一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物及其制备方法与流程

本发明涉及一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物及制备方法及用途，属于生物合成领域。
背景技术：
：无细胞蛋白质合成体系是一种以外源信使核糖核酸或脱氧核糖核酸为模板，在细胞提取物中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统，目前已经成为蛋白质领域的一大研究热点。其中细胞提取物的制备也从最初的大肠杆菌发展到各种不同的细胞。酵母作为一种真核细胞，遗传背景清晰，生长快速且廉价，用于无细胞蛋白质合成，具有生产快速、产量高、可生产需翻译后修饰蛋白的优点。目前还没有用于无细胞蛋白质合成的酵母细胞提取物的简单有效制备方法的报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物。本发明的第二个目的是提供一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物的用途。本发明的方案概述如下：一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)使用酵母浸出粉胨葡萄糖培养液培养酵母细胞，分离，收集酵母细胞；(2)收集的酵母细胞使用洗涤缓冲液洗涤2-5次，并用破碎缓冲液重新悬浮，进行破碎；离心分离，上清液即为用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物。酵母浸出粉胨葡萄糖培养液的组成：10-30g/l酵母浸出物，5-15g/l蛋白胨，25-35g/l葡萄糖，溶剂是去离子水。培养酵母细胞的条件为：温度25℃-32℃、转速为150rpm-250rpm，时间为3-18h。洗涤缓冲液的组成：ph＝7.2-7.6的20-50mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾，80-120mmol/l谷氨酸钾，1-4mmol/l谷氨酸镁，1-4mmol/l二硫苏糖醇，50g/l-100g/l甘露醇；溶剂是去离子水。破碎缓冲液的组成：ph＝7.2-7.6的20-50mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾，80-120mmol/l谷氨酸钾，1-4mmol/l谷氨酸镁，1-4mmol/l二硫苏糖醇，50g/l-100g/l甘露醇，0.2-0.8mmol/l苯甲基磺酰氟；溶剂是去离子水。步骤(2)所述破碎的方法为机械法、高压匀浆法、超声破碎法或玻璃珠法。步骤(2)所述离心的转速为20000×g-30000×g。上述方法制备的用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物。用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物用于体外快速合成蛋白质的用途。本发明的优点：本发明的优点是制备方法简单有效，步骤少，省去繁琐的透析过程，获得的细胞提取物可用于体外无细胞蛋白质合成。附图说明图1是实施例10、实施例11、实施例12制备的用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道1是实施例10制备的用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物，泳道2是实施例11制备的用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物，泳道3是实施例12制备的用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物。图2为使用用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物体外快速合成蛋白质的相对产量图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。本发明各实施例使用的酵母细胞来源：atcc4040002酿酒酵母by4741https://www.atcc.org/products/all/201388.aspx酵母浸出粉胨葡萄糖培养液的组成见表1的实施例1-3表1实施例1实施例2实施例3酵母浸出物10g/l20g/l30g/l蛋白胨5g/l10g/l15g/l葡萄糖25g/l30g/l35g/l溶剂是去离子水补足至1l补足至1l补足至1l洗涤缓冲液组成见表2的实施例4-6表2破碎缓冲液组成见表3的实施例7-9表3实施例10一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)使用实施例1的酵母浸出粉胨葡萄糖培养液，在温度为25℃、转速为150rpm，培养酵母细胞的时间为3h；分离，收集酵母细胞；(2)收集的酵母细胞用实施例4的洗涤缓冲液洗涤酵母细胞2次，并用实施例7的破碎缓冲液进行重悬；用机械法进行破碎，在转速为20000×g进行离心，上清液即为用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物。实施例11一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)使用实施例2的酵母浸出粉胨葡萄糖培养液，在温度为28℃、转速为200rpm，培养酵母细胞时间为10h；分离，收集酵母细胞；(2)收集细胞后用实施例5的洗涤缓冲液洗涤酵母细胞3次，并用实施例8的破碎缓冲液进行重悬，用高压匀浆法进行破碎，在转速为25000×g进行离心，上清即为用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物。实施例12一种用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)使用实施例3的酵母浸出粉胨葡萄糖培养液，在温度为32℃、转速为250rpm，培养酵母细胞时间为18h；分离，收集酵母细胞；(2)收集细胞后用实施例6的洗涤缓冲液洗涤酵母细胞5次，并用实施例9的破碎缓冲液进行重悬，用超声破碎法进行破碎，在转速为30000×g进行离心，上清即为用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物。本实施例中的破碎方法还可以采用玻璃珠法。实施例10、实施例11、实施例12制备的用于无细胞蛋白质合成的酵母提取物见图1。实施例13用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物，体外快速合成蛋白质的用途。将实施例10制备的用于无细胞蛋白质合成的酵母提取物与外加反应物和基因质粒混合，置于恒温反应容器中，在30℃放置6h。用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物、外加反应物和基因质粒的体积比为15:25:1。外加反应物由按体积比为5:25:3:1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为50μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为10mmol/l的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；反应缓冲液包括：55mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100mmol/l谷氨酸钾、15mmol/l谷氨酸镁、25mmol/l3-磷酸甘油酸、7.5mmol/l环磷酸腺苷、3.3mmol/l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、3.3mmol/l辅酶a、0.5mmol/l亚叶酸、3.3mg/ml转运核糖核酸、0.5mmol/l亚精胺；溶剂是去离子水；能量补充液包括：2mmol/l三磷酸尿苷，2mmol/l三磷酸胞苷，2mmol/l三磷酸腺苷，6mmol/l三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。基因质粒为prset-egfp(购于：promegacorporation)。实施例14将实施例11制备的用于无细胞蛋白质合成的酵母提取物与外加反应物和基因质粒混合，置于恒温反应容器中，在30℃放置6h。用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物、外加反应物和基因质粒的体积比为15:25:1外加反应物由按体积比为5:25:3:1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为50μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为10mmol/l的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；反应缓冲液包括：55mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100mmol/l谷氨酸钾、15mmol/l谷氨酸镁、25mmol/l3-磷酸甘油酸、7.5mmol/l环磷酸腺苷、3.3mmol/l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、3.3mmol/l辅酶a、0.5mmol/l亚叶酸、3.3mg/ml转运核糖核酸、0.5mmol/l亚精胺；溶剂是去离子水；能量补充液包括：2mmol/l三磷酸尿苷，2mmol/l三磷酸胞苷，2mmol/l三磷酸腺苷，6mmol/l三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。基因质粒为prset-egfp(购于：promegacorporation)。实施例15将实施例12制备的用于无细胞蛋白质合成的酵母提取物与外加反应物和基因质粒混合，置于恒温反应容器中，在30℃放置6h。用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物、外加反应物和基因质粒的体积比为15:25:1外加反应物由按体积比为5:25:3:1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为50μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为10mmol/l的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；反应缓冲液包括：55mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100mmol/l谷氨酸钾、15mmol/l谷氨酸镁、25mmol/l3-磷酸甘油酸、7.5mmol/l环磷酸腺苷、3.3mmol/l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、3.3mmol/l辅酶a、0.5mmol/l亚叶酸、3.3mg/ml转运核糖核酸、0.5mmol/l亚精胺；溶剂是去离子水；能量补充液包括：2mmol/l三磷酸尿苷，2mmol/l三磷酸胞苷，2mmol/l三磷酸腺苷，6mmol/l三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。基因质粒为prset-egfp(购于：promegacorporation)。实施例13、实施例14、实施例15合成的蛋白质产量见图2。实验证明，其它酵母细胞可以用于本发明。当前第1页12