用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因E6/E7DNA分型的引物和探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及用于检测一种病毒的引物和探针及试剂盒，尤其涉及用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因e6/e7dna分型的引物和探针及试剂盒，属于生物化学技术领域。

背景技术：

宫颈癌(cervicalcancer)是女性常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的健康。据报道，全世界每年有527600新发病例，同时每年约265700人死于宫颈癌。与发达国家相比，发展中国家面临的问题更为严重，每年宫颈癌死亡病例将近90％发生在发展中国家。我国国家癌症中心发布的最新数据表明，中国女性宫颈癌发病率为10.4/105，新发病例87982；死亡率2.59/105，死亡病例23375；然而在非洲地区，威胁女性健康的恶性肿瘤中，宫颈癌排在第一位。宫颈癌流行分布存在这样的地理差异，是因为宫颈癌作为一种与感染相关的疾病，与一个地区经济状况和卫生条件存在很大的相关性。临床研究发现，单一亚型高危型人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)持续性感染为目前己确定的诱发宫颈癌主要病因，所以如果能够早期及分型检测人体是否感染hpv对于宫颈癌的筛查具有重要的意义。

hpv属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒a属，是球形dna病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。hpv基因组由7200-8000个碱基组成，共编码3个功能区，即早期转录区、晚期转录区和上游调控区(urr)。早期转录区约占4kb，编码5-8个开放阅读框架，依次为e1(e8)、e2、e4(e3)、e5、e6、e7，具有参与病毒dna的复制、转录、翻译和细胞转化等功能。其中e6基因能够转录、翻译出一种多功能蛋白，该多功能蛋白能与细胞内的e6相关蛋白(e6ap)形成复合物，特异性的结合抑癌基因p53的产物，使p53降解失活，导致细胞周期失控；作为一种多功能蛋白，它还可以通过激活端粒酶使正常细胞永生化。e7蛋白能与成视网膜细胞瘤(rb)抑制蛋白结合，与hpv的致癌密切相关。晚期区(l区)约3kb，两个主要的开发阅读框架分别为l1、l2，功能是编码病毒的衣壳蛋白。已经有110多种hpv被鉴定出来，按照危险程度可以分为高危型和低危型，其中低危型包括6、11、41、42、43、44、66型；高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，易造成宫颈癌。研究表明，单一亚型高危型hpv持续感染是诱发宫颈癌的主要诱因。

目前hpv分型检测方法主要有核酸杂交(核酸印记原位杂交、斑点印记杂交、原位杂交和pcr-反向点杂交)、基因芯片及荧光定量pcr等方法。其中核酸杂交具有好的特异性，但操作复杂，耗时长不适合临床上大规模使用。基因芯片法能检测同一样本中多种亚型，但价格昂贵，大大制约了其在临床上的应用。荧光定量pcr具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。在荧光定量pcr中常用的探针为taqman探针，taqman探针存在tm值偏低，热稳定性弱，杂交特异性低等问题，从而引起荧光pcr最终检测结果出现假阳性的情况。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有hpvl1检测靶标的不准确性提出以hpve6/e7作为检测靶标。同时针对现有技术存在的检测结果不准确的缺陷，提出用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因e6/e7dna分型的引物和探针及试剂盒，检测结果具有较好的临床参考价值。

由于目前临床上对hpv进行分型检测的试剂盒多以hpv的l1区域作为检测靶标，其实hpvl1区并不是hpv的致癌基因，在hpv整合进入基因组过程中可能会导致hpv任何区域的断裂或缺失，如果e6/e7基因断裂或者缺失那么hpv将不致病，只是现有临床试剂盒仍然可以检测到hpvl1，此时就会出现假阳性结果，相反，则会出现检测hpv的假阴性结果，所以本发明以hpve6/e7基因作为检测靶标。

本发明首先提供的是用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因e6/e7dna分型的引物及探针组，该引物及探针组包括13种高危型hpv及内参β-actin的上、下游引物及探针组，具体如下：

hpv16的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.1，下游引物如序列表中的seqidno.2，探针如序列表中的seqidno.3；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.4，下游引物如序列表中的seqidno.5，探针如序列表中的seqidno.6；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.7，下游引物如序列表中的seqidno.8，探针如序列表中的seqidno.9；

hpv18的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.10，下游引物如序列表中的seqidno.11，探针如序列表中的seqidno.12；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.13，下游引物如序列表中的seqidno.14，探针如序列表中的seqidno.15；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.16，下游引物如序列表中的seqidno.17，探针如序列表中的seqidno.18；

hpv31的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.19，下游引物如序列表中的seqidno.20，探针如序列表中的seqidno.21；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.22，下游引物如序列表中的seqidno.23，探针如序列表中的seqidno.24；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.25，下游引物如序列表中的seqidno.26，探针如序列表中的seqidno.27；

hpv33的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.28，下游引物如序列表中的seqidno.29，探针如序列表中的seqidno.30；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.31，下游引物如序列表中的seqidno.32，探针如序列表中的seqidno.33；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.34，下游引物如序列表中的seqidno.35，探针如序列表中的seqidno.36；

hpv35的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.37，下游引物如序列表中的seqidno.38，探针如序列表中的seqidno.39；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.40，下游引物如序列表中的seqidno.41，探针如序列表中的seqidno.42；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.43，下游引物如序列表中的seqidno.44，探针如序列表中的seqidno.45；

hpv39的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.46，下游引物如序列表中的seqidno.47，探针如序列表中的seqidno.48；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.49，下游引物如序列表中的seqidno.50，探针如序列表中的seqidno.51；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.52，下游引物如序列表中的seqidno.53，探针如序列表中的seqidno.54；

hpv45的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.55，下游引物如序列表中的seqidno.56，探针如序列表中的seqidno.57；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.58，下游引物如序列表中的seqidno.59，探针如序列表中的seqidno.60；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.61，下游引物如序列表中的seqidno.62，探针如序列表中的seqidno.63；

hpv51的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.64，下游引物如序列表中的seqidno.65，探针如序列表中的seqidno.66；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.67，下游引物如序列表中的seqidno.68，探针如序列表中的seqidno.69；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.70，下游引物如序列表中的seqidno.71，探针如序列表中的seqidno.72；

hpv52的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.73，下游引物如序列表中的seqidno.74，探针如序列表中的seqidno.75；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.76，下游引物如序列表中的seqidno.77，探针如序列表中的seqidno.78；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.79，下游引物如序列表中的seqidno.80，探针如序列表中的seqidno.81；

hpv56的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.82，下游引物如序列表中的seqidno.83，探针如序列表中的seqidno.84；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.85，下游引物如序列表中的seqidno.86，探针如序列表中的seqidno.87；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.88，下游引物如序列表中的seqidno.89，探针如序列表中的seqidno.90；

hpv58的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.91，下游引物如序列表中的seqidno.92，探针如序列表中的seqidno.93；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.94，下游引物如序列表中的seqidno.95，探针如序列表中的seqidno.96；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.97，下游引物如序列表中的seqidno.98，探针如序列表中的seqidno.99；

hpv59的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.100，下游引物如序列表中的seqidno.101，探针如序列表中的seqidno.102；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.103，下游引物如序列表中的seqidno.104，探针如序列表中的seqidno.105；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.106，下游引物如序列表中的seqidno.107，探针如序列表中的seqidno.108；

hpv68的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.109，下游引物如序列表中的seqidno.110，探针如序列表中的seqidno.111；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.112，下游引物如序列表中的seqidno.113，探针如序列表中的seqidno.114；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.115，下游引物如序列表中的seqidno.116，探针如序列表中的seqidno.117；

β-actin的上游引物如序列表中的seqidno.118,下游引物如序列表中的seqidno.119,探针如序列表中的seqidno.120。

所述探针组还包括所有分子信标探针区的反向互补序列。

本发明再进一步提供用于检测高危型人乳头瘤病毒e6/e7dna分型的试剂盒，所述试剂盒含有qrt-pcr预混液；13种高危型hpv及内参β-actin上、下游引物及探针组；强阳性质控品及弱阳性质控品和阴性对照品，其中所述qrt-pcr预混液1.6ml；所述13种高危型hpv及内参β-actin上、下游引物及探针组中每一hpv亚型及内参β-actin的上、下游引物均为10μμ，150μl，分子信标探针均为10μμ，160μl；所述强阳性质控品500μl；所述弱阳性质控品500μl；所述阴性对照品500μl。

上述试剂盒中的所述qrt-pcr预混液由100-300nm的dntp、1-10mm的mg²⁺、0.04-0.3u/μl的taqdna聚合酶、0.01-0.05u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。

该试剂盒可以由hpv16引物探针组、hpv18引物探针组、β-actin引物探针组及零到十一种其他高危型hpv(hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68)组成。

所述分子信标的5'端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，3'端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米等纳米粒子。

所述有机荧光染料为fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe和texasred，所述有机猝灭染料为tamra、dabcyl、mgb、bhq-1、bhq-2和bhq-3。

阳性质控品是经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的高危型hpvdna片段的质粒，其中强阳性质控品的浓度为1×10⁷copies/μl，弱阳性质控品的浓度为1×10³copies/μl。

所述阴性对照品为depc处理的水。

本发明通过巧妙的设计hpv致癌基因e6/e7的上、下游引物及分子信标探针，具有较高的灵敏度及特异性。同时分子信标探针可以很好的克服qrt-pcr常用探针taqman探针的缺点(tm值偏低，热稳定性弱，杂交特异性低等)。本发明以hpv致癌基因e6/e7基因作为检测靶标，利用本试剂盒中针对13种高危型hpv致癌基因e6/e7基因设计的上、下游引物及分子信标探针对13种高危型hpv进行分型检测。与以hpvl1区作为检测靶标的检测方法相比，该方法具有较好的临床参考价值。利用本发明方法设计的13种高危型hpve6/e7基因的上、下游引物及分子信标探针对13种高危型hpv进行分型检测，与现有的核酸杂交检测相比，操作简单，假阳性结果概率小；与基因芯片检测方法相比具有成本低、操作简单等优势；同时本发明专利中使用的分子信标探针可以很好的克服qrt-pcr常用探针taqman探针的缺点(tm值偏低，热稳定性弱，杂交特异性低等)。本发明试剂盒具有高的灵敏度、特异性、精密度、操作简单及成本低等优势，适合于大规模推广应用。

附图说明

图1为本发明试剂盒扩增hpv18的扩增曲线图(a)；本发明试剂盒扩增hpv18的标准曲线图(b)。

图2为本发明试剂盒扩增hpv31的扩增曲线图(a)；本发明试剂盒扩增hpv31的标准曲线图(b)。

图3为hela细胞中hpv18及其它高危型hpv基因扩增曲线图。

图4为本试剂盒精密度实验图(a)扩增曲线图；(b)ct值汇总图。

具体实施方式

实施例

本实施例中提供了一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，可以对高危型人乳头瘤病毒的感染情况进行定性定量检测。本试剂盒可以对13种高危型人乳头瘤病毒进行分型检测，包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。可用于临床hpv感染的辅助诊断和宫颈癌的早期筛查。本实施例以含hpv18的试剂盒为例，其它亚型同hpv18制备相同，不再赘述。

具体按以下步骤进行：

1.对13种高危型hpve6/e7基因序列查询：

通过nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)查询13种高危型hpve6/e7基因序列，其中hpv16在genbank中的名字为nc_001526.4，hpv16e6对应碱基位置在7125-7601，hpv16e7对应碱基位置在7604-7900；hpv18在genbank中名字为ay262282.，hpv18e6对应碱基位置在105-581，hpv18e7对应碱基位置在590-907；hpv31在genbank中名字为j04353.1，hpv31e6对应碱基位置在108-557，hpv31e7对应碱基位置在560-856；其中hpv33在genbank中名字为m12732.1，hpv33e6对应碱基位置在109-558，hpv33e7对应碱基位置在573-866；hpv35在genbank中名字为m74117.1，hpv35e6对应碱基位置在110-559，hpv35e7对应碱基位置在562-861；hpv39在genbank中名字为kc470245.1，hpv39e6对应碱基位置在107-583，hpv39e7对应碱基位置在592-921；hpv45在genbank中名字为kc470260.1，hpv45e6对应碱基位置在102-578，hpv45e7对应碱基位置在587-907；hpv51在genbank中名字为m62877.1，hpv51e6对应碱基位置在70-536，hpv51e7对应碱基位置在554-831；hpv52在genbank中名字为hq537751.1，hpv52e6对应碱基位置在102-548，hpv52e7对应碱基位置在553-852；hpv56在genbank中名字为x74483.1，hpv56e6对应碱基位置在102-566，hpv56e7对应碱基位置在572-889；hpv58在genbank中名字为d90400.1，hpv58e6对应碱基位置在110-559，hpv58e7对应碱基位置在574-870；hpv59在genbank中名字为x77858.1，hpv59e6对应碱基位置在55-537，hpv59e7对应碱基位置在542-865；hpv68在genbank中名字为dq080079.1，hpv68e6对应碱基位置在1-477，hpv68e7对应碱基位置在484-816。

2.对13种高危型hpv致癌基因e6/e7设计上、下游引物及分子信标探针：

利用beacondesigner、primerpremier5及ncbi在线设计软件对13种高危型hpv以及内参基因β-actin的上、下游引物及分子信标探针进行设计，具体设计流程如下：

(1)利用primerpremier5及ncbi在线设计软件对13种高危型hpv以及内参基因β-actin的上、下游引物进行设计。(2)根据上、下游引物设计分子信标序列，并利用rnastructure、oligoanalyzer3.1及mfold对其结构进行预测；(3)利用ncbi验证引物及探针的特异性。

上、下游引物均需满足如下条件：(1)扩增产物长度60-250bp之间；(2)引物长度15-25bp；(3)引物的3’端避免高gc或高at含量区域；(4)引物3’端最后一个碱基为g或者c，避免使用t；(5)正向引物和反向引物的tm值最好相差不要超过5℃。tm值调整至52℃-62℃；(6)引物的gc含量控制在30％-70％之间为好；(7)引物a、g、c、t整体分布尽量要均匀，避免使用gc或者ta含量高的区域，尤其是3’端，避开gc含量不均匀的区域；(8)引物设计时请尽量避开t/c或者a/g的连续结构；引物设计完毕用ncbiblast功能检索核对引物特异性，以避免非特异性扩增产生。

分子信标设计遵循如下原则：(1)探针长度控制在18-35bp；(2)探针的tm值比引物的tm值约高5-15℃；(3)探针的(g+c)％在25％-70％之间；(4)探针区本身不存在二级结构；

得到13种高危型hpv及内参β-actin的上、下游引物及探针组如下：

hpv16的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.1，下游引物如序列表中的seqidno.2，探针如序列表中的seqidno.3；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.4，下游引物如序列表中的seqidno.5，探针如序列表中的seqidno.6；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.7，下游引物如序列表中的seqidno.8，探针如序列表中的seqidno.9；

hpv18的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.10，下游引物如序列表中的seqidno.11，探针如序列表中的seqidno.12；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.13，下游引物如序列表中的seqidno.14，探针如序列表中的seqidno.15；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.16，下游引物如序列表中的seqidno.17，探针如序列表中的seqidno.18；

hpv31的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.19，下游引物如序列表中的seqidno.20，探针如序列表中的seqidno.21；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.22，下游引物如序列表中的seqidno.23，探针如序列表中的seqidno.24；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.25，下游引物如序列表中的seqidno.26，探针如序列表中的seqidno.27；

hpv33的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.28，下游引物如序列表中的seqidno.29，探针如序列表中的seqidno.30；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.31，下游引物如序列表中的seqidno.32，探针如序列表中的seqidno.33；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.34，下游引物如序列表中的seqidno.35，探针如序列表中的seqidno.36；

hpv35的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.37，下游引物如序列表中的seqidno.38，探针如序列表中的seqidno.39；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.40，下游引物如序列表中的seqidno.41，探针如序列表中的seqidno.42；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.43，下游引物如序列表中的seqidno.44，探针如序列表中的seqidno.45；

hpv39的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.46，下游引物如序列表中的seqidno.47，探针如序列表中的seqidno.48；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.49，下游引物如序列表中的seqidno.50，探针如序列表中的seqidno.51；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.52，下游引物如序列表中的seqidno.53，探针如序列表中的seqidno.54；

hpv45的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.55，下游引物如序列表中的seqidno.56，探针如序列表中的seqidno.57；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.58，下游引物如序列表中的seqidno.59，探针如序列表中的seqidno.60；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.61，下游引物如序列表中的seqidno.62，探针如序列表中的seqidno.63；

hpv51的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.64，下游引物如序列表中的seqidno.65，探针如序列表中的seqidno.66；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.67，下游引物如序列表中的seqidno.68，探针如序列表中的seqidno.69；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.70，下游引物如序列表中的seqidno.71，探针如序列表中的seqidno.72；

hpv52的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.73，下游引物如序列表中的seqidno.74，探针如序列表中的seqidno.75；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.76，下游引物如序列表中的seqidno.77，探针如序列表中的seqidno.78；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.79，下游引物如序列表中的seqidno.80，探针如序列表中的seqidno.81；

hpv56的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.82，下游引物如序列表中的seqidno.83，探针如序列表中的seqidno.84；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.85，下游引物如序列表中的seqidno.86，探针如序列表中的seqidno.87；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.88，下游引物如序列表中的seqidno.89，探针如序列表中的seqidno.90；

hpv58的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.91，下游引物如序列表中的seqidno.92，探针如序列表中的seqidno.93；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.94，下游引物如序列表中的seqidno.95，探针如序列表中的seqidno.96；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.97，下游引物如序列表中的seqidno.98，探针如序列表中的seqidno.99；

hpv59的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.100，下游引物如序列表中的seqidno.101，探针如序列表中的seqidno.102；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.103，下游引物如序列表中的seqidno.104，探针如序列表中的seqidno.105；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.106，下游引物如序列表中的seqidno.107，探针如序列表中的seqidno.108；

hpv68的上、下游引物及探针可以为以下三组中的任一组，具体第一组，上游引物如序列表中的seqidno.109，下游引物如序列表中的seqidno.110，探针如序列表中的seqidno.111；第二组，上游引物如序列表中的seqidno.112，下游引物如序列表中的seqidno.113，探针如序列表中的seqidno.114；第三组，上游引物如序列表中的seqidno.115，下游引物如序列表中的seqidno.116，探针如序列表中的seqidno.117；

β-actin的上游引物如序列表中的seqidno.118,下游引物如序列表中的seqidno.119,探针如序列表中的seqidno.120。

上述探针组还包括所有分子信标探针区的反向互补序列。

3.制备阳性参考品

流程如下：(1)目标基因转化大肠杆菌，获得含目标基因质粒的重组大肠杆菌；(2)培养大肠杆菌；(3)提取大肠杆菌中质粒，获得目标基因；具体是：

3.1目标基因转化大肠杆菌(以hpv18为例)

将高危人乳头瘤病毒hpv18e6/e7序列插入质粒puc57构建重组质粒，该重组质粒转化到大肠杆菌top10中。以上部分交生工生物工程(上海)股份有限公司完成。其中hpv18e6/e7基因序列(如序列表seqidno:121)如下:

注意：如无特殊说明本发明的序列从左到右均为5’到3’方向。

3.2大肠杆菌培养

大肠杆菌在固体lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，氨苄青霉素50μg/ml，琼脂15g/l)37℃过夜培养，挑取单菌落到液体lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，氨苄青霉素50μg/ml)培养5-8小时。12000r/min离心1min收集大肠杆菌菌体。

3.3大肠杆菌中质粒提取

质粒提取利用天根生化科技(北京)有限公司dp103-02质粒小提试剂盒进行提取，提取步骤参考其说明书部分。利用onedrop对提取的质粒进行定量检测。目标序列的拷贝数计算方法如下：

目标序列的拷贝数＝质量(g)×6.23×10²³/324.5×质粒dna长度

其它亚型阳性参考品构建方法同hpv18，只需将hpv18的序列换成如下序列，不再赘述。

hpv16，genbank中的名字为nc_001526.4，hpv16e6对应碱基位置在7125-7601，hpv16e7对应碱基位置在7604-7900；hpv31，genbank中名字为j04353.1，hpv31e6对应碱基位置在108-557，hpv31e7对应碱基位置在560-856；hpv33，genbank中名字为m12732.1，hpv33e6对应碱基位置在109-558，hpv33e7对应碱基位置在573-866；hpv35，genbank中名字为m74117.1，hpv35e6对应碱基位置在110-559，hpv35e7对应碱基位置在562-861；hpv39，genbank中名字为kc470245.1，hpv39e6对应碱基位置在107-583，hpv39e7对应碱基位置在592-921；hpv45，genbank中名字为kc470260.1，hpv45e6对应碱基位置在102-578，hpv45e7对应碱基位置在587-907；hpv51，genbank中名字为m62877.1，hpv51e6对应碱基位置在70-536，hpv51e7对应碱基位置在554-831；hpv52，genbank中名字为hq537751.1，hpv52e6对应碱基位置在102-548，hpv52e7对应碱基位置在553-852；hpv56，genbank中名字为x74483.1，hpv56e6对应碱基位置在102-566，hpv56e7对应碱基位置在572-889；hpv58，genbank中名字为d90400.1，hpv58e6对应碱基位置在110-559，hpv58e7对应碱基位置在574-870；hpv59，genbank中名字为x77858.1，hpv59e6对应碱基位置在55-537，hpv59e7对应碱基位置在542-865；hpv68，genbank中名字为dq080079.1，hpv68e6对应碱基位置在1-477，hpv68e7对应碱基位置在484-816。

阳性质控品由hpv16及hpv18的阳性参考品组成。

4.高危型hpv引物和探针检测hpv的灵敏度分析

以阳性参考品作为模板，利用qrt-pcr及本试剂盒验证hpv的上、下游引物及分子信标探针检测靶标序列的可行性、灵敏度及精密度。

例如：hpv18上、下游引物及分子信标探针检测灵敏度分析

本试剂盒由qrt-pcr预混液；13种高危型hpv及内参β-actin上、下游引物及探针组；强阳性质控品及弱阳性质控品和阴性对照品组成。

该试剂盒可以由hpv16引物探针组、hpv18引物探针组、β-actin引物探针组及零到十一种其他高危型hpv(hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68)根据需要随机组合。

试剂盒的具体配比如下：qrt-pcr预混液1.6ml；所述13种高危型hpv及内参β-actin上、下游引物及探针组中每一hpv亚型及内参β-actin的上、下游引物均为10μμ，150μl，分子信标探针均为10μμ，160μl；所述强阳性质控品500μl；所述弱阳性质控品500μl；所述阴性对照品500μl。

其中阳性质控品是经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的高危型hpv16及hpv18e6/e7基因dna片段的质粒，其中强阳性质控品的浓度为1×10⁷copies/μl，弱阳性质控品的浓度为1×10³copies/μl，阴性对照品为depc处理的水。

4.1不同梯度阳性质控品的获得

取20μlhpv18阳性质控品加入180μldepc处理的水，依次进行梯度稀释，获得不同梯度的阳性质控品。分别为7×10⁸copies/μ、7×10⁷copies/μ、7×10⁶copies/μ、7×10⁵copies/μ、7×10⁴copies/μ、7×10³copies/μ、7×10²copies/μ、7×10¹copies/μ。

4.2利用qrt-pcr验证上、下游引物及分子信标检测阳性参考品的可行性及灵敏度

qrt-pcr反应体系如表1：

表1

其中qrt-pcr预混液由100-300nm的dntp、1-10mm的mg²⁺、0.04-0.3u/μl的taqdna聚合酶、0.01-0.05u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。

hpv18上游引物序列如下：gatccaacacggcgacc

hpv18下游引物序列如下：acacaggttatttctatgtcttgc

hpv18分子信标探针序列如下：vic-cgccaagctacctgatctgtgcacggaactgaactggcg-bhq1

以上分子信标两端修饰的写法表示在分子信标的5’端修饰vic，3’端修饰bhq1。下文分子信标的写法均参考该写法，不再详细说明。

上、下引物及分子信标探针由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

qrt-pcr反应条件如表2：

表2

由图1可知，本发明的检测方法最低可以检测到7copies/μlhpv18，且当hpv18阳性质控品在7×10⁸copies/μl到7×10¹copies/μl范围内呈现较好的线性关系。

例如：hpv31上、下游引物及分子信标探针检测灵敏度分析

4.3不同梯度阳性质控品的获得

取20μlhpv31阳性质控品加入180μldepc处理的水，依次进行梯度稀释，获得不同梯度的阳性质控品。依次为2×10⁹copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10³copies/μl、2×10²copies/μl。

4.4利用qrt-pcr验证上、下游引物及分子信标检测阳性质控品的可行性及灵敏度

qrt-pcr反应体系如表3：

表3

其中qrt-pcr预混液由100-300nm的dntp、1-10mm的mg²⁺、0.04-0.3u/μl的taqdna聚合酶、0.01-0.05u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。

hpv31上游引物序列如下：ggtgtataacgtgtcaaagaccg

hpv31下游引物序列如下：acttgggtttcagtacgaggtc

hpv31分子信标探针序列如下：texasred-cgcgataggaggaaggtggacaggacgtttcgcg-dabycle

上、下引物及分子信标探针由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

qrt-pcr反应条件如表4：

表4

由图2可知，本发明的检测方法最低可以检测到2×10²copies/μlhpv31，且当hpv31阳性质控品在2×10⁹copies/μl到2×10²copies/μl范围内呈现较好的线性关系。

5.hela细胞中hpv18e6/e7基因检测

因hela细胞是hpv18基因整合的阳性细胞株，为了验证我们设计的引物及探针的可行性，我们对hela细胞中的hpv18dna进行了检测。具体检测步骤及结果如下：

5.1hela细胞培养

hela细胞培养在含10％胎牛血清的dmem培养液(含青霉素100ku/l，链霉素100μg/ml)，37℃、5％浓度二氧化碳、饱和湿度环境的条件下连续培养。

5.2hela细胞中总dna提取

hela细胞中dna提取采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(dp304)进行提取，具体操作参见其说明书。

5.3hela细胞中hpv18基因检测。

qrt-pcr反应体系如表5：

表5

其中qrt-pcr预混液由100-300nm的dntp、1-10mm的mg²⁺、0.04-0.3u/μl的taqdna聚合酶、0.01-0.05u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。

hpv16上游引物序列如下：tgagcaattaaatgacagc

hpv16下游引物序列如下：ctagtgtgcccattaacaggtc

hpv16分子信标探针如下：fam-cgccagcagaaccggacagagcccattacaatatggcg-bhq1

hpv18上游引物序列如下：gatccaacacggcgacc

hpv18下游引物序列如下：acacaggttatttctatgtcttgc

hpv18分子信标探针如下：vic-cgccaagctacctgatctgtgcacggaactgaactggcg-bhq1

hpv31上游引物序列如下：ggaagaaaacgatgaaatagatg

hpv31下游引物序列如下：acacttacaacacatacacaac

hpv31分子信标探针如下：texasred-cgcgacaacatttaccagcccgacgagcctcgcg-dabycle

hpv33上游引物序列如下：tgaaccaactgacctatactgc

hpv33下游引物序列如下：ggacacaagccaacgttaaag

hpv33分子信标探针如下：cy5-cgcgtagatgaggatgaaggcttggaccggacgcg-bhq3

hpv35上游引物序列如下：acagcggagtgaggtatatg

hpv35下游引物序列如下：gcattgtttttctaacgtttctc

hpv35分子信标探针如下：fam-cgcgaagagaaggccagccatatggatcgcg-bhq1

hpv39上游引物序列如下：acagccggttgaccttg

hpv39下游引物序列如下：cgtctggctagtagttgatg

hpv39分子信标探针如下：vic-cgcgatagatgaacccgaccatgcagttcgcg-bhq1

hpv45上游引物序列如下：taataaggtgcctgcggtgc

hpv45下游引物序列如下：ctcggtactgcccagctatg

hpv45分子信标探针如下：fam-cgcgaaccattgaacccagcagaaaaacgtagacatcgcg-bhq1

hpv51上游引物序列如下：tggtggacgaaaaaaaaaggttc

hpv51下游引物序列如下：gttgtcgtgtacgttgccag

hpv51分子信标探针如下：vic-cgcgaaatagcgggacgttggacggggtcgcg-bhq1

hpv52上游引物序列如下：tgtcaaactccattatgtcctg

hpv52下游引物序列如下：ggggtctccaacactctgaac

hpv52分子信标探针如下：fam-cgcgataatattatgggtcgttggacagggctcgcg-bhq1

hpv56上游引物序列如下：aggatgaagtagaccatttgc

hpv56下游引物序列如下：gtcctctttggtactctgaatg

hpv56分子信标探针如下：vic-cgcgagagtgtaagtttgtggtgcagttggtcgcg-bhq1

hpv58上游引物序列如下：ggagacacattagaacaaacac

hpv58下游引物序列如下：tacacttgtgtttgtctacgtc

hpv58分子信标探针如下：fam-cgcgagctgtgcagtgtgttggagatcgcg-bhq1

hpv59上游引物序列如下：ttcctctgcatgatattcgc

hpv59上游引物序列如下：gtttctccatacacggaatctc

hpv59分子信标探针如下：vic-cgccaaggggaactgcaagaaagagaggtggcg-bhq1

hpv68上游引物序列如下：caattaggagattcagacgatg

hpv68上游引物序列如下：gttacacttacaacacagacac

hpv68分子信标探针如下：fam-cgcgaccgaccatgcagttaatcaccacctcgcg-bhq1

qrt-pcr反应条件如表6：

表6

由图3可知，本试剂盒可以检测hela细胞中hpv18的dna且具有较好的特异性。

6精密度分析

按照上述hpv18的qrt-pcr反应体系及反应条件，取hpv18的阳性质控品，重复检测六次。由图4可知本发明专利具有较好的精密度。

7临床样本分析

7.1临床样本中dna提取

临床宫颈脱落细胞dna提取采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(dp304)进行提取，具体操作参见其说明书。

7.2qrt-pcr

qrt-pcr反应体系如表7：

表7

其中qrt-pcr预混液由100-300nm的dntp、1-10mm的mg²⁺、0.04-0.3u/μl的taqdna聚合酶、0.01-0.05u/μl的ung酶、20mmph8.3的tris-hcl及100mm的kcl组成。

hpv16上游引物序列如下：tgagcaattaaatgacagc

hpv16下游引物序列如下：ctagtgtgcccattaacaggtc

hpv16分子信标探针如下：fam-cgccagcagaaccggacagagcccattacaatatggcg-bhq1

hpv18上游引物序列如下：gatccaacacggcgacc

hpv18下游引物序列如下：acacaggttatttctatgtcttgc

hpv18分子信标探针如下：vic-cgccaagctacctgatctgtgcacggaactgaactggcg-bhq1

hpv31上游引物序列如下：ggaagaaaacgatgaaatagatg

hpv31下游引物序列如下：acacttacaacacatacacaac

hpv31分子信标探针如下：texasred-cgcgacaacatttaccagcccgacgagcctcgcg-dabycle

hpv33上游引物序列如下：tgaaccaactgacctatactgc

hpv33下游引物序列如下：ggacacaagccaacgttaaag

hpv33分子信标探针如下：cy5-cgcgtagatgaggatgaaggcttggaccggacgcg-bhq3

hpv35上游引物序列如下：acagcggagtgaggtatatg

hpv35下游引物序列如下：gcattgtttttctaacgtttctc

hpv35分子信标探针如下：fam-cgcgaagagaaggccagccatatggatcgcg-bhq1

hpv39上游引物序列如下：acagccggttgaccttg

hpv39下游引物序列如下：cgtctggctagtagttgatg

hpv39分子信标探针如下：vic-cgcgatagatgaacccgaccatgcagttcgcg-bhq1

hpv45上游引物序列如下：taataaggtgcctgcggtgc

hpv45下游引物序列如下：ctcggtactgcccagctatg

hpv45分子信标探针如下：fam-cgcgaaccattgaacccagcagaaaaacgtagacatcgcg-bhq1

hpv51上游引物序列如下：tggtggacgaaaaaaaaaggttc

hpv51下游引物序列如下：gttgtcgtgtacgttgccag

hpv51分子信标探针如下：vic-cgcgaaatagcgggacgttggacggggtcgcg-bhq1

hpv52上游引物序列如下：tgtcaaactccattatgtcctg

hpv52下游引物序列如下：ggggtctccaacactctgaac

hpv52分子信标探针如下：fam-cgcgataatattatgggtcgttggacagggctcgcg-bhq1

hpv56上游引物序列如下：aggatgaagtagaccatttgc

hpv56下游引物序列如下：gtcctctttggtactctgaatg

hpv56分子信标探针如下：vic-cgcgagagtgtaagtttgtggtgcagttggtcgcg-bhq1

hpv58上游引物序列如下：ggagacacattagaacaaacac

hpv58下游引物序列如下：tacacttgtgtttgtctacgtc

hpv58分子信标探针如下：fam-cgcgagctgtgcagtgtgttggagatcgcg-bhq1

hpv59上游引物序列如下：ttcctctgcatgatattcgc

hpv59上游引物序列如下：gtttctccatacacggaatctc

hpv59分子信标探针如下：vic-cgccaaggggaactgcaagaaagagaggtggcg-bhq1

hpv68上游引物序列如下：caattaggagattcagacgatg

hpv68下游引物序列如下：gttacacttacaacacagacac

hpv68分子信标探针如下：fam-cgcgaccgaccatgcagttaatcaccacctcgcg-bhq1

β-actin上游引物序列如下：cgtcttcccctccatcgtg

β-actin下游引物序列如下：agttggtgacgatgccgtg

β-actin分子信标探针如下：fam-cgcgagatggtgggcatgggtcagaaggtcgcg-bhq1

qrt-pcr反应条件如表8：

表8

检测结果如表9:

表9表明本实施例的检测结果与广东凯普生物科技股份有限公司的检测结果一致，说明本发明方法的可行性。结合本发明的灵敏度分析及临床检测结果，本试剂盒的结果判读方法如下：

1.如果内参基因无扩增产物则认为该实验无效。

2.内参基因有扩增，靶标序列的循环值在30个循环以内且有良好的扩增曲线，则认为扩增有效。

3.内参基因有扩增，靶标序列的循环值在30-35个循环且有良好的扩增曲线，需重复试验，如果结果和上面试验结果一致，则认为扩增有效。如果无扩增，则认为扩增结果无效，不存在靶标序列。

表9

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110>中国药科大学

<120>用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因e6/e7dna分型的引物和探针及试剂盒

<130>2017

<160>121

<210>seqidno:1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgagcaattaaatgacagc

<210>seqidno:2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctagtgtgcccattaacaggtc

<210>seqidno:3

<211>28

<213>人工序列

<400>3

cgccagcagaaccggacagagcccattacaatatggcg

<210>seqidno:4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcaccaaaagagaactgc

<210>seqidno:5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cataaatcccgaaaagcaaag

<210>seqidno:6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cgcgatttcaggacccacaggagcgtcgcg

<210>seqidno:7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

agaggaggaggatgaaatagatgg

<210>seqidno:8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gcacaaccgaagcgtagag

<210>seqidno:9

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cgcgatggacaagcagaaccggacagagctcgcg

<210>seqidno:10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

aagcgactcagaggaagaaaacg

<210>seqidno:11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

aggtcgtctgctgagctttc

<210>seqidno:12

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cgcgaggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagcctcgcg

<210>seqidno:13

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gatccaacacggcgacc

<210>seqidno:14

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

acacaggttatttctatgtcttgc

<210>seqidno:15

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cgccaagctacctgatctgtgcacggaactgaactggcg

<210>seqidno:16

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ggaagaaaacgatgaaatagatg

<210>seqidno:17

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

acacttacaacacatacacaac

<210>seqidno:18

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

cgcgacaacatttaccagcccgacgagcctcgcg

<210>seqidno:19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

attgtgtctactgcaaaggtc

<210>seqidno:20

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ttttctaatgttgttccatacacac

<210>seqidno:21

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

cgcgatagggacgacacaccacacggtcgcg

<210>seqidno:22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

ggtgtataacgtgtcaaagaccg

<210>seqidno:23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

acttgggtttcagtacgaggtc

<210>seqidno:24

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

cgcgataggaggaaggtggacaggacgtttcgcg

<210>seqidno:25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gagcaattacccgacagctc

<210>seqidno:26

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

gtagacttacactgacaacaaaag

<210>seqidno:27

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

cgcgatggacaagcagaaccggacacattcgcg

<210>seqidno:28

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

tgaaccaactgacctatactgc

<210>seqidno:29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

gctggttgtgcttgtccatc

<210>seqidno:30

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

cgcgtagatgaggatgaaggcttggaccggacgcg

<210>seqidno:31

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

cgacatgtggatttaaacaaacg

<210>seqidno:32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

tctacgtcgggacctccaac

<210>seqidno:33

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

cgcgaatttcgggtcgttgggcagggtcgcg

<210>seqidno:34

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

ggacacaagccaacgttaaagg

<210>seqidno:35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

gctggttgtgcttgtccatc

<210>seqidno:36

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

cgcgatcagatgaggatgaaggcttggaccgtcgcg

<210>seqidno:37

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

ttggaacccgaggcaactg

<210>seqidno:38

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

gcctcacatttacaacaggacg

<210>seqidno:39

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

cgcgaaggaagatactattgacggtccagctggtcgcg

<210>seqidno:40

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>40

acagcggagtgaggtatatg

<210>seqidno:41

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

gcattgtttttctaacgtttctc

<210>seqidno:42

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

cgcgaagagaaggccagccatatggatcgcg

<210>seqidno:43

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>43

cctatactgttatgagcaattgtg

<210>seqidno:44

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>44

cgcctcacatttacaacag

<210>seqidno:45

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

cgcgacagctcagaggaggaggaagattcgcg

<210>seqidno:46

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>46

acagccggttgaccttg

<210>seqidno:47

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

cgtctggctagtagttgatg

<210>seqidno:48

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

cgcgatagatgaacccgaccatgcagttcgcg

<210>seqidno:49

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

ctcggactcggtgtatgcaac

<210>seqidno:50

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

ttttgtggtccagcaccgt

<210>seqidno:51

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

cgggtgtgttgtctgaaaccgctgtgtccaacccg

<210>seqidno:52

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>52

aacccgaccatgcagttaatc

<210>seqidno:53

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

gtcgcagagtatcccgtg

<210>seqidno:54

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

cgcgagaaccacagcgtcacacaatacatcgcg

<210>seqidno:55

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

aagtgtgacggcagaattg

<210>seqidno:56

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

ttagttgcacaccacggac

<210>seqidno:57

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>57

cgcgaacagtagagagctcggcagatcgcg

<210>seqidno:58

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>58

agccgaaccacagcg

<210>seqidno:59

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

gttagttgcacaccacg

<210>seqidno:60

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

cgcgatgtgtgtatgttgtaagtgtgacggctcgcg

<210>seqidno:61

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

taataaggtgcctgcggtgc

<210>seqidno:62

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

ctcggtactgcccagctatg

<210>seqidno:63

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

cgcgaaccattgaacccagcagaaaaacgtagacatcgcg

<210>seqidno:64

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>64

gcaatttgacagctcagaggag

<210>seqidno:65

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

cacttgaacacctgcaacacg

<210>seqidno:66

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

cgcgtagaaagacgggctggacaggctaacgcg

<210>seqidno:67

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>67

tggtggacgaaaaaaaaaggttc

<210>seqidno:68

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>68

gttgtcgtgtacgttgccag

<210>seqidno:69

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>69

cgcgaaatagcgggacgttggacggggtcgcg

<210>seqidno:70

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>70

gacttgcaatgctacgag

<210>seqidno:71

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>71

tgtccagcccgtctttc

<210>seqidno:72

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>72

cgcgaagaggaggaggatgaagtagataatatgcgtcgcg

<210>seqidno:73

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>73

tccagcaacacgacccc

<210>seqidno:74

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>74

atacctctcttcgttgtagctc

<210>seqidno:75

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>75

cgcgttgtgtgaggtgctggaagaatcggacgcg

<210>seqidno:76

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>76

tgtcaaactccattatgtcctg

<210>seqidno:77

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>77

ggggtctccaacactctgaac

<210>seqidno:78

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>78

cgcgataatattatgggtcgttggacagggctcgcg

<210>seqidno:79

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>79

atctgcaacctgaaacaactg

<210>seqidno:80

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>80

tggcttgttctgcttgtcc

<210>seqidno:81

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>81

cgcgaatgaggaggatacagatggtgtggatcgcg

<210>seqidno:82

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>82

aggatgaagtagaccatttgc

<210>seqidno:83

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>83

gtcctctttggtactctgaatg

<210>seqidno:84

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>84

cgcgagagtgtaagtttgtggtgcagttggtcgcg

<210>seqidno:85

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>85

attgcattgtgacagaaaaagacg

<210>seqidno:86

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>86

gtagattctctaggttctctagatgt

<210>seqidno:87

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>87

cgcgagggtcatgtttggggtgctggagatcgcg

<210>seqidno:88

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>88

aattgacctacagtgcaatgag

<210>seqidno:89

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>89

gtttagcttgtctagcttgctg

<210>seqidno:90

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>90

cgcgagaggatgaagtagaccatttgcaggatcgcg

<210>seqidno:91

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>91

ggagacacattagaacaaacac

<210>seqidno:92

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>92

tacacttgtgtttgtctacgtc

<210>seqidno:93

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>93

cgcgagctgtgcagtgtgttggagatcgcg

<210>seqidno:94

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>94

gagaggaaacaacccaacgc

<210>seqidno:95

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>95

cgtccaagcctatttcatcctc

<210>seqidno:96

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>96

cgcgaatttacatcctgaaccaactgacctattctgctatcgcg

<210>seqidno:97

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>97

tcgctatatggagacacattag

<210>seqidno:98

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>98

tacacttgtgtttgtctacgtc

<210>seqidno:99

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>99

cgcgaaggtttcataatatttcgggtcgttggatcgcg

<210>seqidno:100

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>100

tcctctgcatgatattcgcatc

<210>seqidno:101

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>101

ttcagacacgctgcatacg

<210>seqidno:102

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>102

ccgcgaggggaactgcaagaaagagaggtatttgaatcgcgg

<210>seqidno:103

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>103

ttcctctgcatgatattcgc

<210>seqidno:104

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>104

gtttctccatacacggaatctc

<210>seqidno:105

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>105

cgccaaggggaactgcaagaaagagaggtggcg

<210>seqidno:106

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>106

agatgcctaaaacctctatgtc

<210>seqidno:107

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>107

ttacaccagtgtttcactacg

<210>seqidno:108

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>108

cgccagagcaagacacctaagacagcaacgatggcg

<210>seqidno:109

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>109

aggacattggacactacattg

<210>seqidno:110

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>110

ttaatacatgattggcatgcag

<210>seqidno:111

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>111

cgcgaaactacaacggacagaggtatatgaatttgcctcgcg

<210>seqidno:112

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>112

caattaggagattcagacgatg

<210>seqidno:113

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>113

gttacacttacaacacagacac

<210>seqidno:114

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>114

cgcgaccgaccatgcagttaatcaccacctcgcg

<210>seqidno:115

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>115

caggacattggacactacattgc

<210>seqidno:116

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>116

ccccgtctctatacactacacatag

<210>seqidno:117

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>117

cgccctagaaggcaactacaacggacagaggagggcg

<210>seqidno:118

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>118

cgtcttcccctccatcgtg

<210>seqidno:119

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>119

agttggtgacgatgccgtg

<210>seqidno:120

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>120

cgcgagatggtgggcatgggtcagaaggtcgcg

<210>seqidno:121

<211>803

<212>dna

<213>人工序列

<400>121

atggcgcgctttgaggatccaacacggcgaccctacaagctacctgatctgtgcacggaactgaacacttcactgcaagacatagaaataacctgtgtatattgcaagacagtattggaacttacagaggtatttgaatttgcatttaaagatttatttgtggtgtatagagacagtataccgcatgctgcatgccataaatgtatagatttttattctagaattagagaattaagacattattcagactctgtgtatggagacacattggaaaaactaactaacactgggttatacaatttattaataaggtgcctgcggtgccagaaaccgttgaatccagcagaaaaacttagacaccttaatgaaaaacgacgatttcacaacatagctgggcactatagaggccagtgccattcgtgctgcaaccgagcacgacaggaacgactccaacgacgcagagaaacacaagtataatattaagtatgcatggacctaaggcaacattgcaagacattgtattgcatttagagccccaaaatgaaattccggttgaccttctatgtcacgagcaattaagcgactcagaggaagaaaacgatgaaatagatggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccacaacgtcacacaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccagaattgagctagtagtagaaagctcagcagacgaccttcgagcattccagcagctgtttctgaacaccctgtcctttgtgtgtccgtggtgtgcatcccagcagtaa