl抗camp抗体。将平板在室温温育1小时，同时振摇。随后用洗涤缓冲液洗涤平板5次，每次洗涤70μl/孔。将平板拍干。添加30μl/孔cspd/sapphire-iirtu底物/增强溶液并在室温温育45分钟(振摇)。在光度计(victor-v)中测量信号持续1秒/孔。这些测定法的结果(表6)显示，修饰的肽衍生物mopyy比野生型pyy具有可忽略的较低活性。对于野生型pyy，camp测定法的ic50值是0.09nm并且对于修饰的类似物，是0.14nm。共价二硫键缀合导致生物学活性轻微降低。对于缀合物，ic50值是5-36nm。令人惊讶地，共价二硫键缀合物的活性比非共价复合物高2倍，ic50值为10.91nm。实施例16相比于生物素酰化cy5与人源化抗生物素抗体vh53c的共价缀合物，生物素酰化cy5与人源化抗生物素抗体的复合物的血清稳定性所述的肽修饰技术的目的是改善肽的治疗适用性。治疗性应用肽的主要瓶颈是目前有限的体内稳定性和/或短的血清半寿期和快速清除。荧光团的抗体缀合物的pk参数在体内测定并且与非共价抗体-荧光团复合物的pk比较。因此，(i)抗生物素抗体vh53c与生物素酰化荧光团biot-cys-cy5共价缀合，(ii)产生抗生物素抗体与生物素酰化荧光团biot-cy5的非共价复合物，(iii)将共价缀合的和非共价复合的化合物施加至动物，和(iv)通过测定cy5的荧光(a650)测量化合物在这些动物中随时间推移的血清浓度，并且通过特异性检测人源化抗体的elisa方法测量相应抗体在这些动物中随时间推移的血清浓度。实验方法为了分析对小荧光底物的抗体复合的pk参数的影响，对每种物质而言，将13nmol在20mm组氨酸/140mmnacl，ph6.0中的cy5-生物素/人源化抗生物素抗体vh53c-缀合物或抗体非共价复合的相应化合物或单独的荧光化合物施加至6只雌性小鼠(品系nrmi)。对于第一组中的小鼠1、2和3，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、4小时和48小时，并且对于第二组中的小鼠1、2和3，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、24小时和72小时。在室温1小时后通过离心(9300xg，3分钟，4℃)获得至少50μl血清样品。血清样品贮存在-80℃。为了确定化合物在给定时间点在血清中的量，利用cy5的荧光特性：在室温使用caryeclipse荧光分光光度计(varian)，在120μl石英比色皿中测量血清样品中的cy5相关荧光。激发波长是640nm，在667nm测量发射。将血清样品稀释于1xpbs中以达到适宜的发射强度范围。作为相应样品，使用1xpbs中相同稀释的未处理小鼠的血清作为空白探针并且它不显示任何荧光信号。图34显示使用共价缀合物、非共价复合物和未复合的半抗原-cy5时分析的结果。数据显示为对注射后5分钟的(峰)血清水平归一化的cy5-介导荧光的相对(％)水平。对于分子量相当小的化合物，未复合的生物素-ser-cy5从血清快速消失。注射后1小时，在血清中施加且5分钟后可检测的荧光中仅6％仍然可检出。在更晚的时间点，注射后2小时、4小时和24小时，不可检出cy5介导的信号。就抗体复合的化合物而言，注射后4小时，施加的荧光(5分钟水平设定成100％)中大约50％仍然在血清中可检出。还可以在更晚的时间点检出cy5-介导的荧光水平，注射后在2小时可检出22％的5分钟值，并在48小时可检出12％的5分钟值并且72小时候仍可检出8％的5分钟值。抗体缀合的化合物比抗体复合的化合物显示显著较长的体内半寿期。注射后4小时，大约58％施加的荧光(5分钟水平设定成100％)仍在血清中可检出(比抗体复合的化合物高1.16倍)。在24小时后，血清中检出35％(1.6倍)的cy5-介导荧光，在48小时后检出1％(2.6倍)的cy5-介导荧光，并且72小时后检出26％(3.3倍)的cy5-介导荧光。可以将实验头24个小时中复合化合物和缀合化合物的荧光的可比性下降解释为对于复合物和缀合物而言相似的早期分布。在24小时后，抗体缀合的化合物的体内稳定性是差异的原因。为了确定血清中人igg抗体在给定时间点的量，利用以下测定原理：将血清样品中的人igg1抗体在用抗人κ链单克隆igg抗体包被的固相(微量滴定平板，nunc-immunotm)上捕获。血清样品按1:105和1:106稀释并将100μl这些稀释物添加至各孔。在温育后，将孔每次用300μlpbs/0.05％tween20洗涤3次。通过首先以浓度0.25μg/ml添加100μl在c末端洋地黄毒苷化的抗人ch1域igg，实施人igg抗体的检测。在每次用300μl1xpbs/0.05％tween20洗涤3次后，以浓度25mu/ml添加与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的100μl抗洋地黄毒苷抗体fab片段。最后，每孔添加100μl在环境温度30分钟温育后，在商用微量滴定平板elisa读数仪(例如tecansunrise)中于405nm和492nm[405/492]处测量消光(od)。图34显示在用抗体-生物素-cy5-复合物和抗体-生物素-cy5-缀合物处理的小鼠中bio-cy5血清水平以及人igg的血清水平。数据显示为对注射后5分钟的(峰)血清水平归一化的人igg相对(％)水平。抗体-半抗原-复合物和抗体-半抗原-缀合物的人igg相对血清水平都与针对抗体-半抗原缀合物测量的相对荧光一致。因此，生物素-cys-cy5化合物显示类似于与之缀合的抗体的体内稳定性，这意味抗体-半抗原缀合物在体内保持完整。显然，对抗体-半抗原复合物不是这样，所述抗体-半抗原复合物的相对cy5-介导荧光比相对人igg血清水平下降得更快。这意味复合物在体内随时间推移释放有效载荷。总之，当被抗半抗原抗体结合时，半抗原化化合物的体内稳定性显著地增加。但是，抗体-半抗原复合物在体内不是完全稳定的，因为半抗原-cy5血清水平的下降比抗体血清水平的下降更快。对抗体-半抗原-cy5缀合物不是这样，所述抗体-半抗原-cy5缀合物显示与正常igg抗体相似的体内特征。dig-肽血清动力学(比较非共价复合物和共价缀合物)为了分析对洋地黄毒苷化多肽的抗体复合和抗体缀合的pk参数的影响，对于每种物质，将32.1nmol在20mm组氨酸/140mmnaclph6.0中的多肽或抗体非共价复合的相应多肽施加至2只雌性小鼠(品系nrmi)。施用mak-dig-pyy的小鼠具有23g和25g体重并且施用dig-pyy的小鼠具有28g和26g体重。对于小鼠1，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时，2小时和24小时，并且对于小鼠2，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、4小时、24小时。在室温1小时后通过离心(9300xg，3分钟，4℃)获得至少40μl血清样品。血清样品贮存在-80℃。与检测dig-cy5相比难以在给定时间点确定洋地黄毒苷化肽在血清中的量，因为无检测血清样品中多肽的直接手段可用。因此，建立蛋白质印迹相关的测定法以检测血清中的洋地黄毒苷化肽。在第一步骤中，在还原性sds-page上分离血清样品。因为样品制备包括使血清暴露于高浓度sds和还原剂，所以复合的dig-多肽缀合物可以变为从(完全变性/解折叠的)抗洋地黄毒苷抗体释放，而共价缀合物保持结合。为了介导多肽从非共价的抗体复合物释放并通过sds-page分离各种组分，将2μl每份血清样品稀释于18μl20mm组氨酸/140mmnaclph6.0中，在95℃与6.7μl4xlds样品缓冲液和3μl10x样品还原剂(nupage，invitrogen)混合5分钟。作为对照，使用2μl未处理的相同品系小鼠的血清。将样品施加至4-12％bis-tris凝胶(nupage，invitrogen)，其中使用1xmes(invitrogen)作为运行缓冲液，在200v/120ma运行所述凝胶20分钟。随后，使用xcellsuremini-cell系统(invitrogen)在25v/130ma运行40分钟，将分离的多肽印迹到pvdf膜(0.22μm孔径，invitrogen)上。将膜在室温在1xpbs+1％tween20(pbst)中的1％脱脂乳中封闭1小时。随后在膜上用抗洋地黄毒苷抗体检测洋地黄毒苷化多肽。为此，将抗洋地黄毒苷抗体以10ml1％脱脂乳/pbst中的浓度13μg/ml在室温施加至膜上2小时。将膜在1xpbst中洗涤3x5分钟。在室温于10ml1％脱脂乳/pbst中1:25稀释应用来自lumilightplus蛋白质印迹试剂盒(roche)的与pod偶联的抗小鼠iggfab片段1小时。将膜在1xpbst中洗涤3x5分钟。通过在4mllumilight蛋白质印迹底物中在室温温育该膜5分钟，实施检测。用lumiimagerf1(roche)检测化学发光，曝光时间20分钟。图35a和图35b中显示这些分析的结果。已经确定洋地黄毒苷多肽在不同时间点在鼠血清中的存在/量。已经接受抗体复合的肽的小鼠(图35左侧)在最早时间点显示强信号(施用后5分钟)。将这些信号明确地按照对照印迹物上的大小和位置归属。在用抗体复合的多肽处理的小鼠的血清中，多肽相关的信号在早期时间点最强烈并随时间推移降低。然而，在全部时间点和甚至施用后24小时仍然可检出多肽，信号良好。在接受未复合的多肽的小鼠中，甚至在最早时间点几乎没有任何与小多肽相关的信号可检出。图35在右侧显示在正常曝光条件下，印迹物上见不到游离多肽。印迹物的对比增强揭示在施用后5分钟存在一些多肽，然而仅以痕量存在。在更晚的时间点，不可检出确定的多肽条带。可以看出，未复合的多肽在小鼠的血清中具有非常短的半寿期。接受相同但处于抗体复合形式的多肽的小鼠显示这些多肽在血清中以增加时间期间存在。注射后24小时，可以在这些小鼠的血清中确定多肽。实施例17共价连接的洋地黄毒苷-抗体复合物和结合洋地黄毒苷的igg的血清半寿期为了分析共价复合相对于非共价连接的半抗原复合物是否进一步改善pk特性，体内确定抗洋地黄毒苷抗体-洋地黄毒苷-cy5复合物以及共价连接的[抗洋地黄毒苷抗体-cys]-[洋地黄毒苷-cys-cy5]缀合物的pk参数。因此，将洋地黄毒苷-cy5利用其荧光测定(a650)，并且通过特异性检测人源化抗体的elisa方法测定相应的抗体。将洋地黄毒苷-cy5作为半抗原偶联肽的低分子量‘替代物’使用，因为其荧光特性允许在血清中容易和精确的检测。按照与针对生物素-cy5或生物素-cys-cy5描述相同的方式(参见实施例16)，将洋地黄毒苷-cy5或抗体复合的洋地黄毒苷-cy5或另外地抗体-cys-连接的洋地黄毒苷-cy5静脉内注射至雌性nrmi小鼠中，随在0.08小时、2小时、4小时和24小时后采集血液。将注射后5分钟(t＝0.08小时)在两只小鼠中检测到的cy5-介导的荧光值设定为100％值并且将后续时间点处测量的荧光值相对它来表示。这些实验的结果显示对于洋地黄毒苷-cy5，在注射后2小时可检出少于施加的荧光(5分钟值)的10％。在更晚的时间点，分别在注射后4小时和24小时，不可检出cy5-介导的信号(参见图41)。与未复合的化合物相反，抗体复合的化合物以高得多的水平并且在更晚时间点可检出(图41)。这表明抗体复合显著地增加小化合物洋地黄毒苷-cy5的血清半寿期。另外，与非共价连接的复合物相比，共价连接的有效载荷显示更大的pk延长。直接比较洋地黄毒苷-cy5水平和抗体水平表明随时间推移有效载荷从抗体丢失，cy5水平比抗体水平下降更快。与之相反，共价连接的洋地黄毒苷-缀合物显示几乎相同的cy5和igg血清半寿期(图41)。这表示随时间推移，二硫键连接的有效载荷保持与抗体稳定连接，但非共价复合物解离。实施例18共价连接的半抗原-抗体复合物和仅通过半抗原结合位点连接的复合物的血清半寿期和暴露水平为了分析共价复合是否改善非共价连接的半抗原复合物的pk-特性，体内确定抗生物素抗体与生物素-cy5的复合物的pk以及共价连接的缀合物[抗生物素-抗体-cys]-[生物素-cys-cy5]的pk。通过揭示毛细管中cy5荧光的动物眼光学成像，以非侵入方式确定cy5的存在。将我们在注射后10分钟于小鼠眼中检测到的cy5介导的荧光值设定为100％值，并且相对该值表示在后续时间点测量的荧光值。图42中显示这些实验的结果：未复合的生物素-cy5本身具有低的血清半寿期和低的暴露水平。未共价连接的抗体复合的化合物以高得多的水平可检出并具有延长的半寿期。另外，与非共价连接的复合物相比，共价连接的有效载荷显示更大的pk延长和更高的血清水平。这表明，半抗原复合的二硫键连接的有效载荷在循环中更稳定，并且可以达到比非共价复合的有效载荷更高的暴露水平。实施例19肽与结合不同半抗原的抗体复合和共价缀合使用结合半抗原的模块以偶联半抗原化化合物(＝有效载荷)至靶向载体是藉此可以实现半抗原介导的递送的一种技术可能。可以将该概念扩展至捕获化合物并使它们与靶向模块连接的其他半抗原或其他实体。例如，对于多肽递送或稳定作用，可以使用结合洋地黄毒苷或其他半抗原的单特异性或双特异性抗体以稳定治疗性多肽及优化其pk。作为捕获多肽的模块应用的前提是(i)化合物与半抗原的偶联没有严重干扰多肽活性和(ii)抗体与半抗原化化合物的有效结合/复合的可能性。半抗原定向的结合是半抗原化染料或多肽与抗半抗原半胱氨酰化抗体有效共价偶联的前提。为显示亲和力驱动的半抗原化化合物与抗半抗原抗体的复合是有效形成二硫键的前提，将生物素-cys-cy5与人源化抗洋地黄毒苷抗体和人源化抗洋地黄毒苷抗体vh53c温育。实施生物素-cys-cy5与人源化抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体vh53c的温育作为对照反应。将0.13mg生物素-cys-cy5溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。0.7mg每种抗体以缓冲液中6.7mg/ml(约46μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将生物素-cys-cy5和抗体以2.5:1摩尔比(ac-生物素-cys-cy5对抗体)混合并在室温温育60分钟，以350转/分钟振摇。通过sds-page进一步分析所产生的复合物/缀合物并随后检测聚丙烯酰胺凝胶中cy5-相关的荧光。将15μg复合物/缀合物与4xlds样品缓冲液(invitrogen)混合并在95℃温育5分钟。使用lumiimagerf1仪(roche)在645nm激发波长记录cy5相关的荧光。当使用cdr2中无半胱氨酸的人源化抗生物素抗体时(图36，泳道3)，未还原的样品显示人源化抗生物素抗体vh53c的共价性位点特异性二硫键形成(图36，泳道4)，背景荧光信号非常低。当使用人源化抗洋地黄毒苷抗体时(图36，泳道1)，生物素-cys-cy5也共价偶联至人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc(图36，泳道2)，具有低的背景信号，但是效率显著较低。这可以从凝胶底部检出的过量生物素-cys-cy5推断出来(箭头)。在人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc的情况下，可以比人源化抗生物素抗体vh53c(泳道4)检出显著更多的未偶联的生物素-cys-cy5(泳道2)。当还原样品时，在抗体重链和轻链附近不可检测到cy5相关的荧光，这表明共价键的确由二硫键形成。每块凝胶的考马斯染色显示每条泳道中蛋白质的总量相等。实施例20半抗原定向的结合是半抗原化染料或多肽与抗半抗原的半胱氨酰化抗体有效共价偶联的前提。为显示半抗原化化合物与抗半抗原抗体的亲和力驱动的复合是有效形成二硫键的前提，将未半抗原化的肽ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2)(biosynthan1763.1，seqidno:178)与人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc和人源化抗洋地黄毒苷抗体温育。将1.4mgac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2)溶解于100％dmf中至浓度10mg/ml。2mg每种抗体以缓冲液中11-13mg/ml(约75-89μm)的浓度使用，所述缓冲液由50mmtris-hcl，1mmedta，ph8.2组成。将ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2)和抗体以2.1:1摩尔比(ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2)对抗体)混合。肽以3部分添加，同时将溶液以500转/分钟用搅拌棒搅拌。在每次添加之间，将样品以200转/分钟温育5分钟。在添加最后部分后，将样品在室温并以200转/分钟温育1小时。对于ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2):人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc缀合物，通过大小排阻层析，将所得的复合物/缀合物确定为97％单聚体igg样分子和3％二聚体可溶性聚集物，并且对于ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2):人源化抗洋地黄毒苷抗体复合物确定为100％单体。另外，通过质谱法分析所得的复合物/缀合物。对于ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2):人源化抗洋地黄毒苷抗体vh52bc缀合物，鉴定17％检测到的种类为与2个肽分子偶联的抗体，鉴定51％的种类为与1个肽分子偶联的抗体并且鉴定32％的种类为无偶联肽的抗体。对于ac-pyy(peg3-cys-4abu-nh2):人源化抗洋地黄毒苷抗体复合物，100％抗体未偶联。实施例21为形成正确折叠的结合半抗原的功能抗体所要求的二硫键样式，所述抗体具有用于共价偶联有效载荷的半胱氨酸突变用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的模块可以由包含‘标准’抗体如igg组成，所述标准抗体含有能够共价接合半抗原化化合物/有效载荷的额外半胱氨酸。如本文中报道的方法在折叠的结构域内部引入所需要的官能团(半胱氨酸)，所述结构域的结构和序列为抗体官能团提供基础。在抗体结构域内部以及之间正确形成确定的二硫键是形成并维持正确的结构和官能团官能性必需的。图37(a)显示为形成未修饰抗体的有功能结合臂fab所要求的二硫键样式，并且图37(b)显示为维持vh52cb/vh53c突变的抗体衍生物的结构和官能团官能性而必需的二硫键样式。为了维持正确的二硫键样式，在vh域中引入的额外半胱氨酸必须未被占据并且必须不干扰相邻的半胱氨酸或与之反应。图37(c)和图37(d)显示，添加额外的半胱氨酸产生以下可能性：在生物合成这类分子期间在vh域内部形成不正确的二硫键。vh52bc/vh53c位置位于vh域内部(并相当接近于其他半胱氨酸)的事实加大了不正确的二硫键可能在生物合成重链期间形成的风险。另一个潜在问题是vh域和vl域在分泌途径内部装配成一个fv片段。分泌途径涉及氧化还原改组条件和二硫键形成酶和改组酶。因此，因通过添加vh52bc/vh53c突变引入不正确二硫化物的可能性可以还‘扩散’至轻链的二硫键(在图37(e)中示例性显示在图37(e)中显示)。这进一步增加获得/产生不正确折叠的无功能分子的风险。因此相当令人惊讶的是即便这些风险，仍可以表达并获得大量含有vh52bc/vh53c突变的均一的功能抗体衍生物，且其并能够共价连接至半抗原化化合物/有效载荷的均一的功能抗体衍生物。实施例22具有用于共价偶联的半胱氨酸突变的二硫键稳定化抗半抗原单链fv片段的组成和产生用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的模块可以由‘标准’抗体如igg组成。备选地，它们可以是修饰的实体如重组fv或fab片段或其衍生物。经常使用单链fv片段作为全长抗体的备选物，特别地在其中需要小模块尺寸或其中需要额外的结合模块以产生双特异性或多特异性抗体衍生物的应用中。已经产生的抗半抗原fv衍生实体的一个例子是与洋地黄毒苷化化合物/有效载荷结合并共价连接的二硫键稳定的单链fv。借助富含gly和ser的柔性接头彼此连接抗洋地黄毒苷抗体vh域和vl域，产生具有dig-结合特异性的二硫键稳定的单链fv。这些vh域和vl域额外地在vh第44位置和vl第100位置(根据kabat等人的位置)携带半胱氨酸突变。这些额外的半胱氨酸在vh和vl之间形成稳定的分子间二硫键。这稳定了scfv，如先前所述(例如reiter,y.等人,naturebiotechnology14(1996)1239-1245)。除此之外，还分别在根据kabat编号法的第52b或53位置处将另一个半胱氨酸引入vh中，以向fv片段添加共价键官能团。但是，向二硫键稳定的fv片段中引入这种突变远比将它们安置在全长抗体中更有挑战性。单链fv片段比全长igg或fab片段内在地更不稳定，因为它们缺少恒定域作为稳定和强迫强制异二聚化的实体。可以通过向fv中安置额外的半胱氨酸突变如vh44-vl100二硫键赋予稳定性。但是，这种稳定原理仅在二硫键于正确位置在正确的半胱氨酸之间形成才有效发挥作用。因此，除了确定的域内二硫键(一个在vh中和一个在vl中)之外，需要形成一个单一确定的正确域间二硫键。非匹配性半胱氨酸之间的二硫键连接将产生错误折叠的不稳定和无功能的实体。考虑到二硫键稳定的fv片段含有6个半胱氨酸，则理论上可以形成21个不同的二硫键连接可以形成–但是仅正确组合的3个确定二硫键将形成有功能的稳定化scdsfv。当向vh域中添加另一个游离半胱氨酸时，这种困难加剧。所需的稳定化dsfv含有两个确定的域内二硫键(分别在vh和vl中)、一个确定的域间二硫键(在vh和vl之间)和进一步一个用于半抗原化化合物/有效载荷偶联的游离半胱氨酸(在vh中第52b/53位置处)。考虑到具有用于共价偶联的额外半胱氨酸突变的二硫键稳定化fv片段含有7个半胱氨酸，理论上许多不同的二硫键连接可以形成，但是仅3个确定的二硫键正确组合，同时在vh52b/vh53的额外的游离半胱氨酸位置确切游离，才将产生有功能的稳定化共价偶联有效的dsfv。一个额外困难的挑战是以下事实：额外的游离半胱氨酸(vh52b/vh53)紧邻于vh44半胱氨酸存在，所述vh44半胱氨酸不是天然存在的半胱氨酸，而是引入用于二硫键稳定的突变。vh44c是形成正确域间二硫键所需的，并且在不受这个理论约束的情况下，这种二硫键很可能在vh和vl独立折叠和装配后形成。靠近vh44c和vh52bc/vh53c加剧了域内二硫键不以正确方式形成的风险。但是已经发现，可以产生结合洋地黄毒苷并同时能够共价连接至洋地黄毒苷化有效载荷的二硫键稳定的有功能单链fv模块。图38中显示在正确位置含有正确二硫键和游离半胱氨酸的二硫键稳定的单链fv分子的组成及其与不想要的不正确折叠的分子的比较。在seqidno:190(vh)下列出了编码这种结合dig的scdsfv的轻链可变区和修饰的重链可变区的序列，所述scdsfv具有vh52bc突变fv抗体衍生物，并且在seqidno:189下列出了相应的vl。在实施例23(下文)以及在图40(a)、图40(b)和图40(c)中描述了成功产生这类dsfv作为用于产生双特异性抗体衍生物的模块。实施例23用于定向递送共价偶联的化合物/有效载荷的双特异性抗半抗原抗体衍生物的组成、表达和纯化产生这些双特异性抗体，它们含有用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的抗体模块。这些抗体额外地含有能够靶向其他抗原的结合模块。这类双特异性抗体的应用包括将半抗原化化合物/有效载荷特异性靶向至携带靶抗原的细胞或组织。产生的这类分子的一个例子是双特异性抗体，其具有识别肿瘤相关糖抗原ley的结合区并同时具有结合并共价连接洋地黄毒苷化化合物/有效载荷的二硫键稳定的fv。因此，二硫键稳定的单链fv通过富含gly和ser的柔性连接肽连接至ley抗体的ch3域的c末端，产生具有两个ley结合臂和额外地两个结合洋地黄毒苷的实体的四价分子。结合洋地黄毒苷的实体携带先前已经描述的vh44-vl100二硫键(例如reiter,y.等人,naturebiotechnology14(1996)1239-1245)。结合洋地黄毒苷的实体额外地含有用于共价偶联的vh52bc突变。在seqidno:191和seqidno:192下列出编码这种ley-dig抗体衍生物的轻链和修饰重链的序列。图39中示意性地显示作为用于共价偶联的化合物/有效载荷的递送载具的ley-dig双特异性抗体衍生物的组成。这些双特异性分子由分子生物学技术产生，通过从培养的细胞分泌来表达，随后按照与上文描述的相同方式从培养上清液纯化。图40(a)显示这种ley-dig(52bc)双特异性抗体的修饰h链和l-链在细胞培养上清液中的存在，这在检测抗体l链和h链的蛋白质印迹分析中可视化。图40(b)展示在还原剂存在下通过sds-page纯化后这些抗体的均一性。用考马斯亮兰对sds-page染色显现了与igg相关的多肽链，表观分子大小类似于其计算的分子量。图40(c)显示在蛋白a纯化后ley-dig(52bc)双特异性抗体的sec谱，其显示蛋白质制备物的均一性和其中缺少聚集物。因此，可以产生含有靶向模块以及用于共价偶联半抗原化化合物/有效载荷的模块的双特异性抗体并纯化至均匀。实施例24与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体-fab片段的x射线结构测定测定与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体fab片段的蛋白结构。因此，将fab片段的晶体在0.8m琥珀酸中生长，随后将抗体晶体载以生物胞素酰胺(在结晶溶液中稀释至10mm工作浓度，以结晶液滴施加至晶体)。将晶体用2μl10mm生物胞素酰胺溶液洗涤3次并且最后在21℃与生物胞素酰胺温育16小时，用15％丙三醇作为低温保护剂收获并且在液氮中急冻。处理的衍射图以分辨率产生蛋白结构。在图46中显示结合生物素的可变区的结构和电荷组成：生物素结合入旁侧分布有带电荷区域的表面口袋中，所述带电荷区域由来自cdr区的氨基酸组成。复合的半抗原与带负电荷的氨基酸簇紧邻存在。作为半抗原的经衍生化用于在其羧基偶联有效载荷的生物素以良好效价结合，因为在这个位置不存在电荷排斥作用(归因于缺少cooh基)。与之相反，游离(正常)生物素不能有效地与抗体结合，因为其羧基与这个负电荷簇紧邻并且因此被排斥。序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司<120>共价连接的抗原-抗体缀合物<130>31087wo<150>ep12174947.7<151>2012-07-04<160>192<170>patentin版本3.5<210>1<211>5<212>prt<213>小鼠（musmusculus）<400>1asptyralametser15<210>2<211>17<212>prt<213>小鼠<400>2serileasnileglyalathrtyralatyrtyrproaspservallys151015gly<210>3<211>16<212>prt<213>小鼠<400>3proglyserprotyrglutyrasplysalatyrtyrsermetalatyr151015<210>4<211>125<212>prt<213>小鼠<400>4gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalavalserglyphethrpheserasptyr202530alametsertrpileargglnthrprogluasnargleuglutrpval354045alaserileasnileglyalathrtyralatyrtyrproaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleuphe65707580leuglnmetserserleuglysergluaspthralamettyrtyrcys859095alaargproglyserprotyrglutyrasplysalatyrtyrsermet100105110alatyrtrpglyproglythrservalthrvalserser115120125<210>5<211>11<212>prt<213>小鼠<400>5argalaserglyasnilehisasntyrleuser1510<210>6<211>7<212>prt<213>小鼠<400>6seralalysthrleualaasp15<210>7<211>9<212>prt<213>小鼠<400>7glnhisphetrpserseriletyrthr15<210>8<211>107<212>prt<213>小鼠<400>8aspvalglnmetthrglnserthrserserleuseralaserleugly151015aspargvalthrilesercysargalaserglnaspilelysasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglyglythrvallysleuleuile354045tyrtyrserserthrleuleuserglyvalproserargphesergly505560argglyserglythrasppheserleuthrilethrasnleugluarg65707580gluaspilealathrtyrphecysglnglnserilethrleupropro859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体hvr-h1<400>9asptyralametser15<210>10<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体hvr-h2<400>10serileasnileglyalathrtyriletyrtyralaaspservallys151015gly<210>11<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体hvr-h3<400>11proglyserprotyrglutyrasplysalatyrtyrsermetalatyr151015<210>12<211>125<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体vh<400>12glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasptyr202530alametsertrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serserileasnileglyalathrtyriletyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargproglyserprotyrglutyrasplysalatyrtyrsermet100105110alatyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser115120125<210>13<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体hvr-l1<400>13argalaserglnaspilelysasntyrleuasn1510<210>14<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体hvr-l2<400>14tyrserserthrleuleuser15<210>15<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体hvr-l3<400>15glnglnserilethrleuproprothr15<210>16<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化抗洋地黄毒苷抗体vl<400>16aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspilelysasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrtyrserserthrleuleuserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnserilethrleupropro859095thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg10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