从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法与流程

发明领域

本发明涉及间充质干细胞获取方法，特别是涉及一种从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)是干细胞中的一类，是一群贴壁生长的成纤维细胞样细胞，具有多向分化能力，能够产生多种细胞因子和生长因子；具有造血支持、免疫调节和抗炎功能，在再生医学领域具有重大的科学和实用价值。

mscs一般被认为不是单一种类细胞，而是一种混杂细胞群体，故其表面的抗原表达也不具有专一性特点。mscs标志物包括sca-1、cd29、cd44和cd105等表面标志阳性。不包括cd31、cd34、cd45和mhc-1a。此外，还需进行分化能力鉴定，包括成骨和成脂能力鉴定。

当前对干细胞的研究多集中于骨髓来源的mscs，但由于获取大量小鼠骨髓细胞十分困难，培养过程中易受非mscs贴壁细胞的污染，且随着小鼠年龄增长其细胞数量和分化能力出现明显下降趋势。故寻找一种能高效获取小鼠间充质干细胞的方法迫在眉睫。

目前已发现小鼠致密骨中存在mscs，致密骨组成包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨软骨祖细胞(mscs组成)、血管和神经细胞。骨细胞存在于骨基质，成骨细胞和破骨细胞存在骨表面，mscs存在于骨膜、骨内膜和包含血管的骨通道中。从致密骨中分离出的mscs，其在形态学和免疫表型上均类似于骨髓来源的mscs。此外，致密骨来源的mscs具有培养用时短，获取细胞量多，更少的非mscs贴壁细胞的污染等优势。

目前分离小鼠致密骨mscs的方法主要是酶消化法。酶消化法由于损失了一些骨表面的mscs，去除了成骨细胞和破骨细胞，所以得到的主要是骨基质中的mscs。酶消化可以使骨结构变疏松，在血清中的某些成分(生长因子)刺激下，促使骨细胞和mscs从骨片迁移到培养液中。骨细胞有增殖限制性，mscs在传代培养中逐渐成为主要细胞。但酶的浓度和消化时间对mscs的分离和培养十分重要。因此，如何稳定、高效地从致密骨中获取mscs是其能否成为理想mscs来源的关键。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法。

为实现上述目的，本发明的解决方案是：

提供一种高效获取小鼠间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)小鼠间充质干细胞的分离：

将小鼠肱骨、胫骨和股骨冲洗骨髓腔后，剪碎成骨片；将骨片转移到含有2mg/mlii型胶原酶和含10％(v/v)的胎牛血清的mem培养液中，37℃下振荡消化；吸弃上层消化液，用含10％(v/v)的胎牛血清的mem培养液反复清洗骨片，将其接种到盛有完全培养液的塑料平皿中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养3天；在第三个培养日更换新鲜的完全培养液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养2天，骨片周围爬出来的细胞集落即为原代mscs细胞；

(2)原代培养：

继续上一步骤的培养，第5个培养日吸弃细胞培养液；滴加磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次，吸弃洗涤液，加胰蛋白酶，室温消化至80％以上贴壁细胞脱落；加入含10％(v/v)胎牛血清的mem培养液终止消化，经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬，接种到细胞培养瓶中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养；每48小时更换培养液，每天观察细胞的生长状态；

培养至3-4天后，将骨片再次接种到含完全培养液的塑料平皿中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养；骨片周围再次爬出来的细胞集落重复本步骤的操作；重复接种骨片的操作共3-5次；

(3)小鼠间充质干细胞的扩增培养：

当原代培养的细胞密度达到90％以上时，吸弃细胞培养液，pbs浸洗贴壁细胞多次，吸弃洗涤液，加胰蛋白酶室温消化至80％以上贴壁细胞脱落，加入完全培养液终止消化；经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬，并进行分瓶传代扩增培养；

所述完全培养液是含有终浓度2mmol/ll-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素、3.7g/l碳酸氢钠和10％(v/v)胎牛血清的mem培养液。

本发明中，所述冲洗骨髓腔的操作是：将注射器针头插入小鼠肱骨、胫骨或股骨的骨髓腔，在mem培养液中反复抽吸、推注多次，冲洗骨髓腔直到骨髓腔变白。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明极大程度缩短了细胞培养所用时间，获取的细胞量极大提升，更少的非mscs贴壁细胞的污染的优势。

2、本发明首次建立多次骨片贴片培养法，使细胞得率提高3-5倍。

3、本发明通过对小鼠致密骨mscs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研究，证实了经体外10次扩增培养以后，细胞仍具有较强的干细胞特性，可满足实验研究的需要。不但能快速高效获取干细胞，而且获得的干细胞具有较快的增殖生长速度，及较强的分化潜能。

附图说明

图1为常规方法小鼠骨髓mscs贴壁培养方法获取的细胞p0代40倍形态学照片；

图2为常规方法小鼠骨髓mscs贴壁培养方法获取的细胞p7代40倍形态学照片；

图3为本发明从小鼠致密骨中获取的细胞p040倍形态学照片。

图4为本发明从小鼠致密骨中获取的细胞p7代40倍形态学照片。

可以看到，图3、4中与图1、2相比杂细胞少，细胞形态更一致；

图5为本发明用小鼠致密骨骨片第一次贴壁的40倍形态学照片；

图6为本发明用小鼠致密骨骨片第二次贴壁的40倍形态学照片；

图7为本发明用小鼠致密骨骨片第三次贴壁的40倍形态学照片；

可以看到，大量细胞从贴壁骨片中爬出；

图8为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，成脂诱导第12天，对诱导出的细胞进行特异性油红染色的照片；

图9为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，成骨诱导第18天，对矿化结节进行茜素红染色的照片。

图10为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，高表达细胞表面标志cd29,采用流式细胞术检测显示cd29阳性率为99.9％。

图11为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，高表达细胞表面标志cd44,采用流式细胞术检测显示cd44阳性率为95.52％。

图12为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，高表达细胞表面标志sca-1,采用流式细胞术检测显示sca-1阳性率为98.29％。

图13为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，中表达细胞表面标志cd105,采用流式细胞术检测显示cd105阳性率为52.15％。

图14为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，低表达细胞表面标志cd34,采用流式细胞术检测细胞表面标志，cd34阳性率为6.15％。

图15为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，低表达细胞表面标志cd31,采用流式细胞术检测细胞表面标志，cd31阳性率为1.11％。

图16为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，低表达细胞表面标志cd45,采用流式细胞术检测细胞表面标志，cd45阳性率为4.9％。

图17为本发明从小鼠致密骨中高效获取的mscs，低表达细胞表面标志mhc-1a,采用流式细胞术检测细胞表面标志，mhc-1a阳性率为1.89％。

具体实施方式

首先对本发明所用小鼠肱骨、胫骨和股骨的来源进行说明：

本发明所用的小鼠肱骨、胫骨和股骨均取自实验室废弃的自然死亡的小鼠：选择其中2-3周龄的体重6-8g的balb/c幼鼠尸体或c57bl/6幼鼠尸体，用100ml70％乙醇清洗后，在生物安全柜内取出肱骨、胫骨和股骨供后续试验。本发明的实施过程中，不存在杀死存活小鼠的操作，也不存在对小鼠活体采取剖开、切除等创伤性或者介入性处置。

本发明中，所述mem培养液为市购商品，系hyclone^tm生产的memalphamodification(1×)培养基，商品目录号sh30265.01(试剂商官方网站：www.gelifescience.com/hyclone)。

下面结合具体实施例子，对本发明的技术方案详细描述。

(1)小鼠间充质干细胞的分离：

取小鼠肱骨、胫骨和股骨，的将0.45mm注射器针头插入骨髓腔，在10mlmem培养液中反复抽吸，推注三次，冲洗骨髓腔直到骨髓腔变白，置于25cm²塑料平皿中，滴加1ml含100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的pbs，浸没后用眼科剪剪成1-3mm³骨片。用眼科镊将骨片转移到15ml离心管内，加入3ml含有2mg/mlii型胶原酶和10％胎牛血清的mem培养液中，置于37℃摇床上消化2小时，摇床转速是200转/分钟。吸弃上层消化液，加5ml含10％胎牛血清(v/v)的mem培养液反复清洗骨片三次后，将骨片接种到盛有5ml含有终浓度2mmol/l的l-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素，3.7g/lnahco3和10％胎牛血清的mem培养液的25cm²塑料平皿中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养3天。在第三个培养日，更换新鲜的完全培养液，在37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养2天，骨片周围爬出来的细胞集落即为原代mscs细胞；

(2)原代培养：

继续上一步骤的培养，在第5个培养日，小心吸弃细胞培养液，滴加pbs浸洗贴壁细胞两次，小心吸弃洗涤液，加1ml0.25％胰蛋白酶，室温消化(18-25℃消化3分钟以内)至80％以上贴壁细胞脱落，加入3倍含10％胎牛血清(v/v)的mem培养液终止消化，经4℃，1200转/分钟，离心4分钟分离，所得的细胞沉淀用5ml完全培养液重悬，接种到t25细胞培养瓶中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养，每48小时更换培养液，每天观察细胞的生长状态。培养3-4天后，将骨片再次接种到含完全培养液的塑料平皿中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养，骨片周围再次爬出来的细胞集落重复以上操作。重复接种骨片的操作共3-5次；

(3)小鼠间充质干细胞的扩增培养：

当上述原代培养的细胞密度达到90％以上时，吸弃细胞培养液，pbs浸洗贴壁细胞2次，吸弃洗涤液，加1ml0.25％胰蛋白酶室温消化至80％以上贴壁细胞脱落，加入3倍消化液体积的完全培养液终止消化，经4℃，1200转/分钟，离心4分钟分离所得的细胞沉淀用5ml完全培养液重悬，以1∶2传代，每48小时更换培养液，每周传代2次。

本发明首次建立多次骨片贴片培养法，使每只小鼠获得的mscs得率至少提高5倍，能缩短一半细胞培养所用时间。

本发明通过对小鼠致密骨mscs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研究，证实了经体外10次扩增培养以后，细胞仍具有较强的干细胞特性，可满足实验研究的需要。不但能快速高效获取干细胞，而且获得的干细胞具有较快的增殖生长速度，及较强的分化潜能。