本发明涉及一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法，属于生物医药的分离纯化。
背景技术：
1884年，人们在医用水蛭(hirudomeduimalis)中发现有很强的抗凝物质，命名为水蛭素(hirudinhir)。到1950年以后，从医用水蛭唾液腺中分离得到具有生物活性的水蛭素。七十年代初确定，水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂。八十年代，确定了水蛭素的氨基酸序列，并对其构数关系及其生物学作用机理进行了一系列研究，水蛭素是一个由多种异构体所组成的家族，常见有三种分别为hv-1、hv-2和hv-3，异构体间有高度的同源性，都是由65个氨基酸所组成的单链多肽，分子量约为7000da，氨基酸组成分析表明，水蛭素分子中不含精氨酸和色氨酸，而富含谷氨酸、天门冬氨酸以及谷氨酰胺和天门冬酰胺，比活性约为10000iu/mg蛋白。
由于水蛭素具有重要的医药价值，而天然水蛭素来源限制，故国内外医药界均着重研究通过基因工程获得重组水蛭素。基于已知的水蛭素氨基酸序列，在体外合成相应序列dna片段，插入重组表达载体，在大肠杆菌和酵母细胞中表达。毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统是具有分泌优势的高表达真核系统。其分泌表达量高，酵母工程菌稳定性好，高密度发酵条件下，能大大提高产物的表达水平等。
重组水蛭素的成功构建表达后，需要对重组水蛭素进行分离纯化工作，优化的分离纯化方法可以使水蛭素纯度提高，成本降低。传统的分离重组水蛭素以去除色素分子多采用两步法：1、超滤膜浓缩水蛭素；2、低温乙醇沉淀浓缩后的水蛭素，分离色素分子。现有的分离技术具有以下难点:1、两步法超滤浓缩--乙醇沉淀后水蛭素活性蛋白回收率在40％左右，蛋白回收率较低；2、因发酵过程中会产生蛋白降解酶，而该降解酶会水解水蛭素活性，因此超滤浓缩时间过长，不利于水蛭素活性的稳定；且超滤膜的消耗较大，浓缩成本高；3、两步法乙醇使用量大，不利于环保。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前现有分离技术出现的问题，提供一种快速分离水蛭素发酵液中色素分子的方法，使用疏水作用色谱分离提纯，提高水蛭素蛋白回收率。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法，所述方法包括在水蛭素发酵液中加入疏水色谱填料进行吸附，吸附沉淀洗脱后，即得分离色素分子的水蛭素蛋白。
疏水色谱填料由化学性质稳定、机械强度好的载体和疏水表面基团组成，因而疏水色谱填料的表面具有弱疏水特性。而水蛭素蛋白表面存在一些疏水区域，蛋白质分子中的疏水区域可以与填料表面产生疏水性相互作用而被吸附，而发酵液中色素分子的疏水性要远远小于水蛭素蛋白，其与疏水色谱填料吸附性不强，当水蛭素发酵液经疏水色谱填料吸附洗脱时，根据疏水性差异，疏水性低的色素分子先被洗脱出来，水蛭素蛋白随后被洗脱出来，从而实现色素分子与水蛭素蛋白的分离。且水蛭素蛋白与疏水色谱填料的疏水作用是一种很温和的相互作用，在洗脱后能保持蛋白分子的结构和活性。
作为优选，所述疏水色谱填料由硅胶基质以及表面键合苯甲基基团形成。硅胶表面键合苯甲基基团，苯甲基基团的疏水性要大于普通的羟丙基、甲基、丙基等键合基团，表面键合基团疏水性越大，水蛭素蛋白与之疏水作用越强，吸附洗脱的时间越长，从而更易与色素分子分离，但是硅胶表面键合基团的疏水性太强，会导致蛋白质分子不可逆吸附和生物活性损失，因此本发明选择苯甲基基团作为硅胶表面键合基团。
作为优选，所述疏水色谱填料颗粒度为15-25μm，孔径为
作为优选，所述疏水色谱填料在使用前经过预处理，所述预处理包括以下步骤：在疏水色谱填料中加入乙醇，超声振荡后，抽滤除去乙醇，抽滤沉淀物依次经蒸馏水、ph为4.8-5.2的40-80mmol/l磷酸缓冲液(pb)淋洗，直至流出液ph为4.8-5.2，抽干，在2-8℃保存备用，在临用前用2-3倍疏水色谱填料体积的平衡液淋洗。疏水色谱填料只有经过预处理，才能有效吸附蛋白质。
作为优选，所述吸附过程包括：按10-15mg水蛭素蛋白/g疏水色谱填料的量取疏水色谱填料，置于经预处理后的水蛭素发酵液中，搅拌静置，待疏水色谱填料完全沉降，取沉淀待用。
在水蛭素发酵液中加入疏水色谱填料，充分搅拌后，静置10-20分钟，取上清液测水蛭素蛋白活性，若有活性，继续补充疏水色谱填料，直至无活性检出。我们的实验表明，疏水色谱填料的量按15mg水蛭素蛋白/g干重疏水色谱填料量取，在静置10-20分钟后，上清液基本无活性，表明蛋白吸附完全。当然也可以量取更多量的疏水色谱填料，使蛋白的吸附更加完全和稳固。该吸附过程获得沉淀的方法非常简单，只需吸附液静置1-2h，待疏水色谱填料完全沉降，利用虹吸法去除上清液，就可获得吸附沉淀。
作为优选，所述水蛭素发酵液的预处理包括加入2-5mol/l氯化钠，并且调ph值为4.8-5.2。水蛭素发酵液经过一定浓度氯化钠处理，可以增加发酵液中蛋白质的疏水性，使蛋白质完全被吸附在填料表面。
作为优选，所述洗脱过程包括：将吸附沉淀先用大于5倍沉淀体积的平衡液淋洗，然后用缓冲液1洗至无色素流出，再用2-3倍沉淀体积的缓冲液2洗脱，收集洗脱液，即为分离色素分子的水蛭素蛋白。
所述平衡液的离子强度＞缓冲液1＞缓冲液2。
进一步优选，所述平衡液的配方为：2-5mol/l氯化钠，40-80mmol/l磷酸缓冲液，ph4.8-5.2。所述缓冲液1的配方为：1-4mol/l氯化钠，40-80mmol/l磷酸缓冲液，ph为4.8-5.2；所述缓冲液2为ph4.8-5.2的40-80mmol/l磷酸缓冲液。
水蛭素蛋白与疏水色谱填料在高离子强度的平衡液淋洗下，疏水作用得到加强，然后逐渐降低缓冲液的离子强度，与疏水色谱填料疏水性弱的色素分子先被洗脱出来，此时的洗脱液不收集，洗至无色素流出，换更低离子强度的缓冲液2继续洗脱，水蛭素蛋白逐渐被洗脱出来，收集洗脱液，该洗脱液即为水蛭素蛋白活性部分。
作为优选，所述方法还包括疏水色谱填料再生，再生步骤包括：经洗脱后的沉淀，依次用乙醇、蒸馏水和平衡液淋洗，所述平衡液的配方为：2-5mol/l氯化钠，40-80mmol/l磷酸缓冲液，ph4.8-5.2。抽干即得再生疏水色谱填料。经过再生处理，实现疏水色谱填料的循环利用。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
1、整个吸附洗脱过程操作简单。且水蛭素发酵液中的培养基成分、蛋白降解酶、有机溶剂、菌体残留部分等不会被疏水色谱填料吸附，留在上清液中直接被分离出去，本方法具有一定的纯化作用。
2、吸附发酵液不受体积的限制，相同的分泌量表达，如体积增大只需增加疏水色谱填料的重量即可，适合大规模发酵液分离使用，且分离时间短，都可在5小时左右完成分离操作。
3、疏水色谱填料可反复使用几百次不需更换，高于超滤浓缩过程中膜的使用寿命。
4、水蛭素蛋白回收率可达70％以上，高于传统两步法超滤浓缩-乙醇沉淀蛋白回收率。
附图说明
图1为实施例3水蛭素发酵液分离色素前后对比照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例以及附图对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
实施例1
100l罐高密度发酵，离心得水蛭素发酵液体积35l，分泌水蛭素表达量:1.2mg/ml，蛋白活性:16800iu/ml。
对疏水色谱填料进行预处理：取疏水色谱填料3000g，疏水色谱填料颗粒度20μm，孔径
取2800g预处理过的疏水色谱填料(干重)，置离心过的水蛭素发酵液中(发酵液在临吸附前加入4mol/l氯化钠，ph调至4.8)，磁力搅拌20min后，静置1小时，疏水色谱填料完全沉降，虹吸去除上清液，沉淀待用。
将吸附沉淀置布氏漏斗中抽滤，先用15l平衡液淋洗，再用30l缓冲液1洗脱，收集尾液在280nm波长处检测无色素信号，表示色素洗脱完全，最后用7l缓冲液2洗脱，收集洗脱液，即为水蛭素蛋白。
将上述洗脱过后的吸附沉淀依次用15l80％乙醇、28lph为4.8的蒸馏水以及6l平衡液淋洗，抽干，得到的疏水色谱填料即可再一次使用。
本实施例所用的平衡液配方为：4mol/l氯化钠，40mmol/lpb，ph为4.8。所述缓冲液1的配方为：2mol/l氯化钠，40mmol/l磷酸缓冲液，ph为4.8；所述缓冲液2为ph4.8的40mmol/l磷酸缓冲液。
收集的水蛭素蛋白浓度为4.20mg/ml，活性：5.82万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为70％。
实施例2
100l罐高密度发酵，离心得水蛭素发酵液体积38l，分泌水蛭素表达量：1.15mg/ml，活性：16100iu/ml。
对疏水色谱填料进行预处理：取疏水色谱填料3100g，疏水色谱填料颗粒度20μm，孔径
取3000g预处理过的疏水色谱填料(干重)，置离心过的水蛭素发酵液中(发酵液在临吸附前加入3mol/l氯化钠，ph调至5.2)，磁力搅拌20min后，静置1.5小时，疏水色谱填料完全沉降，虹吸去除上清液，沉淀待用。
将吸附沉淀置布氏漏斗中抽滤，先用16l平衡液淋洗，再用31l缓冲液1洗脱，收集尾液在280nm波长处检测无色素信号，表示色素洗脱完全，最后用7l缓冲液2洗脱，收集洗脱液，即为水蛭素蛋白。
将上述洗脱过后的吸附沉淀依次用15l85％乙醇、28lph为5.2的蒸馏水以及6l平衡液淋洗，抽干，得到的疏水色谱填料即可再一次使用。
本实施例所用的平衡液配方为：3mol/l氯化钠，60mmol/lpb，ph为5.2。所述缓冲液1的配方为：1.5mol/l氯化钠，60mmol/l磷酸缓冲液，ph为5.2；所述缓冲液2为ph5.2的60mmol/l磷酸缓冲液。
收集的水蛭素蛋白浓度为4.43mg/ml，活性：6.20万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为71％。
实施例3
100l罐高密度发酵，离心得水蛭素发酵液体积40l，分泌水蛭素表达量:1.08mg/ml，蛋白活性:15800iu/ml。
对疏水色谱填料进行预处理：取疏水色谱填料3200g，疏水色谱填料颗粒度20μm，孔径
取3100g预处理过的疏水色谱填料(干重)，置离心过的水蛭素发酵液中(发酵液在临吸附前加入2mol/l氯化钠，ph调至5.0)，磁力搅拌20min后，静置2小时，疏水色谱填料完全沉降，虹吸去除上清液，沉淀待用。
将吸附沉淀置布氏漏斗中抽滤，先用16l平衡液淋洗，再用31l缓冲液1洗脱，收集尾液在280nm波长处检测无色素信号，表示色素洗脱完全，最后用7l缓冲液2洗脱，收集洗脱液，即为水蛭素蛋白。
将上述洗脱过后的吸附沉淀依次用15l85％乙醇、28lph为5.0的蒸馏水以及6l平衡液淋洗，抽干，得到的疏水色谱填料即可再一次使用。
本实施例所用的平衡液配方为：2mol/l氯化钠，50mmol/lpb，ph为5.0。所述缓冲液1的配方为：1mol/l氯化钠，50mmol/l磷酸缓冲液，ph为5.0；所述缓冲液2为ph5.0的50mmol/l磷酸缓冲液。
收集的水蛭素蛋白浓度为4.51mg/ml，活性：6.58万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为73％。
对比例1
对比例1与实施例3的区别为疏水色谱填料由硅胶基质以及表面键合c18烷基形成，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白浓度为3.15mg/ml，活性：4.59万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为51％。
对比例2
对比例2与实施例3的区别为疏水色谱填料由硅胶基质以及表面键合c8烷基形成，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白浓度3.27为mg/ml，活性：4.77万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为53％。
对比例3
对比例3与实施例3的区别为疏水色谱填料没有进行预处理，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白浓度1.85为mg/ml，活性：2.69万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为30％。
对比例4
对比例4与实施例3的区别为水蛭素发酵液在临吸附前没有进行预处理，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白浓度为2.90mg/ml，活性：4.23万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为47％。
对比例5
对比例5与实施例3的区别为，在洗脱过程中，所用平衡液配方为：7mol/l氯化钠，100mmol/lpb，ph为5.5；所用缓冲液1的配方为：6mol/l氯化钠，100mmol/l磷酸缓冲液，ph为5.5；所用缓冲液2为ph5.5的100mmol/l磷酸缓冲液。
收集的水蛭素蛋白浓度3.09为mg/ml，活性：4.50万iu/ml，水蛭素蛋白回收率为50％。
另外，本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。