本发明涉及用于检测一种病毒的引物和探针及试剂盒，尤其涉及用于检测高危型人乳头瘤病毒e6/e7mrna分型的引物和探针及试剂盒，属于生物化学
技术领域：
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背景技术：
：宫颈癌(cervicalcarcinoma)是女性常见恶性肿瘤之一，它是迄今为止唯一找出致病原因的癌症，即是由单一亚型高危型人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，简称hpv)持续感染引起的。hpv属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒a属，是球形dna病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。研究表明99％以上的宫颈癌是由于感染hpv所造成的。hpv按感染部位分类可以分为上皮型和粘膜型，其中上皮型包括1、5、8、14、20、21、25、47型，黏膜型包括6、11、16、18、31、33、35、39、41、45、51、52、56、58、59、68、70型；按照危险程度可以分为高危型和低危型，其中低危型包括6、11、41、42、43、44、66型，高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，易造成宫颈癌。hpv包括六个早期调控基因(e1、e2、e4、e5、e6、e7)和两个晚期基因(l1、l2)。早期基因参与病毒dna的复制、转录、翻译和细胞转化等功能，而晚期基因的功能是编码病毒的衣壳蛋白。其中e6、e7两个早期基因分别抑制了肿瘤的抑癌基因p53和rb而与宫颈癌的发生、发展存在直接关系。研究表明至少50％有性活动的成年人在其一生中曾感染hpv，至少80％的妇女在50岁之前曾感染hpv。但80％hpv感染者2年内会自行消退，这部分人如果以hpvdna作为检测靶标，将会呈阳性。只有20％的hpv感染者会进一步发展，即e6/e7基因整合到人类基因组通过转录出e6/e7mrna后翻译为e6/e7蛋白，诱发癌前病变及宫颈癌。所以本发明以hpve6/e7mrna作为检测靶标。在荧光定量pcr中常用的探针为taqman探针和分子信标探针。其中taqman探针存在tm值偏低，热稳定性弱，杂交特异性低等问题，易造成荧光定量pcr最终检测结果出现假阳性的情况。目前，国内仅一家hpve6/e7mrna试剂盒生产厂家，采用的是杂交捕获法，该方法操作时间长，灵敏度低且无法区分具体型别。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术存在的检测结果不准确，灵敏度低的缺陷，提出用于检测高危型人乳头瘤病毒e6/e7mrna分型的引物和探针及试剂盒，检测结果具有较好的临床参考价值。本发明首先提供的是用于检测高危型人乳头瘤病毒e6/e7mrna分型的引物及探针组，该引物包括13种高危型hpv及内参β-actin的上、下游引物及分子信标探针探针组，具体如下：hpv16的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.1，下游引物如序列表中的seqidno.2，探针如序列表中的seqidno.3；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.4，下游引物如序列表中的seqidno.5，探针如序列表中的seqidno.6；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.7，下游引物如序列表中的seqidno.8，探针如序列表中的seqidno.9；hpv18的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.10，下游引物如序列表中的seqidno.11，探针如序列表中的seqidno.12；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.13，下游引物如序列表中的seqidno.14，探针如序列表中的seqidno.15；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.16，下游引物如序列表中的seqidno.17，探针如序列表中的seqidno.18；hpv31的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.19，下游引物如序列表中的seqidno.20，探针如序列表中的seqidno.21；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.22，下游引物如序列表中的seqidno.23，探针如序列表中的seqidno.24；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.25，下游引物如序列表中的seqidno.26，探针如序列表中的seqidno.27；hpv33的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.28，下游引物如序列表中的seqidno.29，探针如序列表中的seqidno.30；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.31，下游引物如序列表中的seqidno.32，探针如序列表中的seqidno.33；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.34，下游引物如序列表中的seqidno.35，探针如序列表中的seqidno.36；hpv35的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.37，下游引物如序列表中的seqidno.38，探针如序列表中的seqidno.39；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.40，下游引物如序列表中的seqidno.41，探针如序列表中的seqidno.42；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.43，下游引物如序列表中的seqidno.44，探针如序列表中的seqidno.45；hpv39的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.46，下游引物如序列表中的seqidno.47，探针如序列表中的seqidno.48；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.49，下游引物如序列表中的seqidno.50，探针如序列表中的seqidno.51；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.52，下游引物如序列表中的seqidno.53，探针如序列表中的seqidno.54；hpv45的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.55，下游引物如序列表中的seqidno.56，探针如序列表中的seqidno.57；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.58，下游引物如序列表中的seqidno.59，探针如序列表中的seqidno.60；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.61，下游引物如序列表中的seqidno.62，探针如序列表中的seqidno.63；hpv51的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.64，下游引物如序列表中的seqidno.65，探针如序列表中的seqidno.66；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.67，下游引物如序列表中的seqidno.68，探针如序列表中的seqidno.69；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.70，下游引物如序列表中的seqidno.71，探针如序列表中的seqidno.72；hpv52的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.73，下游引物如序列表中的seqidno.74，探针如序列表中的seqidno.75；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.76，下游引物如序列表中的seqidno.77，探针如序列表中的seqidno.78；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.79，下游引物如序列表中的seqidno.80，探针如序列表中的seqidno.81；hpv56的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.82，下游引物如序列表中的seqidno.83，探针如序列表中的seqidno.84；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.85，下游引物如序列表中的seqidno.86，探针如序列表中的seqidno.87；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.88，下游引物如序列表中的seqidno.89，探针如序列表中的seqidno.90；hpv58的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.91，下游引物如序列表中的seqidno.92，探针如序列表中的seqidno.93；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.94，下游引物如序列表中的seqidno.95，探针如序列表中的seqidno.96；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.97，下游引物如序列表中的seqidno.98，探针如序列表中的seqidno.99；hpv59的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.100，下游引物如序列表中的seqidno.101，探针如序列表中的seqidno.102；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.103，下游引物如序列表中的seqidno.104，探针如序列表中的seqidno.105；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.106，下游引物如序列表中的seqidno.107，探针如序列表中的seqidno.108；hpv68的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.109，下游引物如序列表中的seqidno.110，探针如序列表中的seqidno.111；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.112，下游引物如序列表中的seqidno.113，探针如序列表中的seqidno.114；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.115，下游引物如序列表中的seqidno.116，探针如序列表中的seqidno.117；β-actin的上游引物如序列表中的seqidno.118,下游引物如序列表中的seqidno.119,探针如序列表中的seqidno.120。所述探针组还包括所有分子信标探针区的反向互补序列。本发明再进一步提供用于检测高危型人乳头瘤病毒e6/e7mrna分型的试剂盒，所述试剂盒含有逆转录预混液300μl；qrt-pcr预混液1.6ml；13种高危型hpv及内参β-actin上、下游引物及探针组,其中每一hpv亚型及内参β-actin的上、下游引物均为10μμ，160μl，分子信标探针均为10μμ，100μl；强阳性质控品500μl；弱阳性质控品500μl和阴性对照品500μl。上述试剂盒中的所述逆转录预混液包括100-300nm的dntp、5-20u/μl的逆转录酶、0.3-1u/μlrna酶抑制剂、随机引物和多聚t引物及50mmph8.3的tris-hcl，6mm二硫苏糖醇，40mmkcl，0.5mm三磷酸脱氧胸苷组成，其中随机引物为a、g、c、t四种碱基随机组成的6聚体，多聚t为18-25个多聚t碱基组成。所述qrt-pcr预混液由200-500nm的dntp、2-10mm的mg2+、浓度为0.1-0.5u/μl的taqdna聚合酶、浓度为0.01-0.02u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。该试剂盒的引物和探针可由hpv16引物探针组、hpv18引物探针组、β-actin引物探针组及零到十一种其他高危型hpv(hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68)根据需要随机组合。所述分子信标的5'端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，3'端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米等纳米粒子。所述有机荧光染料为fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox和joe，所述有机染料为tamra、dabcyl、mgb、bhq-1、bhq-2和bhq-3。阳性质控品是经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的高危型hpvdna片段的质粒转录出的rna或其互补序列，其中强阳性质控品的浓度为1×107copies/μl，弱阳性质控品的浓度为1×103copies/μl。所述阴性对照品为depc处理的水。本发明利用随机引物和多聚t作为逆转录的引物，可将总mrna逆转为cdna，只需一次逆转即可适用于所有型别hpv及内参基因β-actin的检测。以hpve6/e7mrna作为检测靶标，与以hpvdna作为检测靶标的检测方法相比具有更好的临床参考价值。同时通过巧妙的设计hpv致癌基因e6/e7及内参β-actin的特异性上、下游引物及对应的特异性分子信标探针，以qrt-pcr作为检测工具对高危型hpv进行分型检测。同时分子信标探针可以很好的克服qrt-pcr常用探针taqman探针的缺点(tm值偏低，热稳定性弱，杂交特异性低等)。本发明试剂盒具有高的灵敏度、特异性、精密度、操作简单及成本低等优势，适合于大规模推广应用。附图说明图1为hpv16的扩增曲线图(a)；hpv16的标准曲线图(b)。图2为hela细胞中hpv18mrna检测扩增曲线图。图3本试剂盒精密度实验图(a)扩增曲线图；(b)ct值汇总图。具体实施方式实施例本实施例中提供了一种13种高危型人乳头瘤病毒mrna检测试剂盒，可以对13种高危型人乳头瘤病毒e6/e7mrna进行检测，检测结果可用于临床hpv感染的辅助诊断和宫颈癌的早期筛查。本实施例以hpv16为例，其它亚型同hpv16制备相同，不再赘述。具体按以下步骤进行：1.对13种高危型hpve6/e7基因序列查询：通过nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)查询13种高危型hpve6/e7基因序列，其中hpv16在genbank中的名字为nc_001526.4，hpv16e6对应碱基位置在7125-7601，hpv16e7对应碱基位置在7604-7900；hpv18在genbank中名字为ay262282.，hpv18e6对应碱基位置在105-581，hpv18e7对应碱基位置在590-907；hpv31在genbank中名字为j04353.1，hpv31e6对应碱基位置在108-557，hpv31e7对应碱基位置在560-856；其中hpv33在genbank中名字为m12732.1，hpv33e6对应碱基位置在109-558，hpv33e7对应碱基位置在573-866；hpv35在genbank中名字为m74117.1，hpv35e6对应碱基位置在110-559，hpv35e7对应碱基位置在562-861；hpv39在genbank中名字为kc470245.1，hpv39e6对应碱基位置在107-583，hpv39e7对应碱基位置在592-921；hpv45在genbank中名字为kc470260.1，hpv45e6对应碱基位置在102-578，hpv45e7对应碱基位置在587-907；hpv51在genbank中名字为m62877.1，hpv51e6对应碱基位置在70-536，hpv51e7对应碱基位置在554-831；hpv52在genbank中名字为hq537751.1，hpv52e6对应碱基位置在102-548，hpv52e7对应碱基位置在553-852；hpv56在genbank中名字为x74483.1，hpv56e6对应碱基位置在102-566，hpv56e7对应碱基位置在572-889；hpv58在genbank中名字为d90400.1，hpv58e6对应碱基位置在110-559，hpv58e7对应碱基位置在574-870；hpv59在genbank中名字为x77858.1，hpv59e6对应碱基位置在55-537，hpv59e7对应碱基位置在542-865；hpv68在genbank中名字为dq080079.1，hpv68e6对应碱基位置在1-477，hpv68e7对应碱基位置在484-816。2.对13种高危型hpve6/e7上、下游引物及分子信标探针设计：利用beacondesigner、primerpremier5及ncbi在线设计软件对13种高危型hpv以及内参基因β-actin的上、下游引物及分子信标探针进行设计，具体设计流程如下：(1)利用primerpremier5及ncbi在线设计软件对13种高危型hpv以及内参基因β-actin的上、下游引物进行设计。(2)根据上、下游引物设计分子信标序列，并利用rnastructure、oligoanalyzer3.1及mfold对其结构进行预测；(3)利用ncbi验证引物及探针的特异性。上、下游引物均需满足如下条件：(1)扩增产物长度60-250bp之间；(2)引物长度15-25bp；(3)引物的3’端避免高gc或高at含量区域；(4)引物3’端最后一个碱基为g或者c，避免使用t；(5)正向引物和反向引物的tm值最好相差不要超过5℃。tm值调整至52℃-62℃；(6)引物的gc含量控制在30％-70％之间为好；(7)引物a、g、c、t整体分布尽量要均匀，避免使用gc或者ta含量高的区域，尤其是3’端，避开gc含量不均匀的区域；(8)引物设计时请尽量避开t/c或者a/g的连续结构；引物设计完毕用ncbiblast功能检索核对引物特异性，以避免非特异性扩增产生。分子信标设计遵循如下原则：(1)探针长度控制在18-35bp；(2)探针的tm值比引物的tm值约高5-15℃；(3)探针的(g+c)％在25％-70％之间；(4)探针区本身不存在二级结构；得到13种高危型hpv及内参β-actin的上、下游引物及探针组如下：hpv16的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.1，下游引物如序列表中的seqidno.2，探针如序列表中的seqidno.3；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.4，下游引物如序列表中的seqidno.5，探针如序列表中的seqidno.6；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.7，下游引物如序列表中的seqidno.8，探针如序列表中的seqidno.9；hpv18的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.10，下游引物如序列表中的seqidno.11，探针如序列表中的seqidno.12；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.13，下游引物如序列表中的seqidno.14，探针如序列表中的seqidno.15；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.16，下游引物如序列表中的seqidno.17，探针如序列表中的seqidno.18；hpv31的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.19，下游引物如序列表中的seqidno.20，探针如序列表中的seqidno.21；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.22，下游引物如序列表中的seqidno.23，探针如序列表中的seqidno.24；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.25，下游引物如序列表中的seqidno.26，探针如序列表中的seqidno.27；hpv33的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.28，下游引物如序列表中的seqidno.29，探针如序列表中的seqidno.30；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.31，下游引物如序列表中的seqidno.32，探针如序列表中的seqidno.33；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.34，下游引物如序列表中的seqidno.35，探针如序列表中的seqidno.36；hpv35的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.37，下游引物如序列表中的seqidno.38，探针如序列表中的seqidno.39；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.40，下游引物如序列表中的seqidno.41，探针如序列表中的seqidno.42；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.43，下游引物如序列表中的seqidno.44，探针如序列表中的seqidno.45；hpv39的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.46，下游引物如序列表中的seqidno.47，探针如序列表中的seqidno.48；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.49，下游引物如序列表中的seqidno.50，探针如序列表中的seqidno.51；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.52，下游引物如序列表中的seqidno.53，探针如序列表中的seqidno.54；hpv45的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.55，下游引物如序列表中的seqidno.56，探针如序列表中的seqidno.57；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.58，下游引物如序列表中的seqidno.59，探针如序列表中的seqidno.60；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.61，下游引物如序列表中的seqidno.62，探针如序列表中的seqidno.63；hpv51的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.64，下游引物如序列表中的seqidno.65，探针如序列表中的seqidno.66；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.67，下游引物如序列表中的seqidno.68，探针如序列表中的seqidno.69；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.70，下游引物如序列表中的seqidno.71，探针如序列表中的seqidno.72；hpv52的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.73，下游引物如序列表中的seqidno.74，探针如序列表中的seqidno.75；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.76，下游引物如序列表中的seqidno.77，探针如序列表中的seqidno.78；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.79，下游引物如序列表中的seqidno.80，探针如序列表中的seqidno.81；hpv56的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.82，下游引物如序列表中的seqidno.83，探针如序列表中的seqidno.84；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.85，下游引物如序列表中的seqidno.86，探针如序列表中的seqidno.87；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.88，下游引物如序列表中的seqidno.89，探针如序列表中的seqidno.90；hpv58的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.91，下游引物如序列表中的seqidno.92，探针如序列表中的seqidno.93；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.94，下游引物如序列表中的seqidno.95，探针如序列表中的seqidno.96；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.97，下游引物如序列表中的seqidno.98，探针如序列表中的seqidno.99；hpv59的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.100，下游引物如序列表中的seqidno.101，探针如序列表中的seqidno.102；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.103，下游引物如序列表中的seqidno.104，探针如序列表中的seqidno.105；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.106，下游引物如序列表中的seqidno.107，探针如序列表中的seqidno.108；hpv68的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.109，下游引物如序列表中的seqidno.110，探针如序列表中的seqidno.111；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.112，下游引物如序列表中的seqidno.113，探针如序列表中的seqidno.114；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.115，下游引物如序列表中的seqidno.116，探针如序列表中的seqidno.117；β-actin的上游引物如序列表中的seqidno.118,下游引物如序列表中的seqidno.119,探针如序列表中的seqidno.120。上述探针组还包括所有分子信标探针区的反向互补序列。3阳性参考品的获取目标基因转化大肠杆菌(以hpv16为例)将高危人乳头瘤病毒hpv16e6/e7序列插入质粒puc57构建重组质粒，该重组质粒转化到大肠杆菌top10中。以上部分交生工生物工程(上海)股份有限公司完成。其中hpv16e6/e7基因序列(seqidno:121)如下:大肠杆菌培养大肠杆菌在固体lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，氨苄青霉素50μg/ml，琼脂15g/l)37℃过夜培养，挑取单菌落到液体lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，氨苄青霉素50μg/ml)培养5-8h。12000r/min离心1min收集大肠杆菌菌体。大肠杆菌中质粒提取质粒提取利用天根dp103-02质粒小提试剂盒进行提取，提取步骤参考其说明书部分。利用onedrop对提取的质粒进行定量检测。目标序列的拷贝数计算方法如下：目标序列的拷贝数＝质量(g)×6.23×1023/324.5×质粒dna长度扩增质粒中hpv16目的基因(以提取的质粒作为模板)具体操作参考诺唯赞t7highyieldrnatranscriptionkit要求进行。上游引物序列(如序列表seqidno:122)如下:taatacgactcactatagggatgcaccaaaagagaactgc下游引物序列(如序列表seqidno:123)如下:ctgagaacagatggggcac体系如表1：表1试剂体积(μl)qrt-pcr预混液10上游引物100.4下游引物0.4模板2depc水补至20qrt-pcr预混液由200-500nm的dntp、2-10mm的mg2+、浓度为0.1-0.5u/μl的taqdna聚合酶、浓度为0.01-0.02u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。扩增条件如表2：表2凝胶电泳分析利用2％的琼脂糖凝胶电泳(电压110v，20min)对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，分离出约750bp处的条带，获得pcr纯化产物。体外转录体系如表3：表3组分体积(μl)10×reactionbuffer2atpsolution2gtpsolution2utpsolution2ctpsolution2pcr纯化产物2t7rnapolymerasemix2rnase-freeh2o补足20用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育2h。在反应体系中加入1μl的dnasei，37℃孵育15min，消化转录的dna模板。合成的rna利用酚/氯仿纯化法进行纯化用于去除蛋白和大部分游离核苷酸。具体如下。a.加入160μlrnase-freeh2o将产物稀释至180μl。b.加入20μl3m的醋酸钠(ph5.2)到稀释后的产物中，用移液器充分混匀。c.加入200μl的酚/氯仿混合液(1:1)进行抽提，室温10000rpm离心5min，将上层溶液(水相)转移至新的rnase-freeep管中。d.加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集上层水相。e.加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30min，4℃15000rpm离心15min。f.弃上清并加入500μl预冷的70％乙醇洗涤rna沉淀，4℃15000rpm离心，弃上清。g.开盖干燥2min，加入20-50μlrnase-freeh2o或其他缓冲液溶解rna沉淀。h.-80℃保存rna样品即为阳性参考品。阳性质控品的拷贝数＝质量(g)×6.23×1023/324.5×目标rna长度其它阳参考品的构建方法同hpv16，不再赘述。其中阳性质控品由hpv16和hpv18的阳性参考品组成。2hpv16上、下游引物及分子信标探针检测阳性质控品灵敏度分析利用本试剂盒检测灵敏度分析具体如下(hpv16为例)本试剂盒含有逆转录预混液300μl；qrt-pcr预混液1.6ml；13种高危型hpv及内参β-actin上、下游引物及探针组，其中每一hpv亚型及内参β-actin的上、下游引物均为10μμ，160μl，每一hpv亚型及内参β-actin的分子信标探针均为10μμ，100μl；强阳性质控品500μl；弱阳性质控品500μl和阴性对照品500μl。含有逆转录预混液300μl；qrt-pcr预混液1.6ml；13种高危型hpv及内参β-actin上、下游引物组,其中每一hpv亚型及内参β-actin的上、下游引物及探针组均为上下游引物10μμ，160μl；13种高危型hpv及内参β-actin检测用分子信标探针组，其中每一hpv亚型及内参β-actin的分子信标探针均为10μμ，100μl；强阳性质控品500μl；弱阳性质控品500μl和阴性对照品500μl。同时本试剂盒还提供强阳性质控品、弱阳性质控品及阴性对照，具体如下：阳性质控品是经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的高危型hpvdna片段的质粒体外转录出的mrna或者其互补序列，其中强阳性质控品的浓度为1×107copies/μl，弱阳性质控品的浓度为1×103copies/μl，阴性对照品为depc处理的水。该试剂盒可以由hpv16引物探针组、hpv18引物探针组、β-actin引物探针组及零到十一种其他高危型hpv(hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68)根据实验需要任意组合。取20μlhpv16阳性参考品加入180μldepc处理的水，依次进行梯度稀释，获得不同梯度的阳性质控品。依次为1×109copies/μl、1×108copies/μl、1×107copies/μl、1×106copies/μl、1×105copies/μl、1×104copies/μl、1×103copies/μl、1×102copies/μl。逆转录体系如表4：表4逆转录预混液包括100-300nm的dntp、5-20u/μl的逆转录酶、0.3-1u/μlrna酶抑制剂、随机引物和多聚t引物及50mmph8.3的tris-hcl，6mm二硫苏糖醇，40mmkcl，0.5mm三磷酸脱氧胸苷组成，其中随机引物为a、g、c、t四种碱基随机组成的6聚体，多聚t为18-25个多聚t碱基组成。反应条件如表5：表5逆转录产物(cdna)-20℃保存。利用qrt-pcr验证上、下游引物及分子信标检测阳性参考品的cdna。qrt-pcr反应体系如表6：表6qrt-pcr预混液由200-500nm的dntp、2-10mm的mg2+、浓度为0.1-0.5u/μl的taqdna聚合酶、浓度为0.01-0.02u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。hpv16上游引物序列如下：cactgtgtcctgaagaaaagchpv16上游引物序列如下：tgggtttctctacgtgttcttghpv16分子信标探针序列如下：fam-cgccaccggtcgatgtatgtcttgttgcagattggcg-bhq1本发明中所有序列的方向从左到右为序列的5’到3’方向，上述hpv16分子信标探针表明在其5’端修饰fam，3’端修饰bhq1,下面表述方法同上，不再赘述。qrt-pcr反应条件如表7：表7由图2可知，本发明检测hpv16最低可以检测到1×102copies/μl，且当hpv16阳性质控品在1×109copies/μl到1×102copies/μl范围内呈现较好的线性范围。3hela细胞hpv18mrna检测因hela细胞是hpv18基因整合的阳性细胞株，为了验证设计的引物及探针的可行性，对hela细胞中的hpv18mrna进行了检测。具体检测步骤及结果如下：hela细胞培养hela细胞培养在含10％胎牛血清的dmem培养液(含青霉素100ku/l，链霉素100μg/ml)，37℃、5％浓度二氧化碳、饱和湿度环境的条件下连续培养。hela细胞mrna提取利用trizol对hela细胞总mrna进行提取，具体如下:(1)将hela细胞放入1.5ml离心管，然后加入1mltrizol，吹打数次后15-30℃静置5min。(2)向1.5ml离心管中加入200μl氯仿，上下颠倒数次15-30℃静置3-5min。(3)4℃、12000r/min离心15min，取出放在冰上。(4)吸取上层700μl至新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀置-20℃静置10min。(5)4℃、12000r/min离心10min弃上清，每个离心管加入1ml75％乙醇，适当混匀。(6)7500r/min离心5min弃上清，加入20μldepc水，吹打数次使rna完全溶解，-80℃保存。逆转录逆转录体系如表8：表8成分体积(μl)提取总mrna8逆转录预混液2逆转录预混液包括100-300nm的dntp、5-20u/μl的逆转录酶、0.3-1u/μlrna酶抑制剂、随机引物和多聚t引物及50mmph8.3的tris-hcl，6mm二硫苏糖醇，40mmkcl，0.5mm三磷酸脱氧胸苷组成，其中随机引物为a、g、c、t四种碱基随机组成的6聚体，多聚t为18-25个多聚t碱基组成。反应条件如表9：表9温度(℃)时间(min)25105030855逆转录产物(cdna)-20℃保存。qrt-pcr对hpv18mrna的cdna进行检测反应体系如表10：表10qrt-pcr预混液由200-500nm的dntp、2-10mm的mg2+、浓度为0.1-0.5u/μl的taqdna聚合酶、浓度为0.01-0.02u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。其中13种hpv上、下游引物及探针组序列如下：hpv16上游引物序列如下：ccagagacaactgatctctactghpv16下游引物序列如下：gtccggttctgcttgtcchpv16分子信标探针如下：fam-ccgcgagacagctcagaggaggaggatgaaatagtcgcgg-bhq1hpv18上游引物序列如下：caacatttaccagcccgachpv18下游引物序列如下：gctggaatgctcgaagghpv18分子信标探针如下：vic-cgcgaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccatcgcg-bhq1hpv31上游引物序列如下：tgtgtacagagcacacaagtaghpv31下游引物序列如下：ttacagtctagtagaacagttgghpv31分子信标探针如下：texasred-cgcgatgttaatgggctcatttggaatcgtgtgtcgcg-dabyclehpv33上游引物序列如下：agcaattaagtgacagctchpv33下游引物序列如下：caagtgtgacaacaggttachpv33分子信标探针如下：cy5-cgcgaggaccggccagatggacaagtcgcg-bhq3hpv35上游引物序列如下：acccgaggcaactgacctatachpv35下游引物序列如下：tgtacacacagacgtagtgtchpv35分子信标探针如下：fam-cgcgagacaagcaaaaccagacacctccaattcgcg-bhq1hpv39上游引物序列如下：tgaactacagccggttgachpv39下游引物序列如下：cagctgcagtgtgttgttachpv39分子信标探针如下：vic-ccgcgagagcaattaggagagtcagaggatgaaatcgcgg-bhq1hpv45上游引物序列如下：cagaaaccattgaacccaghpv45下游引物序列如下：tctttcttgccgtgcctghpv45分子信标探针如下：fam-cgcgaaaaacgtagacaccttaaggacaaacgatcgcg-bhq1hpv51上游引物序列如下：tggtaaaagtatagaagaachpv51下游引物序列如下：cgttcaaagcttcacataattchpv51分子信标探针如下：vic-cgcgagaagacaagagggaaagaccacgatcgcg-bhq1hpv52上游引物序列如下：aggatccagcaacacgachpv52下游引物序列如下：ttttacactgcacacactgchpv52分子信标探针如下：fam-cgcgatgaggtgctggaagaatcggttcgcg-bhq1hpv56上游引物序列如下：gccacagcaagctagacaaghpv56下游引物序列如下：taacgcacccataagcagchpv56分子信标探针如下：vic-cgcgagttgtgagtgtaagtttgtggtgcagttggtcgcg-bhq1hpv58上游引物序列如下：agcaattatgtgacagctcaghpv58下游引物序列如下：atacacaaacgaaccgtgghpv58分子信标探针如下：fam-cgcgaggacgggccagatggacaagtcgcg-bhq1hpv59上游引物序列如下：tggcacgctttgaggatchpv59上游引物序列如下：ctctttcttgcagttcccchpv59分子信标探针如下：vic-cgccaacgaccatacaaactgcctgatttgagtggcg-bhq1hpv68上游引物序列如下：tgtatgtcacgagcaattagghpv68上游引物序列如下：gttacacttacaacacagacachpv68分子信标探针如下：fam-cgcgaatcaccaccaacatctactactagccatcgcg-bhq1qrt-pcr反应条件如表11：表11图3中hpv18呈良好的扩增曲线，说明本发明试剂盒可以检测hela细胞中hpv18mrna且具有较好的特异性。5精密度检测按照上述hpv16的qrt-pcr反应体系及反应条件，取hpv16的阳性质控品，重复检测六次。由图4可知本发明具有较好的精密度。6.临床样本分析6.1.宫颈脱落细胞总mrna提取利用trizol对宫颈脱落细胞总mrna进行提取。利用trizol对临床样本总mrna进行提取，具体如下：(1)将临床样本放入1.5ml离心管，然后加入1mltrizol，吹打数次后15-30℃静置5min。(2)向1.5ml离心管中加入200μl氯仿，上下颠倒数次15-30℃静置3-5min。(3)4℃、12000r/min离心15min，取出放在冰上。(4)吸取上层700μl至新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀置-20℃静置10min。(5)4℃、12000r/min离心10min弃上清，每个离心管加入1ml75％乙醇，适当混匀。(6)7500r/min离心5min弃上清，加入20μldepc水，吹打数次使rna完全溶解，-80℃保存。6.1.2宫颈脱落细胞总mrna逆转录为cdna利用本试剂盒的逆转录混合液将提取的宫颈脱落细胞总mrna逆转录为cdna.逆转录体系如表12：表12成分体积(μl)提取总mrna8逆转录预混液2逆转录预混液包括100-300nm的dntp、5-20u/μl的逆转录酶、0.3-1u/μlrna酶抑制剂、随机引物和多聚t引物及50mmph8.3的tris-hcl，6mm二硫苏糖醇，40mmkcl，0.5mm三磷酸脱氧胸苷组成，其中随机引物为a、g、c、t四种碱基随机组成的6聚体，多聚t为18-25个多聚t碱基组成。反应条件如表13：表13温度(℃)时间(min)25105030855逆转录产物(cdna)-20℃保存。6.1.3qrt-pcr对cdna进行定性检测。利用本试剂盒的qrt-pcr反应液及qrt-pcr上、下游引物及qrt-pcr对hpvmrna进行检测反应体系如表14：表14qrt-pcr预混液由200-500nm的dntp、2-10mm的mg2+、浓度为0.1-0.5u/μl的taqdna聚合酶、浓度为0.01-0.02u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。13种hpv及内参的上、下游引物及探针组如下：hpv16上游引物序列如下：ccagagacaactgatctctactghpv16下游引物序列如下：gtccggttctgcttgtcchpv16分子信标探针如下：fam-ccgcgagacagctcagaggaggaggatgaaatagtcgcgg-bhq1hpv18上游引物序列如下：caacatttaccagcccgachpv18下游引物序列如下：gctggaatgctcgaagghpv18分子信标探针如下：vic-cgcgaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccatcgcg-bhq1hpv31上游引物序列如下：tgtgtacagagcacacaagtaghpv31下游引物序列如下：ttacagtctagtagaacagttgghpv31分子信标探针如下：texasred-cgcgatgttaatgggctcatttggaatcgtgtgtcgcg-dabyclehpv33上游引物序列如下：agcaattaagtgacagctchpv33下游引物序列如下：caagtgtgacaacaggttachpv33分子信标探针如下：cy5-cgcgaggaccggccagatggacaagtcgcg-bhq3hpv35上游引物序列如下：acccgaggcaactgacctatachpv35下游引物序列如下：tgtacacacagacgtagtgtchpv35分子信标探针如下：fam-cgcgagacaagcaaaaccagacacctccaattcgcg-bhq1hpv39上游引物序列如下：tgaactacagccggttgachpv39下游引物序列如下：cagctgcagtgtgttgttachpv39分子信标探针如下：vic-ccgcgagagcaattaggagagtcagaggatgaaatcgcgg-bhq1hpv45上游引物序列如下：cagaaaccattgaacccaghpv45下游引物序列如下：tctttcttgccgtgcctghpv45分子信标探针如下：fam-cgcgaaaaacgtagacaccttaaggacaaacgatcgcg-bhq1hpv51上游引物序列如下：tggtaaaagtatagaagaachpv51下游引物序列如下：cgttcaaagcttcacataattchpv51分子信标探针如下：vic-cgcgagaagacaagagggaaagaccacgatcgcg-bhq1hpv52上游引物序列如下：aggatccagcaacacgachpv52下游引物序列如下：ttttacactgcacacactgchpv52分子信标探针如下：fam-cgcgatgaggtgctggaagaatcggttcgcg-bhq1hpv56上游引物序列如下：gccacagcaagctagacaaghpv56下游引物序列如下：taacgcacccataagcagchpv56分子信标探针如下：vic-cgcgagttgtgagtgtaagtttgtggtgcagttggtcgcg-bhq1hpv58上游引物序列如下：agcaattatgtgacagctcaghpv58下游引物序列如下：atacacaaacgaaccgtgghpv58分子信标探针如下：fam-cgcgaggacgggccagatggacaagtcgcg-bhq1hpv59上游引物序列如下：tggcacgctttgaggatchpv59上游引物序列如下：ctctttcttgcagttcccchpv59分子信标探针如下：vic-cgccaacgaccatacaaactgcctgatttgagtggcg-bhq1hpv68上游引物序列如下：tgtatgtcacgagcaattagghpv68上游引物序列如下：gttacacttacaacacagacachpv68分子信标探针如下：fam-cgcgaatcaccaccaacatctactactagccatcgcg-bhq1β-actin上游引物序列如下：agtgctgtctggcggcβ-actin上游引物序列如下：tcttcattgtgctgggtgccβ-actin分子信标探针序列如下：fam-cgcgagccgacaggatgcagaaggagattcgcg-bhq1qrt-pcr反应条件如表15：表15检测结果如表16：表16表16表明本发明的检测方法与现有临床检测结果一致，说明本方法检测的可行性。结合本发明专利的灵敏度分析及临床检测结果，本试剂盒的结果判读方法如下：1.如果内参基因无扩增产物则认为该实验无效。2.如果内参基因有扩增，靶标序列的循环值在30个循环以内且有良好的扩增曲线，则认为扩增有效。3.如果内参基因有扩增，靶标序列的循环值在30-35个循环且有良好的扩增曲线，需重复试验，如果结果和上面试验结果一致，则认为扩增有效。如果无扩增，则认为扩增结果无效，不存在靶标序列。除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。序列表<110>中国药科大学<120>用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因e6/e7mrna分型的引物和探针及试剂盒<130>2017<160>123<210>seqidno:1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1aatgtgtgtactgcaagcaacag<210>seqidno:2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2acagcatatggattcccatctc<210>seqidno:3<211>38<212>dna<213>人工序列<400>3cgcgatgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgcg<210>seqidno:4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4ccagagacaactgatctctactg<210>seqidno:5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5gtccggttctgcttgtcc<210>seqidno:6<211>40<212>dna<213>人工序列<400>6ccgcgagacagctcagaggaggaggatgaaatagtcgcgg<210>seqidno:7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7cactgtgtcctgaagaaaagc<210>seqidno:8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8tgggtttctctacgtgttcttg<210>seqidno:9<211>37<212>dna<213>人工序列<400>9cgccaccggtcgatgtatgtcttgttgcagattggcg<210>seqidno:10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10gaattgagctagtagtagaaag<210>seqidno:11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11cggacacacaaaggacaggg<210>seqidno:12<211>3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