从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷及其制备方法与流程

本发明涉及天然产物分离纯化技术领域，尤其涉及从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷及其制备方法。

背景技术：

据世界卫生组织报告[edwardsbk,etal.cancer,2014,120(9):1290-1314.]，全世界每年死于癌症的病人约700万人左右，未来10年，癌症发病率与死亡率仍将继续攀升。目前，我国癌症发病率在最近几年持续升高，据统计，每年新增癌症病人250万人，治疗费用在1500亿以上[globocan:iarc,2014.siegelrl,etal.ca:acancerjournalforclinicians,2015,65(1):5-29.]。其中，结直肠癌(colorectalcancer,crc)是全世界发病率和死亡率最高的癌症之一。众所周知它是第三常见的肠癌。最近，结肠癌的发病率持续升高主要是因为饮食习惯的改变。因此，饮食对于结肠癌的预防尤为重要。众多药理学研究表明天然产物对于预防癌症具有重要作用。化学疗法在治疗癌症的同时会产生严重的副作用。大量的植物被用来研究其抗癌作用以便替代合成药，事实上，很多植物在民间被用来治疗各种疾病，这与其高效和安全是分不开的。因此越来越多的抗癌药物从植物中获取保持着持续增长的趋势。据统计，在美国2014年大约有71830男性和65000女性患有结肠癌，26270男性和24040女性死于结肠癌疾病[siegelr,etal.ca:acancerjournalforclinicians,2014,64(2):104-117.]。

油茶(camelliaoleiferaabel)属于山茶科，是一种经济价值很高的树种，同时也是世界四大木本油料之一，主要集中在我国南部地区像广西、湖南、以及江西等省[huj,etal.pakistanjournalofbotany,2016,48(3):899-905.]。之前的生物活性研究揭示油茶全株具有显著的神经保护作用、抗炎、抑菌、驱虫、止咳、抗氧化以及抗癌等活性[hujl,etal.internationaljournaloffoodscience&technology,2012,47(8):1676-1687；sugimotos,etal.chemicalandpharmaceuticalbulletin,2009,57(3):269-275；chenl,etal.fitoterapia,2013,84:123-129；chengyt,etal.journalofagriculturalandfoodchemistry,2014,62(3):642-650；hujl,etal.journalofthescienceoffoodandagriculture,2012,92(12):2443-2449；yey,etal.internationaljournalofnanomedicine,2014,9:4475.]。

茶蒲，也称为油茶果壳，是油茶果实分离茶籽的副产物，大部分被当做垃圾扔掉或者当做燃料燃烧。对其化学成分并未提取和开发，这不仅造成资源的严重浪费，而且对环境也造成了污染。齐墩果烷型三萜皂苷，具有抗炎、抗癌以及神经保护的作用。但是，从油茶蒲中提取齐墩果烷型三萜皂苷的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷及其制备方法，可以从油茶蒲中分离提取得到齐墩果烷型三萜皂苷。本发明的另一个目的是提供27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷的抗肿瘤活性功效用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供的从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷及其制备方法是这样实现的：

一种从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷，其结构式如下：

从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷的制备方法，包括如下步骤：

油茶蒲粉碎经超声波提取、减压浓缩成粗浸膏；所述粗浸膏用水打散成悬浮液，经溶剂萃取、减压浓缩制成萃取后的浸膏；所述萃取后的浸膏溶解进行大孔树脂色谱分离，特征馏分浓缩；浓缩的特征馏分经溶解静置后离心，再经热溶解，结晶后得从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷。

可选的，所述粉碎后油茶蒲超声波提取液为浓度为50％-90％的乙醇，料液比为：1:1-30。

可选的，所述萃取剂为饱和的正丁醇或正丙醇。

可选的，溶解所述萃取后的浸膏的溶液是浓度为1％-20％的乙醇或甲醇溶液；所述大孔树脂色谱分离是使用20％-100％的乙醇或甲醇洗脱液梯度洗脱。

可选的，所述特征馏分是经tlc检测确定其中含有三萜类物质的馏分。

可选的，溶解所述浓缩的特征馏分的溶液是：浓度为80-100％的甲醇或乙醇溶液，静置的温度是3-5℃。

可选的，所述热溶解的溶剂为：正丁醇、石油醚、氯仿、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或丙酮中的两种或三种的混合物。

可选的，所述热溶解时，加入吸附剂。

本发明利用萃取、柱色谱以及结晶等方法快速从油茶蒲中分离得到一种新的齐墩果烷性三萜皂苷，该方法简易、高效、投资少，使用油茶蒲作为原料相对于现有技术齐墩果烷型三萜皂苷的制备来说成本低，且适合大规模生产。

附图说明

图1是本发明实施例一从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷的质谱图；

图2是本发明实施例一从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷的氢谱图；

图3是本发明实施例一从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷的碳谱图；

图4是本发明实施例一从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷的hmbc谱图；

图5不同浓度齐墩果烷型三萜皂苷对ht-29细胞和hek293细胞增殖作用的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明从油茶蒲中提取的齐墩果烷型三萜皂苷结构式如下：

分子式为c48h78o18，化学名为化合名为：27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷，其对应英文名为：27-hydroxy-28-o-β-d-glucopyranosyloleanolate3-o-[a-l-,rhamnosyl(1”→2')]-β-d-glucopyranoside。该化合物为白色，其熔点为(mp)：228—230℃，紫外光谱分析其在218nm有最大吸收，红外光谱分析显示在3350cm^-1(oh)、2969cm^-1(ch2)、1723cm^-1(coor)、1600cm^-1(co)、1342cm^-1(ch3)处有吸收，esi-msm/z[m-h]^-为941。

从油茶蒲中提取上述化合物的方法如下：

(1)将干燥的油茶蒲粉碎，粉碎后过100目筛，按料液比1:1-30加入体积百分浓度为50％-90％的乙醇水溶液，超声波提取1-5次，每次10-60分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。

其中，料液比优选地选择是1:10-20，乙醇水溶液体积浓度优选地是80％-90％，超声波提取优选地是3-4次，每次20-30min，提取温度是40℃。超声波功率在50-100w。

(2)将超声波提取后的浸膏加入少量水超声振荡成悬浮液，使用有机溶剂进行萃取，萃取次数3-5次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

作为萃取剂的有机溶剂是：饱和的正丁醇或者正丙醇。

(3)将萃取后的浸膏用含有1％-20％的乙醇或甲醇溶液溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，使用20％-100％的乙醇或甲醇溶液梯度洗脱；洗脱液经薄层色谱(thinlayerchromatography，tlc)检测，有紫色斑点的洗脱液即确定含有三萜类物质，确定为特征馏分；收集特征馏分，将具有相同特征的馏分浓缩至原料的0.05-0.1倍。

本发明收集的特征馏分是收集60％-80％乙醇段或甲醇段馏分，所述原料是收集的特征馏分总量。

(4)在浓缩的特征馏分中加入质量为其1-5倍的浓度为80％-100％的乙醇或甲醇溶液，在3-5℃下静置30min-60min，然后离心，离心机转速4000r/min,离心时间30min；离心后的固体加入有机溶剂热溶解，并加入吸附剂吸附除杂，过滤，反复结晶，制得27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷。

其中，加入有机溶剂的量是离心后固体的7-10倍，有机溶剂选择正丁醇、石油醚、氯仿、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或丙酮中的两种或三种的混合物，两种或三种有机溶剂按比例混合；优选氯仿与甲醇混合，混合比例1:3，使用量是离心固体的10倍；优选氯仿与甲醇混合，混合比例1:4，使用量是离心固体的8倍；优选氯仿与甲醇混合，混合比例1:3，使用量是离心固体的10倍；优选正丁醇、石油醚和丙酮混合，混合比例1:1:1，使用量是离心固体的9倍；优选乙醇和乙酸乙酯混合，混合比例2:1，使用量是离心固体的7倍；优选氯仿、甲醇和乙醇混合，混合比例1:1:2，使用量是离心固体的10倍。

其中吸附剂选择活性炭、活性氧化镁或活性硅藻土，优选活性炭。

以下通过实施例详细说明本发明提供的齐墩果烷型三萜皂苷及其制备方法。

实施例一

取500g粉碎的油茶蒲，按料液比1:10(g/ml)的比例加入体积百分浓度80％的乙醇水溶液，超声波提取5次，每次20分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。

在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用正丁醇进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

萃取后的浸膏用含有10％的乙醇进行溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，用20—100％的乙醇梯度洗脱，洗脱液经tlc检测80％乙醇段馏分显色有紫色斑点，收集80％乙醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至原料的0.05倍。

向特征馏分浓缩液中加入质量为浓缩液5倍的浓度为98％的乙醇，放置在4℃的冰箱中静置12h，离心过滤后，加入10倍量的氯仿和甲醇按1:3混合的有机溶剂热溶解，并加入活性炭吸附除杂，过滤，反复结晶，得白色粉末状物质0.324g。

经质谱与核磁共振谱鉴定为27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷。鉴定数据如表1所示。

表1.27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷的¹h-nmr(400mhz)和¹³c-nmr(100mhz)谱数据(c5d5n)

由电喷雾电离质谱(esi-ms)分析该物质的分子量为942，如图1所示；结合氢谱和碳谱得出其分子式为c48h78o18，不饱和度为10，¹h-nmr数据如图2和表一所示，显示7个甲基[δh0.83(h-25),1.08(h-24),0.85(h-30),0.96(h-29),1.11(h-6”),0.98(h-26),1.27(h-23)],1个烯键质子[δh5.30(1h,s,h-12)],3个糖端基质子[δh4.85(1h,d,j＝13.1hz,h-1'),5.32(1h,d,j＝7.8hz,h-1”),6.02(1h,d,j＝7.8hz,h-1”')]。¹³c-nmr中如图3和表一所示，30个碳信号可归属于苷元，另外18个碳信号可归属于3个六碳糖，这是典型的齐墩果烷型骨架。如图4所示，hmbc谱中,δc139.05和δh5.30(h-12)、0.98(h-26)、2.65(h-18)、1.34(h-19),δc128.2和δh2.01(h-11)、0.98(h-26)、2.65(h-18),1.34(h-19),δh5.30和δc24.41(c-11)、139.05(c-13)、41.90(c-18)、39.75(c-19)的相关信号证实双键位于12位。一对双键碳信号出现在δc139.05(c)和128.20(ch),与化合物齐墩果酸的核磁数据进行比较发现，c-12和c-13化学位移右移，而c-27处为ch2信号，说明c-27被羟基取代。酸水解和手性gc-ms分析证实含有d-吡喃葡萄糖和鼠李糖。c-3和c-28处的化学位移分别出现在δc88.90和176.76,这说明化合物是一个双糖链三萜皂苷。这一点也被δh4.85(h-1')和δc88.90(c-3),δh6.02(h-1”')和δc176.76(c-28)的hmbc相关信号证实。δh5.32(h-1”)和δc80.21(c-2')的hmbc相关信号说明glcii连接在glci的c-2′位。因此，化合物被鉴定为27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷。

实施例二

取1000g粉碎的油茶蒲，按料液比1:20(g/ml)的比例加入体积百分浓度90％的乙醇水溶液，超声波提取3次，每次30分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。

在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用正丙醇进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

萃取后的浸膏用含有15％的乙醇进行溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，用20—100％的乙醇梯度洗脱，洗脱液经tlc检测60％乙醇段馏分显色有紫色斑点，收集60％乙醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至原料的0.07倍。

向特征馏分浓缩液中加入质量为特征馏分浓缩液4倍的浓度为80％的乙醇，放置在4℃冰箱中静置12h，离心过滤后，加入8倍量的氯仿和甲醇按1:4混合的有机溶剂热溶解，并加入活性炭吸附除杂，过滤，反复结晶，得白色粉末状物质0.748g，经质谱与核磁共振谱鉴定为27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷。

实施例三

取2000g粉碎的油茶蒲，按料液比1:30(g/ml)的比例加入体积百分浓度95％的乙醇水溶液，超声波提取4次，每次10分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。

在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用正丁醇进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

萃取后的浸膏用含有5％的乙醇进行溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，用20—100％的乙醇梯度洗脱，洗脱液经tlc检测60％乙醇段馏分显色有紫色斑点，收集60％乙醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至原料的0.06倍。

向特征馏分浓缩液中加入质量为特征馏分浓缩液3倍的浓度为95％的乙醇，放置在3℃冰箱静置50min，离心过滤后，加入10倍量的氯仿和甲醇按1:3混合的有机溶剂热溶解，并加入活性炭吸附除杂，过滤，反复结晶，得白色粉末状物质2.069g，经质谱与核磁共振谱鉴定为27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷。

实施例四

取1000g粉碎的油茶蒲，按料液比1:20(g/ml)的比例加入体积百分浓度85％的乙醇水溶液，超声波提取3次，每次30分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。

在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用有正丙醇进行萃取，萃取次数4次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

萃取后的浸膏用含有1％的甲醇进行溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，用20—100％的甲醇梯度洗脱，洗脱液经tlc检测70％乙醇段馏分显色有紫色斑点，收集70％甲醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至原料的0.1倍。

向特征馏分浓缩液中加入质量为特征馏分浓缩液2倍的浓度为80％的乙醇，放置在5℃冰箱中静置12h，离心过滤后，加入9倍量的正丁醇、石油醚和丙酮按1:1:1混合的有机溶剂热溶解，并加入活性氧化镁吸附除杂，过滤，反复结晶，得白色粉末状物质0.723g，经质谱与核磁共振谱鉴定为28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[β-d-葡萄糖基(1”→6')]-β-d-葡萄糖苷。

实施例五

取2000g粉碎的油茶蒲，按料液比1:1(g/ml)的比例加入体积百分浓度99％的乙醇水溶液，超声波提取5次，每次50分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。

在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用正丁醇进行萃取，萃取次数5次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

萃取后的浸膏用含有20％的甲醇进行溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，用20—100％的乙醇或者甲醇梯度洗脱，洗脱液经tlc检测75％乙醇段馏分显色有紫色斑点，收集75％甲醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至原料的0.08倍。

向特征馏分浓缩液中加入质量为特征馏分浓缩液1倍的浓度为95％的乙醇，放置在4℃冰箱静置12h，离心过滤后，加入7倍量乙醇和乙酸乙酯按2:1混合的有机溶剂热溶解，并加入活性硅藻土吸附除杂，过滤，反复结晶，得白色粉末状物质1.989g，经质谱与核磁共振谱鉴定为27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷。

实施例六

取500g粉碎的油茶蒲，按料液比1:5(g/ml)的比例加入体积百分浓度50％的乙醇水溶液，超声波提取5次，每次50分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。

在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用正丁醇进行萃取，萃取次数4次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

萃取后的浸膏用含有5％的乙醇进行溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，用20—100％的甲醇梯度洗脱，洗脱液经tlc检测65％乙醇段馏分显色有紫色斑点，收集65％甲醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至原料的0.09倍。

向特征馏分浓缩液中加入质量为浓缩液3倍的浓度为98％的乙醇，放置在4℃的冰箱中静置12h，离心过滤后，加入10倍量的氯仿、甲醇和乙醇按1:1:2混合的有机溶剂热溶解，并加入活性硅藻土吸附除杂，过滤，反复结晶，得白色粉末状物质0.324g。经质谱与核磁共振谱鉴定为27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷。

如下提供本发明制备的齐墩果烷型三萜皂苷用途实验。

1.待评价样品：上述制备的27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷的抗肿瘤活性评价。

2.试验方法：

(1)ht-29与hek293细胞购买于美国典型培养物保藏中心(atcc)。将ht-29细胞置于含10％胎牛血清的dmem培养基中，于37℃、5％co2培养箱静置培养，每三天传代一次。细胞复苏后，传至4代后方可用于建模。

(2)mtt实验分析单体化合物对结肠癌细胞增殖的影响：取对数生长期且细胞形态生长良好的ht-29细胞，弃去旧培养基，胰蛋白酶消化轻轻吹打后，采用台盼蓝法在显微镜下细胞计数，按照每孔1×106的浓度接种于96孔板中，每孔加入100μl，于37℃、5％co2培养箱中培养24h，弃去旧培养液，初始加入100μldmem培养液，然后加不同浓度的样品溶液，空白对照组则加含0.1％dmso的完全培养基，处理48h，吸出孔内培养液，加入100μlmtt溶液培养4小时后，加入mtt终止液继续培养16-20个小时，酶标仪下测其吸光度。按照以下计算细胞存活率：细胞存活率＝(空白组od值-样品组od值)/空白组od值×100％。

3.实验结果：

本实验采用mtt比色法检测27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷对ht-29细胞增值活性的效应。由图5所示，随着给药浓度的增加，与空白对照组相比，ht-29细胞细胞存活率显著下降，且呈一定的浓度依赖关系。而对正常hek293细胞影响不显著，当给药浓度为25μg/ml时最强，其细胞存活率为28.66％。实验结果充分说明27-羟基-28-o-β-d-葡萄糖基-齐墩果烯-3-o-[a-l-鼠李糖基(1”→2')]-β-d-葡萄糖苷具有显著的抗肿瘤作用，可广泛应用在抗肿瘤药品、食品和保健品等产品中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。