一种煤地质微生物菌群传代保藏方法与流程

本发明属于微生物保藏技术领域，具体涉及一种煤地质微生物菌群传代保藏方法，尤其是能在常温下长期保藏。

背景技术：

开展煤炭生物气化实验，菌种是关键因素之一，由于煤炭生物气化使用的菌源是一个混合菌群，至少包含水解菌、发酵菌、产氢产乙酸菌和产甲烷菌等四类微生物，各种微生物的生理生化特性不一，通用的低温保藏法造成的结果是活化后的菌源重新用于煤炭生物气化，产生的气体中只有氢气，没有甲烷，不适用于煤地质微生物菌群的保藏。

煤炭生物气化是一个需要进行长期大量实验的课题，需要开展一些列实验，每次实验都到现场取样既浪费人力物力，且难以保证每次取样的菌群结构都一致，造成不同批次实验间的变量增多，实验结果难以对比分析。

此外，随着开采年限的增长，许多煤层气井的产水量越来越低，有的已经枯竭，含有较好产气菌群的煤层气井一旦停止产水，将直接导致微生物资源的丢失，难以采样进行后续实验。

技术实现要素：

本发明为了克服现有菌种保藏方法对煤地质微生物菌群进行保藏，活化后的煤地质微生物菌群产甲烷气的活力严重降低，且不能满足实验对菌源的大量需求的问题，提供了一种煤地质微生物菌群传代保藏方法，该方法不仅能够实现菌群保藏功能，而且能满足实验对菌源的大量需求，该法保存的菌种无需活化，可以直接用于接种，开展其它实验。

本发明由如下技术方案实现的：一种煤地质微生物菌群传代保藏方法，包括如下步骤：

（1）采样：选择高产甲烷气的煤层气井，采集井口出水作为菌源，采集的菌源利用氮气罐在现场曝气5-10min，然后密封带回实验室；

（2）接种：发酵罐中提前加入10kg无烟煤块煤和40l浓度为原培养基的2倍的培养基，曝氮气25-35min，现场带回的作为菌源的水40l泵入发酵罐中，再次曝气30min；

（3）培养：发酵罐温度控制为30℃恒温培养，每天记录压力表读数，根据压力变化绘制一个周期产气曲线图，每周抽取发酵罐顶空气体测量甲烷含量,一个产气周期分为三个阶段：第一阶段从培养开始至8-12天，第二阶段从培养10-12天至38-42天，第三阶段为40-42天之后；

(4)补料：培养至第三阶段，压力变化趋于稳定，甲烷含量稳定，抽放掉一半罐内的发酵液，补加等量灭菌的原培养基，使得罐内培养基终浓度与原培养基浓度一致，然后重复步骤（3）继续培养菌种，待培养至第三阶段再次补加培养基；依次循环培养菌种；

其中：所述原培养基配方为：超纯水1l、酵母粉2g、k2hpo42.9g、kh2po41.5g、nh4cl1.8g、mgcl20.4g。

采集任意一个产气周期第二阶段的发酵液接种进行菌种的实验。

本发明通过周期性的放出发酵液-补加新鲜培养基，可以实现煤地质微生物产甲烷菌群的长期保藏。发酵罐内加入块煤，可以为所要培养的菌种提供生长必须的碳源，同时也作为产甲烷的底物，也可以作为菌种粘附介质；采用本发明所述的周期性放出发酵液-补加新鲜培养基进行培养菌种，可以保存产气效果好的菌群，尤其是面临枯水的煤层气井的菌种，保藏的菌种无需活化直接可以作为其它实验的菌源。可保证菌源的相对稳定，长期保存不再出水的煤层气井的菌源，避免频繁上山采样。

附图说明

图1为本发明所述煤地质微生物菌群传代保藏方法的流程图；图2为培养第一产气周期发酵罐内气体压力变化图，图中标注百分数为甲烷含量；图3为培养第五产气周期发酵罐内气体压力变化图，图中标注百分数为甲烷含量；图4为培养第十产气周期发酵罐内气体压力变化图，图中标注百分数为甲烷含量；图5为培养第十产气周期第二阶段菌种作为菌源实验产气量结果图，图中标注百分数为甲烷含量。

具体实施方式

实施例1：一种煤地质微生物菌群传代保藏方法，包括如下步骤：

（1）采样：根据山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司煤与煤层气共采国家重点实验室前期实验经验，选择产甲烷气丰富的煤层气井shx121，利用10l塑料桶采集井口出水40l作为菌源，采集的菌源每桶分别利用氮气罐在现场曝气5-min，然后迅速密封带回实验室；

（2）接种：200l的发酵罐中提前加入10kg晋煤集团寺河矿煤块，煤块直径为5cm，然后加入40l浓度为原培养基的2倍的培养基，曝氮气25min，现场带回的作为菌源的水40l迅速泵入发酵罐中，再次曝气30min，此时发酵罐内培养基浓度还原为原培养基浓度；

（3）培养：发酵罐温度控制为30℃恒温培养，每天记录压力表读数，根据压力变化绘制一个周期产气曲线图，每周抽取发酵罐顶空气体测量甲烷含量,一个产气周期分为三个阶段：第一阶段从培养开始至8天，第二阶段至培养第38天，第三阶段为培养40天之后；第一阶段产甲烷菌缓慢繁殖，产气量缓慢增长；第二阶段产甲烷菌达到较高水平，产气量显著增长；第三阶段产甲烷菌由于反应产物不能有效排除而抑制其生长，产气量趋于减缓；

(4)补料：培养至第三阶段，压力变化趋于稳定，甲烷含量稳定，说明产甲烷菌停止产气，表现为压力表读数稳定，抽放掉一半罐内的发酵液，补加等量灭菌的原培养基，使得罐内培养基终浓度与原培养基浓度一致，然后重复步骤（3）继续培养菌种，待培养至第三阶段再次补加培养基；依次循环培养菌种；

（5）重复步骤（4）和步骤（3），在第一个产气周期、第五个产气周期、第十个产气周期检测发酵罐内气体压力以及甲烷含量变化。

其中：所述原培养基配方为：超纯水1l、酵母粉2g、k2hpo42.9g、kh2po41.5g、nh4cl1.8g、mgcl20.4g。

实施例2：一种煤地质微生物菌群传代保藏方法，包括如下步骤：

（1）采样：根据山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司煤与煤层气共采国家重点实验室前期实验经验，选择产甲烷气丰富的煤层气井shx121，利用10l塑料桶采集井口出水40l作为菌源，采集的菌源每桶分别利用氮气罐在现场曝气8min，然后迅速密封带回实验室；

（2）接种：200l的发酵罐中提前加入10kg晋煤集团寺河矿煤块，煤块直径为8cm，然后加入40l浓度为原培养基的2倍的培养基，曝氮气30min，现场带回的作为菌源的水40l迅速泵入发酵罐中，再次曝气30min，此时发酵罐内培养基浓度还原为原培养基浓度；

（3）培养：发酵罐温度控制为30℃恒温培养，每天记录压力表读数，根据压力变化绘制一个周期产气曲线图，每周抽取发酵罐顶空气体测量甲烷含量,一个产气周期分为三个阶段：第一阶段从培养开始至10天，第二阶段培养至40天，第三阶段为41天之后；第一阶段产甲烷菌缓慢繁殖，产气量缓慢增长；第二阶段产甲烷菌达到较高水平，产气量显著增长；第三阶段产甲烷菌由于反应产物不能有效排除而抑制其生长，产气量趋于减缓；

(4)补料：培养至第三阶段，压力变化趋于稳定，甲烷含量稳定，说明产甲烷菌停止产气，表现为压力表读数稳定，抽放掉一半罐内的发酵液，补加等量灭菌的原培养基，使得罐内培养基终浓度与原培养基浓度一致，然后重复步骤（3）继续培养菌种，待培养至第三阶段再次补加培养基；依次循环培养菌种；

（5）重复步骤（4）和步骤（3），在第一个产气周期、第五个产气周期、第十个产气周期检测发酵罐内气体压力以及甲烷含量变化，结果见图2-4。

其中：所述原培养基配方为：超纯水1l、酵母粉2g、k2hpo42.9g、kh2po41.5g、nh4cl1.8g、mgcl20.4g。

实施例3：一种煤地质微生物菌群传代保藏方法，包括如下步骤：

（1）采样：根据山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司煤与煤层气共采国家重点实验室前期实验经验，选择产甲烷气丰富的煤层气井shx121，利用10l塑料桶采集井口出水40l作为菌源，采集的菌源每桶分别利用氮气罐在现场曝气10min，然后迅速密封带回实验室；

（2）接种：200l的发酵罐中提前加入10kg晋煤集团寺河矿煤块，煤块直径为10cm，然后加入40l浓度为原培养基的2倍的培养基，曝氮气35min，现场带回的作为菌源的水40l迅速泵入发酵罐中，再次曝气30min，此时发酵罐内培养基浓度还原为原培养基浓度；

（3）培养：发酵罐温度控制为30℃恒温培养，每天记录压力表读数，根据压力变化绘制一个周期产气曲线图，每周抽取发酵罐顶空气体测量甲烷含量,一个产气周期分为三个阶段：第一阶段从培养开始至12天，第二阶段至42天，第三阶段为42天之后；第一阶段产甲烷菌缓慢繁殖，产气量缓慢增长；第二阶段产甲烷菌达到较高水平，产气量显著增长；第三阶段产甲烷菌由于反应产物不能有效排除而抑制其生长，产气量趋于减缓；

(4)补料：培养至第三阶段，压力变化趋于稳定，甲烷含量稳定，说明产甲烷菌停止产气，表现为压力表读数稳定，抽放掉一半罐内的发酵液，补加等量灭菌的原培养基，使得罐内培养基终浓度与原培养基浓度一致，然后重复步骤（3）继续培养菌种，待培养至第三阶段再次补加培养基；依次循环培养菌种；

（5）重复步骤（4）和步骤（3），在第一个产气周期、第五个产气周期、第十个产气周期检测发酵罐内气体压力以及甲烷含量变化。

其中：所述原培养基配方为：超纯水1l、酵母粉2g、k2hpo42.9g、kh2po41.5g、nh4cl1.8g、mgcl20.4g。

实验例1：菌源利用实验：山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司煤与煤层气共采国家重点实验室进行实验，取10g河南义马矿煤粉（80目以下）加入到500ml抽滤瓶中，再加入300ml原培养基，配方与实施例1所述原培养基配方相同，灭菌后送入厌氧箱中除氧，氧气除尽后加入10ml第十周期第二阶段（第20天）的发酵液作为菌源，30℃恒温培养，排水集气法收集产生的气体。产甲烷气曲线如图5。结合图5说明该传代保藏法可以保证菌源的产甲烷气的活性。