玫瑰RrNUDX1基因在增强植物花香中的应用的制作方法

本发明公开了玫瑰基因rrnudx1在增强植物花香中的应用，属于植物生物技术领域。

背景技术：

玫瑰(rosarugosathunb.)是世界上重要的天然香料植物，也是我国传统的药食同源花卉，单萜类化合物中的香茅醇、香叶醇、橙花醇及其乙酸酯类衍生物是形成玫瑰特征香气的主要成分。

单萜作为萜类化合物主要种类，大多分布在植物的腺体油室等分泌组织中，通常具有较强的香气和生物活性，单萜对于植物生存和人类生活具有重要作用，除了它们在植物防御中的功能外，单萜还用作香料和药物，同时许多名贵植物精油的主要成分均由单萜类化合物组成，如薄荷精油主要由柠檬醛和香芹酮组成。近年来，研究人员通过分离单萜生物合成途径中的关键酶基因，借助基因工程手段，选择性地调控单萜代谢途径，从而提高萜类合成前体和下游单萜类化合物的产量，达到改良植物香气以及精油品质的目的。

nudx1属于nudix水解酶基因家族，在细菌、病毒、真核生物中均有发现，研究表明，nudx1基因是nudx家族中唯一一个马特型酶，其蛋白以8-oxo-(d)gtp(8-氧化脱氧鸟苷三磷酸酶)、dntp、nadh、dihydroneopterin(二氢新蝶呤)为底物，能够有效清除细胞中因ros氧化所受损的核苷酸，减少细胞内氧化损伤的累积，降低细胞突变和程序性死亡，增强对不良环境的适应力。玫瑰rrnudx1基因的cdna全长序列全长777bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框453bp，终止密码子、5'非编码区68bp，3′非编码区244bp与poly(a)尾巴12bp，共编码151个氨基酸。基因登陆号为kx096710.1。但是，rrnudx1基因的应用尚未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供玫瑰rrnudx1基因的应用。

本发明公开了玫瑰rrnudx1基因在增强植物花香中的应用。

本发明还公开了rrnudx1基因在培育香气浓郁的花卉新品种中的用途。

一种增强香气的转基因花卉新品种的培育方法，是构建rrnudx1基因的过表达载体，采用农杆菌介导法将过表达载体导入待转化花卉，获得转基因花卉新品种。

本发明通过构建rrnudx1基因的过表达载体，采用农杆菌介导法将pcambia1304-rrnudx过表达载体导入矮牵牛，待植株开花后，采用gc-ms技术检测盛开期矮牵牛花朵芳香成分，结果发现，与野生型相比，转rrnudx1基因植株花中苯甲酸甲酯等主要香气成分的含量明显提高，且感官上能闻到浓郁的香气，说明过表达rrnudx1基因具有增强植物花香的功能。

本发明利用现代分子生物学手段，挖掘出调控植物花香形成的关键基因，并培育出香气浓郁的花卉新品种，不仅可以提高切花和盆栽植物的商品价值，还可以提高花卉产品的质量及其经济价值，甚至可以提高植物精油的含量，改良精油的品质，具有重要的经济价值和巨大的潜在应用价值。

附图说明

图1矮牵牛植株转化过程；a:叶片预处理，b:侵染，c:生根，d:壮苗，e:移植。

图2pcr产物凝胶检测，m：markerdl2000n：rrnudx1的pcr产物。

图3重组质粒pcambia1304-rrnudx1的单酶切电泳图，

m1：markerdl15000m2:markerdl2000a1-a2:重组质粒单酶切n:阴性对照。

图4rrnudx1-1和rrnudx1-2序列比较，

rrnudx1-1：克隆的目的基因rrnudx1-2：重组质粒。

图5pcambia1304-rrnudx1农杆菌转化子菌液pcr电泳图

m：markerdl2000p1-p3：pcambia1304为模板n1：ddh2o为模板n2：农杆菌eha菌液为模板n3：yeb液体培养基为模板a1-a7：pcambia1304-rrnudx1农杆菌转化子菌液为模板。

图6矮牵牛愈伤gus染色结果

a:wt；b-d:转rrnudx1基因愈伤。

图7转基因矮牵牛植株dna验证

m:markerdl2000；a1-a6:过表达抗性植株；p:pcambia1304-rrnudx1质粒；wt1-2:野生型。

图8野生型与转基因矮牵牛植株的表型观察

a:野生型与转rrnudx1基因植株的生长状态；b:野生型植株开花状态；c:转rrnudx1基因植株的开花状态。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

生物材料：pcambia1304表达载体(biovector公司，北京)、eha105农杆菌(华越洋生物科技有限公司，北京)

实施例：

1玫瑰rrnudx1基因转化矮牵牛与功能验证

1.1载体质粒与菌株

pcambia1304表达载体和eha105农杆菌均为本实验室保存。

1.2主要试剂的配制

(1)yeb液体培养基：0.05gmgso4·7h2o、1g酵母提取物、5g蛋白胨、5g牛肉浸膏、5g蔗糖，用ddh2o溶解并定容至1000ml，调ph值至7.0，灭菌后4℃保存。yeb固体培养基：在yeb液体培养基的基础上加20g/l琼脂，灭菌后分装保存。

(2)kan：母液50mg/ml。0.5gkan，溶于10ml灭菌ddh2o中，0.22μm滤膜过滤，用1.5ml离心管分装，-20℃保存。

(3)rif：母液5mg/ml。0.05grif，溶于少量无水乙醇后用灭菌ddh2o定容到10ml，0.22μm滤膜过滤，用1.5ml离心管分装，-20℃保存。

(4)6-ba：母液0.1mg/ml。10mg6-ba，用少量0.1moi/l的naoh溶液溶解，最后用灭菌ddh2o定容至100ml，-20℃避光保存。

(5)iaa：母液0.1mg/ml。10mgiaa，用少量1mol/l的naoh溶液溶解，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤，-20℃避光保存。

(6)as：母液50μmol/l。0.1962gas，溶于dmso定容至20ml，0.22μm滤膜过滤，-20℃避光保存。

(7)mes：母液10mg/ml。0.1gmes，溶于10ml灭菌ddh2o中溶解，0.22μm滤膜过滤，用1.5ml离心管分装，4℃保存。

(8)cb：母液50mg/ml。0.5gcb，溶于10ml灭菌ddh2o中溶解，0.22μm滤膜过滤，用1.5ml离心管分装，-20℃保存。

1.3矮牵牛遗传转化基本培养基

ms1：蔗糖30g/l+ms基本成分，ph5.8

ms2(愈伤分化)：ms1+6-ba3.0mg/l+iaa0.2mg/l，ph5.8

ms3(生根)：蔗糖30g/l+1/2ms，ph5.8

ms4(侵染液)：ms+mes1mg/l+as20mol/l，ph5.8

ms5(共培养)：ms2+as20mol/l，ph5.8

1.4rrnudx1基因过表达载体构建

1.4.1目的基因的初步获取

1.4.4.1引物的合成与设计

根据rrnudx1基因(kx096710.1)cdna全长序列分别设计上下游引物(引物所跨区域包含完整的cds序列)，用于体外分离目的基因，引物信息如下：

表1扩增rrnudx1基因开放阅读框的引物

1.4.4.2目的基因的pcr扩增

(1)反应体系为：

(2)反应条件：

x：退火温度

(3)将pcr反应液在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.4.4.3pcr产物的回收与纯化

参照takara公司的takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0试剂盒进行。

1.4.4.4pcr产物的连接、转化、扩大培养

目的片段的连接、转化参照trans公司的peasy^tm-t5zerocloningkit试剂盒说明书进行。

1.4.4.5质粒dna的提取及检测

参照axygen公司的axyprep^tmplasmidminniprepkit50-prep试剂盒说明书提取，委托上海生工进行目的基因序列测序,将测序结果与已登录的rrnudx1基因序列进行同源比对。

1.4.4.6rrnudx1基因的克隆与序列分析

采用玫瑰品种‘唐红’花瓣提取的rna，反转录成cdna为模板，通过pcr扩增后产物电泳图如图2，可以看出，扩增片段介于500-750bp，与预期值相近。回收纯化扩增片段，插入peasy^tm-t5zerocloningvector，转入大肠杆菌在附加1‰km的lb平板上筛选阳性克隆。测序结果显示，所克隆的目的基因序列为540bp左右，含起始密码子、终止密码子，编码151个氨基酸，经比对与已克隆的rrnudx1基因相似性达100％，推测氨基酸序列相似性达100％。

1.4.2目的基因(含有酶切位点)的获取

1.4.2.1引物的设计与合成

根据in-fusion试剂盒说明书要求，结合目的基因及双元表达载体pcambia1304上的限制性酶切位点，设计用于过表达载体构建的pcr引物，引物名称及其寡核苷酸序列如下：

rrnudx1单酶切引物：

rrnudx1-f:5’-ggactcttgaccatggttatgggaaacgagacagttgtag-3’(ncoi)(seqidno.3)

rrnudx1-r:5’-gtcagatctaccatggtcatgttggaaaagggttaaatc-3’(ncoi)(seqidno.4)

1.4.2.2含有酶切位点目的基因的pcr扩增

以获取的含有rrnudx1基因编码区序列的克隆载体质粒为模板，采用高保真酶进行pcr扩增反应，将ncoi酶切位点引入rrnudx1基因编码区两端。

(1)反应体系为：

(2)反应条件：

(3)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物，切下含有目的片段的胶块并回收。

1.4.2.3双元表达载体pcambia1304酶切及产物回收

(1)连接rrnudx1基因的过表达载体pcambia1304酶切反应体系为：

(2)反应条件：37℃3h；

(3)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。

1.4.2.4目的片段与表达载体的连接

将获取的目的基因与获取的过表达载体以1:3混合连接。

(1)连接反应体系为：

(2)pcr反应条件：50℃15min

1.4.3连接转化

目的片段的连接、转化参照trans公司的peasy^tm-t5zerocloningkit试剂盒说明书进行。

1.5重组质粒的鉴定及检测

1.5.1酶切鉴定及检测

挑选lb固体培养皿上的单菌落，分别置于含3ml液体lb(含1‰kan)的灭菌10ml离心管中，37℃200rpm振荡过夜培养后，提取pcambia1304-rrnudx1重组质粒的dna。

对pcambia1304-rrnudx1进行单酶切鉴定，反应条件均为37℃3h，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。同时酶切pcambia1304作为阴性对照，电泳检测结果如图3所示。可以看出，阴性对照n显示一条长约12000bp的条带，单酶切a1-a2切出一条约为500bp的条带，与rrnudx1开放阅读框大小一致。因此，表明目的基因已初步插入表达载体pcambia1304中。

将经酶切验证后的阳性重组质粒送测序，测序结果用dnaman分析(图4)，与已克隆结果进行比对，发现相似性为100％，无碱基突变，推测氨基酸序列完全相同，证明目的基因rrnudx1已成功连入表达载体pcambia1304，过表达载体pcambia1304-rrnudx1构建成功。并将测序正确的重组质粒于-20℃保存。

1.5.2重组质粒导入农杆菌eha105及筛选鉴定

1.5.2.1农杆菌eha105感受态制备

试验方法参照本实验室的方法进行农杆菌eha105感受态制备

1.5.2.2液氮冻融法转化农杆菌

(1)在碎冰上将农杆菌eha105感受态细胞慢慢融化，加入5μl重组质粒并混匀，置于冰上30min，1min液氮速冻，37℃热激5min，冰浴2min；

(2)加入800μl左右的不含抗生素液体yeb，120-160rpm，28℃，4-5h，在含有40mg/l的rif和50mg/l的kan的固体yeb上涂布300μl，28℃暗培养2d左右。

1.5.2.3农杆菌转化子的筛选鉴定

(1)挑取yeb平板上的单菌落，接种于含有3ml(含有40mg/l的rif和50mg/l的kan)液体yeb的灭菌10ml离心管中，28℃200rpm暗培养；

(2)菌液pcr检测阳性转化子；

(3)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。

1.5.2.4农杆菌转化子保存

将经菌液pcr鉴定为阳性转化子的农杆菌菌液中加入25％灭菌甘油，混匀后用1.5ml灭菌离心管分装，-70℃保存。

1.5.2.5结果

将检测正确的重组质粒(pcambia1304-rrnudx1)采用液氮冻融法导入农杆菌eha105感受态，在附加有1‰km和1‰rif的yeb固体培养基上筛选阳性转化子，制成菌液后以其为模板进行菌液pcr验证，同时针对模板设置一组阳性对照(p)，三组阴性对照(n1、n2、n3)，以保证结果的准确性。产物经电泳检测显示(图5)，a1-a7均扩增出了长度为500bp左右的目的片段。

1.6矮牵牛遗传转化体系优化

1.6.1植物材料的获得

1.6.1.1无菌苗的获得

将矮牵牛种子置于75％的酒精中浸泡5min，无菌水冲洗3次，再用12.5％的次氯酸钠溶液中浸泡10min，无菌水冲洗3次，接种于1/2ms培养基上培养。

1.6.1.2组培苗移栽

当组培苗长到五叶一心时进行移栽，将瓶盖打开在常温中炼苗一周左右，然后移栽于人工温室气候箱，光/暗周期为16h/8h，光照强度为200umol.m^-2s^-1，温度为25℃/23℃，相对湿度为70％。

1.6.2矮牵牛遗传转化体系选择压和抑菌剂浓度的确定

1.6.2.1潮霉素选择压的确定

本试验构建的过表达载体pcambia1304-rrnudx1携带潮霉素(hyg)抗性基因，因此确定hgy为农杆菌介导的矮牵牛遗传转化的选择抗生素。在超净工作台上，选取生长旺盛的矮牵牛无菌苗，将叶片切为1cm²的叶盘，分别置于hyg浓度为1、3、5、6、7、9、10、15mg/l的培养基ms1上，每个梯度处理30块叶片组织，培养30天，每15天更换1次培养基，重复3次。

从表2可以看出，hyg的浓度越高，对外植体的分化影响越大，愈伤诱导和芽分化的临界值均为7mg/l，生根的临界浓度6mg/l，因此在选择培养时，分别使用相应浓度的hyg进行筛选，确保阳性率的提高。

表2不同hyg浓度对矮牵牛各时期分化的影响

1.6.2.2羧苄浓度的确定

本试验采用羧苄作为遗传转化的抑菌剂，在超净工作台上，选取生长旺盛的矮牵牛无菌苗，将叶片切为1cm²的叶盘，分别置于cb浓度为100、200、300、400、500、600、700mg/l的培养基ms1上，每个梯度处理30块叶片组织，培养30天，每15天更换1次培养基，重复3次。

从表3可以看出，羧苄对外植体的生长没有明显的抑制作用，浓度为500mg/l时，对愈伤和芽分化有小幅度影响，浓度为500mg/l时，对生根有小幅度影响，故三种选择培养基的抑菌剂浓度均选择500mg/l。

表3不同cb浓度对矮牵牛各时期分化的影响

1.6.2.3农杆菌侵染液的培养

(1)取出-70℃中含有目的基因的农杆菌菌株，在含有km和rif的yeb筛选培养基上划板，28℃暗培养2-3天；

(2)在yeb+kan+rif液体培养基中接种单菌落，培养od为0.8-1.3；

(3)菌液pcr验证，确定菌液中目的基因的正确性；

(4)经过鉴定的菌液，加入50ml不含抗生素液体yeb在28℃200rpm震荡1-2天；

(5)将二次活化的菌液在4℃5000rpm离心12-15min后，收集菌体，再用事先准备好的侵染液(ms4)重悬稀释菌液od为0.3-0.6备用。

1.7矮牵牛的遗传转化

1.7.1叶片的预处理

选取生长旺盛的矮牵牛叶片，在超净工作台上，切成1cm²的小方块，叶片腹面向下，置于ms固体培养基上暗培养2天。

1.7.2侵染

首先在共培养表面平铺无菌滤纸片；第二步将预先培养2天的材料放入已准备好的侵染液中侵染5-8min；第三步取出侵染后的叶片，用无菌滤纸吸干表面的菌液，置于共培养基(ms5)上培养3天。

1.7.3分化筛选培养

将共培养3天后的叶盘取出，用无菌滤纸吸干材料表面的菌液；转移至筛选培养基中诱导培养愈伤组织，置于植物组培室培养，每15d换一次培养基，直至长出再生苗。

1.7.4生根筛选培养

当筛选培养的愈伤组织分化出的再生苗长至2-3cm左右时，切下更换至生根筛选培养基中，没有分化出芽的愈伤组织需要切除褐化变黄的部分，转移到新的分化筛选培养基上，阳性植株2-3周即可生根(图1)。

1.8转基因矮牵牛的检测

采用gus染色法和pcr法检测抗性植株。

1.8.1矮牵牛愈伤组织gus染色

对潮霉素筛选下生长形态正常的矮牵牛愈伤组织进行gus染色，结果显示，野生型呈黄白色，无gus底物活性，转rrnudx1基因的愈伤中染出了不同程度的蓝色(图6)，表明筛选标记基因gus正常表达。

1.8.2转rrnudx1基因的矮牵牛植株dna验证

在获得的转rrnudx1基因的矮牵牛植株中随机挑选6个单株，提取叶片dna进行pcr扩增，结果显示6株中5株能扩增出单一的条带且大小为500bp左右，与转入的对照质粒产物大小相似，而野生型不能扩增出条带(图7)，由此可见rrnudx1基因已经整合到矮牵牛基因组中。

1.9矮牵牛转基因植株表型观察

将野生型和转rrnudx1基因的矮牵牛植株移栽于人工温室气候箱，相同培养条件下进行培养，观测记录转基因和野生型植株叶片的形态、开花时间、花朵大小、花色和花期等表型方面的变化，发现转基因植株长势变快。如图8

1.10矮牵牛花香成分分析

1.10.1hs-spme取样

试验在扬州大学测试中心进行。取样前先将固相微萃取头在气相色谱进样口老化20min，老化温度250℃。分别盛开期的矮牵牛花朵3朵，用剪刀轻轻剪碎，混匀后称取1g，迅速置于l0ml样品瓶中，并在样品瓶底部加入内标物3-壬酮，然后迅速用聚四氟乙稀丁基合成橡胶隔片密封，将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，于40℃(水浴)条件下吸附40min。

1.10.2gc-ms分析

吸附完成后将固相微萃取头抽回，插入气相色谱-质谱联用仪(tracedsq，美国thermo公司)，于250℃解析2min，启动仪器采集数据。色谱条件：ffap弹性石英毛细管色谱柱，长60m，内径0.32mm，液膜厚1.0μm；载气为he(99.99％)，不分流；程序升温，进样口250℃，柱温起始温度50℃保持1min，以5℃/min升温至120℃，再以8℃/min升温至200℃，最后以12℃/min升温至250℃，保持7min。质谱条件：gc-ms接口温度250℃，离子源温度200℃，电离方式ei，电子能量70ev，发射电流200μa；扫描质量范围29～600amu。

1.10.3花香成分的定性和定量分析

定性方法：未知化合物质谱图经计算机检索同时与nistlibrary和wileylibrary2个质谱库相匹配，并结合人工图谱解析及资料分析。仅报道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鉴定结果。

定量方法：选择3-壬酮为内标，其浓度为0.8μg/μl，加入体积为2μl。采用sim(选择离子检测)方式定量。计算公式如下：香气成分含量(μg/g)＝[该组分的峰面积/内标的峰面积×内标浓度(μg/μl)×内标体积]/样品重量(g)。

1.10.4结果

结果如表4和表5，从表4可以看出，矮牵牛叶片挥发性成分主要以酯类化合物为主，野生型和转基因植株主要挥发性物质为亚油酸甲酯、叔十六硫醇、棕榈酸甲酯、顺式-十八烷酸甲酯、亚麻酸甲酯等。转rrnudx1基因的矮牵牛中亚油酸甲酯的含量有所提高，其他成分的含量变化不明显，说明rrnudx1基因转化后对矮牵牛叶片挥发性成分影响甚微。

表4野生型和转基因矮牵牛叶片主要挥发性成分及含量比较(μg/μl)

从表5可以看出，矮牵牛花香主要成分为酯类和醇类化合物，含量最高的为苯甲酸甲酯。与野生型相比，转基因矮牵牛花中未发现新的挥发性物质，即过表达rrnudx1基因未改变矮牵牛md的花香组分。我们选择了10种主要香气成分进行统计分析(这10种香气成分之和占矮牵牛花中香气成分总量的80.10％)，发现转基因矮牵牛酯类花香成分中，除苯甲酸苄酯外含量均有所提高，苯甲酸甲酯含量增加最明显，在转基因植株rrnudx1-1花中，苯甲酸甲酯含量是野生型植株的1.69倍；醇类物质以苯甲醇、苯乙醇为主，转基因植株rrnudx1-1和rrnudx1-2中苯甲醇含量比野生型提高了25.58％、53.49％；另外，两种主要酚类物质含量也有所增加，转基因植株中异丁香酚的含量分别是野生型植株的3.2、4.3和4.9倍。

表5野生型与转rrnudx1基因矮牵牛花香成分及含量比较(μg/μl)

2、结论

综合上述结果，我们发现，与野生型相比，转rrnudx1基因矮牵牛植株花中苯甲酸甲酯等主要香气成分的含量明显提高，且感官上能闻到浓郁的香气，说明过表达rrnudx1基因具有增强矮牵牛花香的功能，这为我们接下来利用rrnudx1基因提高其它植物花香奠定了突破性基础。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>玫瑰rrnudx1基因在增强植物花香中的应用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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gtcagatctaccatggtcatgttggaaaagggttaaatc39