本发明涉及还原型谷胱甘肽的制备技术领域，特别地，涉及一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法。
背景技术：
谷胱甘肽(简称gsh)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽，分为还原型和氧化型两种形式，其中还原型谷胱甘肽具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽还能参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外，广泛应用于食品、药品领域。
目前谷胱甘肽的主要制备方法有溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。采用溶剂萃取法从动植物组织中提取谷胱甘肽时，由于谷胱甘肽提取率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，现已很少使用。化学合成法制备谷胱甘肽，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度也不高，难以推广。
酵母发酵法制备谷胱甘肽，工艺较成熟，发表的专利也较多，如cn200880019101.6、cn200810233834.1、cn200810039695.9，但上述制备方法中产物浓度和生产周期会受到酵母菌本体的先天限制，而且下游工艺的处理很复杂。
由于反应速度快、合成浓度高、产物纯度高等天然优势，酶法合成谷胱甘肽作为新一代制备谷胱甘肽的方法，逐步取代以往传统的萃取法、化学合成法和发酵法。专利cn200910199345.3利用一种双功能谷胱甘肽合成酶，一步合成得到谷胱甘肽。然而，酶法合成gsh最大的问题是三磷酸腺苷(简称atp)的大量消耗，atp不仅价格昂贵而且大大抑制酶活。为解决该问题，cn201210201691.2使用酵母糖酵解再生atp与gsh合成偶联，效果稳定，但使用酵母会引入大量色素和杂质，增加了纯化的困难。因此使用酶系再生atp成为酶法合成gsh的研究热点。
近年来，基因表达技术的迅猛发展和酶法合成谷胱甘肽工艺水平的不断提高，使得酶法合成谷胱甘肽大规模工业化应用变为现实。专利cn201510762184.x利用多聚磷酸盐酶系(pap、ppk、adk)再生atp，超滤除酶后，通过离子交换法回收流穿液中的atp、adp、amp，但该方法中atp用量偏大，并会进一步降解为amp，同时高能磷酸化合物回收工艺步骤多且较为复杂。
技术实现要素：
本发明提供了一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，以解决酶法合成谷胱甘肽atp使用量大、再生过程复杂的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：(1)盛有丙酮酸类物质及磷酸类物质的反应容器中通入氧气或空气，加入丙酮酸氧化酶和过氧化氢酶；(2)步骤(1)反应结束后，向反应容器中通入氮气或惰性气体，利用gshf合成还原型谷胱甘肽；利用乙酸激酶原位再生atp；(3)分离产物gsh和反应液中的atp、adp。
进一步地，丙酮酸氧化酶的来源为气球菌属；gshf的来源为链球菌属；乙酸激酶的来源为线粒体或嗜热芽胞杆菌。
进一步地，步骤(3)包括：(a)向反应容器中加入高分子聚合物；(b)利用酶膜反应器截留反应后的酶、atp和adp，与产物gsh分离。
进一步地，步骤(3)还包括步骤(b)中分离的反应后的酶、atp和adp的循环利用，即将分离的反应后的酶、atp和adp添加至反应容器中参与生成谷胱甘肽及再生atp的连续反应。
进一步地，酶膜反应器的截留分子量为1～10kda。
进一步地，循环利用的次数为1～30次。
进一步地，高分子聚合物为阳离子高分子聚合物，阳离子高分子聚合物为聚合伯胺型阳离子、聚合仲胺型阳离子、聚合叔胺型阳离子、聚合季胺型阳离子中的一种或几种。
进一步地，高分子聚合物与反应底物中atp的摩尔比为0.8～50∶1。
进一步地，阳离子高分子聚合物为二烯丙基季铵盐、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯酰胺的季铵盐衍生物、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺中的一种或几种。
进一步地，步骤(1)至步骤(3)在同一容器中进行。
进一步地，步骤(1)中丙酮酸类物质为丙酮酸、丙酮酸盐、丙酮酸酯中的一种或几种；磷酸类物质为磷酸或磷酸盐。
进一步地，步骤(2)中合成还原型谷胱甘肽的反应底物为谷氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐、镁离子及atp。
进一步地，步骤(2)的反应温度为10～30℃，反应的ph值为6.0～8.5。
进一步地，步骤(1)的反应容器中，丙酮酸氧化酶的浓度为0.2～5g/l，丙酮酸类物质的质量浓度为0.1～5％，磷酸类物质的质量浓度为0.5～5％；丙酮酸与磷酸的摩尔比为1∶0.3～5.0，丙酮酸与丙酮酸氧化酶的质量比为1∶0.02～0.5。
进一步地，步骤(2)的反应容器中，gshf的浓度为0.2～5g/l，乙酸激酶的浓度为0.2～5g/l，谷氨酸或其盐质量浓度为0.1～3％，甘氨酸或其盐质量浓度为0.1～3％，半胱氨酸或其盐质量浓度为0.1～3％，镁离子质量浓度为0.5～3％，atp质量浓度为0.01～0.25％。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，利用丙酮酸氧化酶(简称pox)和乙酸激酶(简称ack)偶联双功能谷胱甘肽合成酶(简称gshf)合成还原型谷胱甘肽，得到产物的同时原位再生atp，atp的消耗和再生同时进行，使高能磷酸化合物的循环限定在atp和二磷酸腺苷(简称adp)之间，且大量以atp形式存在，而不会进一步降解成单磷酸腺苷(简称amp)，使atp的再生更为经济。
2、本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，反应物中仅需要投入浓度极低的atp即可，而无需atp投入的摩尔数大于生成的谷胱甘肽摩尔数，成本低且不会抑制酶活。
3、本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，解除了高浓度高能磷酸化合物即底物atp和产物adp、amp对谷胱甘肽合成反应的抑制作用，使谷胱甘肽的生成浓度达到20g/l以上，且反应时间缩短。
4、本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，建立了新型的、更为简化和经济的酶法合成谷胱甘肽与atp再生的偶联体系，操作简单，成本低廉，适用于大规模的工业化生产。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的多酶体系制备还原型谷胱甘肽和atp原位再生的工艺流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：(1)盛有丙酮酸类物质及磷酸类物质的反应容器中通入氧气或空气，加入丙酮酸氧化酶和过氧化氢酶；(2)步骤(1)反应结束后，向反应容器中通入氮气或惰性气体，利用gshf合成还原型谷胱甘肽；利用乙酸激酶原位再生atp；(3)分离产物gsh和反应液中的atp、adp。
上述步骤中，丙酮酸类物质、磷酸类物质在丙酮酸氧化酶的作用下被氧化为乙酰磷酸和双氧水。反应底物在gshf作用下合成还原型谷胱甘肽，同时atp降解为adp。在乙酸激酶的作用下，上述得到的乙酰磷酸将生成的adp再生为atp，实现atp的原位再生。将产物gsh与反应液中的atp和生成的adp分离开，产物gsh可以进入下一步的提取步骤，atp、adp则可以循环利用，参与下一次反应。
本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，利用丙酮酸氧化酶(简称pox)和乙酸激酶(简称ack)偶联双功能谷胱甘肽合成酶(简称gshf)合成还原型谷胱甘肽，得到产物的同时原位再生atp，atp的消耗和再生同时进行，使高能磷酸化合物的循环限定在atp和二磷酸腺苷(简称adp)之间，且大量以atp形式存在，而不会进一步降解成单磷酸腺苷(简称amp)，使atp的再生更为经济。步骤(1)中还加入过氧化氢酶。步骤(1)中生成乙酰磷酸的同时，会有双氧水生成，而双氧水的存在会抑制pox的活性。加入过氧化氢酶可以将生成的双氧水分解为水和氧气，从而避免双氧水对pox活性的影响。
本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，反应物中仅需要投入浓度极低的atp即可，而无需投入atp的摩尔数大于生成的谷胱甘肽摩尔数，成本低且不会抑制酶活。
本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，解除了高浓度高能磷酸化合物即底物atp和产物adp、amp对谷胱甘肽合成反应的抑制作用，使谷胱甘肽的生成浓度达到20g/l以上，且反应时间缩短。
本发明的多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，建立了新型的、更为简化和经济的酶法合成谷胱甘肽与atp再生的偶联体系，操作简单，成本低廉，适用于大规模的工业化生产。
优选的，丙酮酸氧化酶的来源为气球菌属；gshf的来源为链球菌属；乙酸激酶的来源为线粒体或嗜热芽胞杆菌。采用上述来源的丙酮酸氧化酶、gshf和乙酸激酶参与还原型谷胱甘肽的制备，能够实现低浓度atp即可满足反应需要，并能够原位再生，避免对谷胱甘肽合成反应的抑制，提高谷胱甘肽的产量，且缩短反应时间。
优选的，步骤(3)具体为：(a)向反应容器中加入高分子聚合物；(b)利用酶膜反应器截留反应后的酶、atp和adp，与产物gsh分离。上述的反应中加入高分子聚合物可以与atp、adp结合，从而在酶膜反应器中被截留，与产物gsh和反应残留物分离，酶膜反应器的利用也便于反应后的酶、atp和adp保留下来参与下一次反应。酶膜反应器的应用，使atp无需经过超滤和离子交换等步骤即可进行原位再生、回收和多批次使用，工艺步骤得到极大地简化。
优选的，酶膜反应器的截留分子量为1～10kda。更优选的，酶膜反应器的截留分子量为2.5～10kda。采用上述截留分子量的酶膜反应器更有利于反应后的酶、atp、adp的截留和产物gsh透过反应器而进入下一步的提取工序。
优选的，步骤(3)还包括步骤(b)中分离的反应后的酶、atp和adp的循环利用，即将分离的反应后的酶、atp和adp添加至反应容器中参与生成谷胱甘肽及再生atp的连续反应。优选的，循环利用的次数为1～30次。更优选的，循环利用的次数为6～25次。
优选的，高分子聚合物为阳离子高分子聚合物，为聚合伯胺型阳离子、聚合仲胺型阳离子、聚合叔胺型阳离子、聚合季胺型阳离子中的一种或几种。更优选的，阳离子高分子聚合物为二烯丙基季铵盐、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯酰胺的季铵盐衍生物、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺中的一种或几种。采用上述阳离子高分子聚合物能够与atp、adp更好地结合，以便于在酶膜反应器中被截留，从而与产物gsh分离。
优选的，高分子聚合物与反应底物中atp的摩尔比为0.8～50∶1。更优选的，高分子聚合物与反应容器中atp的摩尔比为0.8～10∶1。再优选的，高分子聚合物与反应容器中atp的摩尔比为1～5∶1。采用过量的高分子聚合物能够保证atp、adp完全与之结合，从而保证将所有atp和adp通过酶膜反应器截留，便于与产物gsh分离。
优选的，步骤(1)至步骤(3)在同一容器中进行。步骤(1)至步骤(3)的反应可以在同一反应容器中进行，反应容器中可以设有酶膜，用于截留反应后酶、atp和adp，与产物gsh分离。
优选的，步骤(1)中丙酮酸类物质为丙酮酸、丙酮酸盐、丙酮酸酯中的一种或几种；磷酸类物质为磷酸或磷酸盐。采用上述丙酮酸类物质、磷酸类物质，在丙酮酸氧化酶的作用下被氧化为乙酰磷酸，作为将步骤(2)中生成的adp原位再生为atp的反应物，为atp的再生做准备。
优选的，步骤(2)中合成还原型谷胱甘肽的反应底物为谷氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐、镁离子及atp。
优选的，步骤(2)的反应温度为10～30℃，反应的ph值为6.0～8.5。更优选的，反应温度为15～20℃，反应的ph值为6.5～7.5。采用上述反应条件，更利于还原型谷胱甘肽的生成和atp的再生，提高还原型谷胱甘肽的产量，缩短反应时间。
优选的，步骤(1)的反应容器中，丙酮酸氧化酶的浓度为0.2～5g/l，更优选的2～3.5g/l，丙酮酸类物质的质量浓度为0.1～5％，更优选的1.5～3％，磷酸类物质的质量浓度为0.5～5％，更优选的1.5～3.5％；丙酮酸与磷酸的摩尔比为1∶0.3～5.0，丙酮酸与丙酮酸氧化酶的质量比为1∶0.02～0.5。
优选的，当反应容器的体积为2500l，反应液为1500l时，步骤(1)中通入氧气时的流量为1～50m3/h，更优选的12～16m3/h；通入空气时的流量为1～150m3/h，更优选的30～100m3/h，通入氧气或空气的时间为1～2h。
优选的，步骤(2)的反应容器中，gshf的浓度为0.2～5g/l，更优选的1～2.5g/l，乙酸激酶的浓度为0.2～5g/l，更优选的1～1.5g/l。谷氨酸或其盐质量浓度为0.1～3％，更优选的1.5～2.5％，甘氨酸或其盐质量浓度为0.1～3％，更优选的0.5～1.5％，半胱氨酸或其盐质量浓度为0.1～3％，更优选的1.5～2.5％，镁离子质量浓度为0.5～3％，更优选的1～2％，atp质量浓度为0.01～0.25％，更优选的0.05～0.1％。
优选的，步骤(2)中通入氮气或惰性气体时的流量为1～50m3/h，更优选的2～20m3/h，通入氮气或惰性气体的时间为1～30min。
上述反应物的用量中，atp的用量极低，成本大大地降低，同时不会因为atp的大量使用而抑制酶的活性。这是由于步骤(1)中生成的乙酰磷酸在乙酸激酶的作用下使atp原位再生。
优选的，产物gsh与反应残留物通过离子交换法分离。
实施例
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
以下各实施例中的化学试剂均为市售。
实施例1
本发明的优选实施例提供了一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，参照图1所示，包括以下步骤：
(1)在反应容器中，150l去离子水反应体系中含有丙酮酸3kg，磷酸2.8kg，用氢氧化钠调节ph值为6.7，加入250gpox酶液和330gcat酶液，反应期间控制反应温度为15℃，加入烯酸控制ph值为6.7，氧气流量为2m3/h，反应容器中的压力为0.08mpa，反应1.25h结束。其中pox酶的来源为气球菌属。
(2)反应容器中通入氮气0.5h，控制氮气的流量为2m3/h；投入反应底物谷氨酸2.8kg，甘氨酸1.5kg，半胱氨酸1.2kg，atp0.02kg，氯化镁1kg。投入gshf酶200g，乙酸激酶300g，反应期间利用稀碱控制ph值为8.0，温度为25℃，反应1h结束。用高效液相色谱检测反应容器中生成的还原型谷胱甘肽，浓度为20g/l；同时结果显示，atp大量存在，无adp和amp产生。其中，gshf的来源为链球菌属；乙酸激酶的来源为线粒体或嗜热芽胞杆菌。
(3)利用超滤和离子交换方法将产物gsh和反应液中的atp、adp分离。超滤采用截留分子量为10kda的超滤膜，先将要分离的混合液浓缩至死体积，再用纯化水顶洗至5倍体积即可。离子交换方法，选择市售的阳离子树脂，按吸附量10～50mggsh/克树脂吸附，流速2～6bv/h，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化钠溶液洗脱，收集即可。
(4)用盐酸调节产物gsh溶液(包括反应残留物)ph值为3.0，用市售的大孔强阳型离子交换树脂吸附溶液中的产物和其它反应残留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化钠溶液洗脱，用高效液相色谱检测直至85％以上的目标产物被洗脱，即得到分离纯化的还原型谷胱甘肽。
实施例2
本发明的优选实施例提供了一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，参照图1所示，包括以下步骤：
(1)在反应容器中，150l去离子水反应体系中含有丙酮酸3kg，磷酸2.8kg，用氢氧化钠调节ph值为6.7，加入250gpox酶液和330gcat酶液，反应期间控制反应温度为15℃，加入烯酸控制ph值为6.7，氧气流量为2m3/h，反应容器中的压力为0.08mpa，反应1.25h结束。其中pox酶的来源为气球菌属。
(2)反应容器中通入氮气0.5h，控制氮气的流量为2m3/h；投入反应底物谷氨酸2.8kg，甘氨酸1.5kg，半胱氨酸1.2kg，atp0.02kg，氯化镁1kg。投入gshf酶200g，乙酸激酶300g，反应期间利用稀碱控制ph值为8.0，温度为25℃，反应1h结束。用高效液相色谱检测反应容器中生成的还原型谷胱甘肽，浓度为21g/l；同时结果显示，atp大量存在，无adp和amp产生。其中，gshf的来源为链球菌属；乙酸激酶的来源为线粒体或嗜热芽胞杆菌。
(3)将步骤(2)中反应容器中的溶液转移到酶膜反应器中，并加入0.2kg市售的二甲基二烯丙基氯化铵，其中酶膜反应器的截留分子量为10kda，物料在酶膜反应器中循环。当检测到还原型谷胱甘肽全部过膜后，直接将未过膜的反应后的酶、atp和adp转至下一批反应。实验证明，反应后的酶、atp和adp的循环利用次数为1～30次，优选6～25次。
(4)用盐酸调节过膜液即产物gsh溶液(包括反应残留物)ph值为3.0，用市售的大孔强阳型离子交换树脂吸附溶液中的产物和其它反应残留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化钠溶液洗脱，用高效液相色谱检测直至85％以上的目标产物被洗脱，即得到分离纯化的还原型谷胱甘肽。
实施例1没有使用酶膜反应器，而是利用了超滤和离子交换方法分离产物，而实施例2中利用了酶膜反应器，两个实施例的区别如表1所示。
表1实施例1与实施例2的区别
实施例3
本发明的优选实施例提供了一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，参照图1所示，包括以下步骤：
(1)在反应容器中，100l去离子水反应体系中含有丙酮酸1.8kg，磷酸2.1kg，用氢氧化钠调节ph值为7.0，加入200gpox酶液和300gcat酶液，反应期间控制反应温度为21℃，加入烯酸控制ph值为6.7，空气流量为5m3/h，反应容器中的压力为0.08mpa，反应1.5h结束。其中pox酶的来源为气球菌属。
(2)反应容器中通入氩气0.5h，控制氮气的流量为4m3/h；投入反应底物谷氨酸2kg，甘氨酸0.9kg，半胱氨酸1kg，atp0.02kg，氯化镁0.8kg。投入gshf酶150g，乙酸激酶350g，反应期间利用稀碱控制ph值为7.5，温度为22℃，反应1h结束。用高效液相色谱检测反应容器中生成的还原型谷胱甘肽，浓度为22.3g/l；同时结果显示，atp大量存在，无adp和amp产生。其中，gshf的来源为链球菌属；乙酸激酶的来源为线粒体或嗜热芽胞杆菌。
(3)将步骤(2)中反应容器中的溶液转移到酶膜反应器中，并加入0.5kg市售的聚丙烯亚胺，其中酶膜反应器的截留分子量为5kda，物料在酶膜反应器中循环。当检测到还原型谷胱甘肽全部过膜后，直接将未过膜的反应后的酶、atp和adp转至下一批反应。实验证明，反应后的酶、atp和adp的循环利用次数为1～30次，优选6～25次。
(4)用盐酸调节过膜液即产物gsh溶液(包括反应残留物)ph值为3.2，用市售的大孔强阳型离子交换树脂吸附溶液中的产物和其它反应残留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化钠溶液洗脱，直至85％以上的目标产物被洗脱，即得到分离纯化的还原型谷胱甘肽。
实施例4
本发明的优选实施例提供了一种多酶体系制备还原型谷胱甘肽的方法，参照图1所示，包括以下步骤：
(1)在反应容器中，180l去离子水反应体系中含有丙酮酸3.2kg，磷酸3.3kg，用氢氧化钠调节ph值为7.2，加入300gpox酶液和400gcat酶液，反应期间控制反应温度为18℃，加入烯酸控制ph值为7.0，空气流量为3m3/h，反应容器中的压力为0.08mpa，反应1.5h结束。其中pox酶的来源为气球菌属。
(2)反应容器中通入氮气0.5h，控制氮气的流量为5m3/h；投入反应底物谷氨酸3.1kg，甘氨酸2kg，半胱氨酸2kg，atp0.18kg，氯化镁1.8kg。投入gshf酶400g，乙酸激酶450g，反应期间利用稀碱控制ph值为7.8，温度为20℃，反应1h结束。用高效液相色谱检测反应容器中生成的还原型谷胱甘肽，浓度为21g/l；同时结果显示，atp大量存在，无adp和amp产生。其中，gshf的来源为链球菌属；乙酸激酶的来源为线粒体或嗜热芽胞杆菌。
(3)将步骤(2)中反应容器中的溶液转移到酶膜反应器中，并加入0.6kg市售的甲基丙烯酸酯，其中酶膜反应器的截留分子量为1kda，物料在酶膜反应器中循环。当检测到还原型谷胱甘肽全部过膜后，直接将未过膜的反应后的酶、atp和adp转至下一批反应。实验证明，反应后的酶、atp和adp的循环利用次数为1～30次，优选6～25次。
(4)用盐酸调节过膜液即产物gsh溶液(包括反应残留物)ph值为3.0，用市售的大孔强阳型离子交换树脂吸附溶液中的产物和其它反应残留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化钠溶液洗脱，直至85％以上的目标产物被洗脱，即得到分离纯化的还原型谷胱甘肽。
对比例1
本对比例与实施例3大致相同，步骤(2)中没有加入乙酸激酶，用高效液相色谱检测反应容器中生成的还原型谷胱甘肽，浓度仅为1g/l；同时结果显示，atp基本都变为amp。
对比例2
本对比例与实施例3大致相同，步骤(2)中没有加入乙酸激酶，投入atp的质量为8g/l，用高效液相色谱检测反应容器中生成的还原型谷胱甘肽，浓度仅为12g/l。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。