一种鉴别升麻混伪品的LAMP检测引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于dna分子检测技术领域，具体地说，涉及一种中药材混伪品假升麻的lamp检测引物组合及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法。

背景技术：

中药材升麻是毛茛科升麻属大三叶升麻(c.heracleifolia)、兴安升麻(c.dahurica)、或升麻(c.foetida)的干燥根茎。升麻基原植物主要分布于辽宁、吉林、黑龙江等地，在“升麻柴胡汤”、“升麻鳖甲汤”等中药复方中均作为主要原料之一，始载于《神农本草经》，《本草纲目》、《滇南本草》等均有记载，具有清热解毒、发表透疹、升举阳气之功效。现代药理学证明升麻的提取物对治疗更年期综合症和骨质疏松等综合症有明显的疗效。由于升麻具有重要的药用价值和显著疗效，从最开始作为民间用药，到近代已作为各大药厂的主要原料。近年来，由于升麻药材的大量需求，导致其资源短缺，药材价格逐渐攀升，掺伪现象时有发生。在众多混伪品中，来源于同科植物假升麻属的假升麻，在市场上销售量多，升麻与假升麻在药材性状上极为相似，仅从性状方面较难区分，给科学研究企业生产和临床用药等均带来了较大的麻烦，这必然会影响消费者的用药安全及疗效。

传统的升麻及其混伪品的鉴定主要是基于形态学特征、显微结构、化学成分等。传统方法在升麻药材检测中发挥了重要作用，但是费事费力而且要求操作者具备专业的植物形态鉴定知识和化合物解析技能和多年的丰富经验。随着dna分子鉴定技术方法的发展，基于pcr技术的dna条形码鉴定方法为药用植物的分类鉴定提供了灵敏、准确的优势，虽然pcr方法在敏感性和特异性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，同时该技术依赖精密和昂贵的扩增仪和测序仪，不仅检测成本高，而且不能满足现场快速检测的需求。lamp是一种崭新的dna扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，存在替代pcr方法的可能性。lamp技术是针对靶基因的6个或8个区域设计4种或者6种不同的特异性引物，在bst聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，dna在65℃左右处于动态平衡状态，在不断的置换过程中合成目标dna产物。由于lamp扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通的恒温设备就能够满足反应条件，检测成本大大降低。目前，lamp技术已经成功应用于临床诊断、食品检疫及微生物检测等研究，但在中药材混伪品的检测报道很少。

技术实现要素：

针对现有技术中升麻药材鉴定方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低、无法应用于现场检测等问题，本发明的目的是提供一种升麻混伪品药材假升麻的lamp检测引物组合物，并提供其lamp检测试剂盒和检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种鉴别升麻混伪品的lamp检测引物组，包括3组特异性引物，分别为正向内引物fip和正向外引物fip；反向内引物f3和反向外引物b3；正向环引物lf和反向环引物lb，其分别具有如seqidno.1至seqidno.6所示的序列。

一种鉴别升麻混伪品的lamp检测试剂盒，包括以下成分：

(1)检测反应液：含有1.6mm正向内引物fip、1.6mm反向内引物bip、0.2mm正向外引物f3、0.2mm反向外引物b3、8mm环引物lf、0.8mm环引物lb、10mmdntps、0.8mtris-hcl、0.4mm(nh4)2so4、0.24mmmgso4、4％tritonx-100、bstdnapolymerase10u/μl，1ulcalcein钙黄绿素荧光染料；

(2)对照：阳性对照为假升麻基原植物的dna，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

作为优选，所述的正向内引物fip和正向外引物fip；反向内引物f3和反向外引物b3；正向环引物lf和反向环引物lb，其分别具有如seqidno.1至seqidno.6所示的序列。

本发明还提供了所述的鉴别升麻混伪品的lamp检测引物组、所述的鉴别升麻混伪品的lamp检测试剂盒在检测升麻药材中的假升麻混伪品的应用。

一种检测假升麻混伪品的方法，包括提取待检测药材的dna，以提取的dna为模板，利用lamp引物组合物或者lamp试剂盒进行反应；观察lamp反应液颜色变化，绿色表示检测为阳性，存在假升麻混伪品；褐色表示检测结果为阴性，不存在假升麻混伪品。

作为优选，所述的提取待检药材的dna的具体操作为，取1μldna溶液，加入24μllamp试剂盒中的检测溶液进行lamp反应，lamp反应程序为：65℃恒温孵育60min，然和80℃灭活10min，然后观察扩增产物的颜色变化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明基于环介导等温扩增技术lamp法，根据靶基因设计的6条引物能够特异性识别靶基因序列上的8个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标dna启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环dna混合物。采用6条特异性引物及一种具有链置换活性的dna聚合酶，在65℃左右恒温条件下进行扩增反应，反应时间可以依据dna质量和浓度变化，一般为50-90min，反应结束后在80℃保温10min，终止反应。在反应中，有核酸大量合成时，从dntps析出的焦磷酸根离子与反应液中mg⁺结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。

(2)与现有技术相比，本发明具有快速高效、操作简单、高灵敏度、适合现场检测等优势：

(a)快速高效：整个扩增只用50-90min即可完成反应，扩增产量高达10⁹个拷贝；

(b)操作简单：不需要专业人员和复杂的仪器，整个反应和检测都在恒温条件下完成；

(c)高灵敏性：最低检测极限可达到100个拷贝；

(d)现场检测：利用本发明的dna快速提取方法和lamp试剂，反应后加入calcein钙绿黄素染料即可通过观察颜色变化来确定是否含有混伪品药材，适合应用于各种药市现场检测。

附图说明

图1为本发明所建立鉴别中药材混伪品假升麻的lamp敏感性实验结果电泳图；

其中：m为dnamarker；1-正品升麻药材；2-阴性对照；3-8为混伪品假升麻药材；9-假升麻基原植物dna。

图2为本发明所建立鉴别中药材混伪品假升麻的lamp敏感性实验结果实时浊度图；

其中：1-6为含有混伪品药材假升麻样品；7-假升麻基原植物dna阳性对照；8-升麻药材；9-阴性对照。

图3为含有混伪品的药材样品的扩增曲线测定；

图4为本发明的lamp检测方法的灵敏度测定曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：lamp检测引物组、试剂盒的建立

一种升麻药材混伪品假升麻的lamp检测试剂盒，包括引物液、反应液、dna聚合物、对照和显色剂：

(1)引物液：含有1.6mm正向内引物fip、1.6mm反向内引物bip、0.2mm正向外引物f3、0.2mm反向外引物b3、8mm环引物lf、0.8mm环引物lb，6条引物分别为：

fip：5′-gcggagcgcacgggaggccaccttcggaggaggccgt-3′；

bip：5′-cgccgagtccccggcgactggcgacggggggtct-3′；

f3：5′-gttgcgccccccgcacgc-3′；

b3：5′-taggcgctggagctgc-3′；

lf：5′-tcttccgcgtcccggc-3′；

lb：5′-gccacgacgatcggtggttg-3′。

(2)反应液：含有10mmdntps、0.8mtris-hcl、0.4mm(nh4)2so4、0.24mmmgso4、4％tritonx-100、bstdnapolymerase10u/μl；

(3)calcein钙黄绿素荧光染料；

(4)阳性对照：含有假升麻基原植物的dna，阴性对照为不含有假升麻的dna的反应体系。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

(1)待检测样品dna的提取：采用本发明的改良ctab法提取待测样品dna；

(2)恒温反应：在200ulpcr管中配制反应体系：引物液2.0ul，反应液15ul，bst聚合酶1ul，dna1ul，用ddh2o补足至25ul；设置阳性对照时，用假升麻基原植物的dna，设置阴性对照反应时，用不含假升麻dna的反应液代替待检dna；将混合液混匀后稍离心，在65℃反应60min，并在80℃保温10min结束反应；

(3)检测结果判断：在反应液中加入2ulcalcein显色液，混匀后观察颜色变化，若显绿色则为阳性，褐色则为阴性。

如图1所示，反应液的琼脂糖电泳检测结果显示，只有含有混伪品的药材和阳性对照假升麻dna获得了扩增，形成了强烈的弥散状条带，而升麻药材没有出现任何扩增。

如图2所示，当反应液加入calcein显色液后，只有混伪品药材和阳性对照呈现绿色，而升麻药材和阴性对照呈现棕色。

实施例2：含有混伪品的药材样品的检测

(1)随机抽取药市药摊上的升麻药材，取根部表皮10mg放入2ml离心管中，用研磨棒磨成粉末状后，加入700ulctab提取缓冲液(0.2％ctab，0.1mtris，0.2medta，1.4mnacl，1g/lpvp40)，并混合均匀，放置55℃水浴15min，12000rpm离心10min后取上清液用于lamp检测。

(2)lamp恒温检测反应：在200ulpcr管中配制反应体系：引物组混合液2.0ul，反应液15ul，bst聚合酶1ul，dna1ul，用ddh2o补足至25ul；设置阳性对照时，用假升麻基原植物的dna，设置阴性对照反应时，用不含假升麻dna的反应液代替待检dna；将混合液混匀后稍离心，在65℃反应90min，并在80℃保温10min结束反应。

(3)结果判断：将pcr管放进浊度仪中按步骤(2)反应，观察反应的浊度变化，若呈现类似于“s”型扩增曲线则为阳性，若没有显现“s”型扩增曲线即为阴性。

如图3所示，含有混伪品的药材样品和阳性对照都产生“s”型扩增曲线，而正品升麻和阴性对照没有出现“s”型扩增曲线。

实施例3：lamp检测方法的灵敏度测定

为了确定lamp检测方法的灵敏度，将提取的假升麻dna用分光光度计测定浓度后用ddh2o进行-10倍的梯度稀释。分别取各梯度稀释后的dna1ul作为模板，加入lamp反应液(10mmdntps、0.8mtris-hcl、0.4mm(nh4)2so4、0.24mmmgso4、4％tritonx-100、bstdnapolymerase10u/μl),引物组混合液2ul，用ddh2o补足至25ul。在浊度仪上反应：60℃60min，80℃10min。

如图4所示，结果显示本发明的lamp灵敏度达到10fg的假升麻dna。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所

<120>一种鉴别升麻混伪品的lamp检测引物组、试剂盒及其应用

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