一种从北葶苈子中提取北葶新碱A化合物的方法及其应用与流程

本发明涉及医药领域，特别是一种从北葶苈子中提取北葶新碱a化合物的方法及其应用。

背景技术：

葶苈子始载于《神农本草经》，列为草部下品，为常用中药材。2015版《中国药典》收录的“葶苈子”有南北之分，其中十字花科植物独行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟种子习称“北葶苈子”，而播娘蒿descurainiasophia(l.)webbexprantl.的干燥成熟种子习称“南葶苈子”。该药味辛、苦，性大寒，归肺与膀胱经，具有宣泄平喘、行水消肿的功效。南葶苈子研究较多，其化学成分主要有黄酮类、硫苷类、异硫氰酸类等，而北葶苈子研究较少。据记载，北葶苈子具有强心作用，其化学成分主要是黄酮类。而从葶苈子的水提物中分离尿苷类衍生物以及研究其应用至今还未见有这方面的相关报道。

植物雌激素是来源于植物，与哺乳动物的类固醇激素—17β-雌二醇有相似结构的多羟基化合物。天然的植物雌激素相比于合成的雌激素，其雌激素样活性要低，但是所引起的乳腺癌、子宫内膜癌等副作用也更少，使用会更安全。因此对含有植物雌激素的研究逐渐成为热点。而从北葶苈子中提取北葶新碱a的雌激素样作用的研究也未见报道。

技术实现要素：

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从北葶苈子中提取北葶新碱a化合物的方法及其应用，可有效挖掘北葶苈子的新作用。

本发明解决的技术方案是，从北葶苈子中提取北葶新碱a化合物的方法：北葶苈子采用清炒法，炒至温度为240℃，炒制5.5min，取炒制(炮制)后的北葶苈子，每次加北葶苈子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液减压浓缩至浸膏状(每1g相当于原药材2～5g)，浓缩的浸膏用北葶苈子2-3倍重量的体积浓度为80％的乙醇醇沉，将上清液离心过滤，浓缩至无醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树脂)，依次用水、体积浓度20％、40％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，得40％乙醇洗脱部位a，40％乙醇洗脱部位a用水离散溶解，离心过滤，浓缩至原体积的28-29分之一，通过toyopearlhw-40柱色谱，用水洗脱，流速6ml/min，用试管(规格10×180mm)接取流份，每管15ml，茴香醛-浓硫酸喷雾检识，合并第25-44管的流份，标为组分b3，组分b3用半制备hplc(高效液相色谱)分离，上ymc-packods-aq色谱柱(规格型号：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm)，流动相为乙腈：水(v/v)＝7:93，流速5ml/min，收集保留时间tr＝10～16min之间的流份标为组分c1，组分c1再用半制备hplc分离纯化，上ymc-packods-aq色谱柱(规格型号：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm)，流动相为甲醇：水(v/v)＝10:90，流速5ml/min，收集保留时间tr＝31.3min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新碱a。

本发明从北葶苈子中提取北葶新碱a化合物具有雌激素样作用，为制备雌激素类药物提供了新的途径。

附图说明

图1为本发明北葶新碱a的¹h-nmr谱(cd3od)。

图2为本发明北葶新碱a的¹³c-nmr谱(incd3od)。

图3为本发明北葶新碱a的dept135谱(incd3od)。

图4为本发明北葶新碱a的¹h-¹hcosy谱。

图5为本发明北葶新碱a的hsqc谱。

图6为本发明北葶新碱a的hmbc谱。

图7为本发明北葶新碱a的noesy谱。

图8为本发明北葶新碱a的hr-esi-ms谱。

图9为本发明北葶新碱a的ir谱。

图10为本发明北葶新碱a的uv谱。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

取北葶苈子10kg，采用清炒法，炒至温度为240℃，炒制5.5min，取炒制后的北葶苈子，每次加北葶苈子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液减压浓缩至浸膏状，浓缩的浸膏用20l体积浓度为80％的乙醇醇沉，将上清液离心过滤，浓缩至无醇味，上dianionhp-20柱，依次用水、体积浓度20％、40％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，得40％乙醇洗脱部位a，40％乙醇洗脱部位a用水离散溶解，离心过滤，浓缩至原体积的28-29分之一，通过toyopearlhw-40柱色谱，用水洗脱，流速6ml/min，用规格10×180mm的试管接取流份，每管15ml，茴香醛-浓硫酸喷雾检识，合并第25-44管的流份，标为组分b3，组分b3用半制备hplc分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aq色谱柱，流动相为乙腈：水＝7:93，流速5ml/min，收集保留时间tr＝10～16min之间的流份标为组分c1，组分c1再用半制备hplc分离纯化，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aq色谱柱，流动相为甲醇：水＝10:90，流速5ml/min，收集保留时间tr＝31.3min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新碱a。

实施例2

取北葶苈子5kg，采用清炒法，炒至温度为240℃，炒制5.5min，取炒制后的北葶苈子，每次加北葶苈子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液减压浓缩至浸膏状，浓缩的浸膏用14l体积浓度为80％的乙醇醇沉，将上清液离心过滤，浓缩至无醇味，上dianionhp-20柱，依次用水、体积浓度20％、40％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，得40％乙醇洗脱部位a，40％乙醇洗脱部位a用水离散溶解，离心过滤，浓缩至原体积的28-29分之一，通过toyopearlhw-40柱色谱，用水洗脱，流速6ml/min，用规格10×180mm的试管接取流份，每管15ml，茴香醛-浓硫酸喷雾检识，合并第25-44管的流份，标为组分b3，组分b3用半制备hplc分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aq色谱柱，流动相为乙腈：水＝7:93，流速5ml/min，收集保留时间tr＝10～16min之间的流份标为组分c1，组分c1再用半制备hplc分离纯化，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aq色谱柱，流动相为甲醇：水＝10:90，流速5ml/min，收集保留时间tr＝31.3min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新碱a。

本发明从北葶苈子水提物中分离得到尿苷类衍生物尿苷-3′-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(uridine-3′-o-β-d-glucopyranoside)，命名为北葶新碱a，是一个新的天然产物，含量较高。且北葶新碱a在体内、体外均有一定的雌激素样作用，且是通过雌激素受体途径发挥作用的。并经试验进行了充分证明，相关试验资料如下：

1仪器与试药

核磁共振用brukeravanceⅲ500核磁共振仪(tms内标)(bruker)，红外光谱用nicoletis10microscopespectrometer(thermoscientific,usa)，高分辨质谱用brukermaxishdmassspectrometer，紫外光谱用shimadzuuv-2401pcapparatus，高效液相色谱用watersalliance系列2695高效液相系统，配备2998型二极管阵列检测器，empower3色谱数据工作站，lc50型高压制备液相色谱仪，uv200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，ymc-packods-aq色谱柱(250×10mm.d.s-5mm,12mm)(ymc有限公司)，其余有n-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，a-1000s型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，n-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，fdu-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，dfz-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，ab204-n万分之一精密分析天平(mettlertoledo)，imark型酶标仪(美国bio-rad)，二氧化碳培养箱(上海stik)，超净工作台(苏净集团)，arium611vf超级组合型超纯水器(sartorius)，倒置显微镜(nikon)，pb-10酸度计(德国赛多利斯集团)。

柱层析填料diaionhp-20、mcigelchp-20(日本三菱化学公司)，toyopearlhw-40(日本tosoh公司)，sephadexlh-20(parmaciabiotech公司)，柱层析所用硅胶h(160-200目)为青岛海洋化工厂生产，培养皿、96孔培养板、细胞冻存管(corning公司)，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。

dmem高糖培养液(gibco)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(gibco)，dmso(solarbio)；mtt(biosharp)，h2o2溶液(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，水为超纯水，pbs缓冲液等为自配。

北葶苈子于2014年采自河南南阳，经河南中医学院陈随清教授及董诚明教授鉴定为十字花科植物独行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟种子。

3结构鉴定

北葶新碱a，无色结晶性粉末(meoh)，分子式为c15h22n2o11[m+na]⁺m/z429.1106(计算值为429.1121)。利用核磁共振波谱对其进行结构鉴定，图谱见附图1-10。其结构式及核磁数据如下：

图1北葶新碱a的结构

表1北葶新碱a的¹hnmr(500mhz)和¹³cnmr(125mhz)数据(incd3od)

4.1小鼠子宫增重实验

将小鼠按体重均衡和随机的原则分组，持续给药7天。正常组每日蒸馏水0.02ml/g灌胃；阳性对照组隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；北葶苈子中提取北葶新碱a按1mg/10g/d，配成混悬液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次给药24h后，摘眼球取血，脱颈椎处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数[子宫湿重×(体重)^-1×100％]。实验平行重复三次。结果与正常组相比，计算p值，考察有无统计学意义。

4.2mcf--7细胞增殖实验

mcf-7细胞经含5％去雌激素胎牛血清的无酚红dmem培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，pbs洗两次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入无酚红dmem培养基吹打均匀，以2×10⁴个/ml的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μl。培养24h待细胞贴壁后，换为含北葶苈子中提取北葶新碱a培养液(10μm)继续培养。37℃、5％co2培养48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150μldmso，震荡5-10min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值(a)，计算平均a值和细胞活力。实验平行重复三次。

细胞活力＝各组od值/正常组od值

4.3ici182,780拮抗实验

mcf-7细胞经含5％去雌激素胎牛血清的无酚红dmem培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，以2×10⁴个·ml^-1的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μl。细胞贴壁后，加药干预，其中拮抗组在给药前2h加雌激素受体阻断剂ici182,780(1μm)。37℃、5％co2培养48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150μldmso，震荡5-10min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值(a)，计算平均a值和细胞活力。实验平行重复三次。

细胞活力＝各组od值/正常组od值

4.4elisa法检测血清e2、lh、fsh

小鼠摘眼球取血，血液室温静置1h后，3000转离心10min，取上清。按照elisa试剂盒说明书仔细操作。

5统计处理

实验数据以表示，用spss20.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析(one-wayanova)进行组间差异的比较，以p<0.05为差异有显著性意义，以p<0.01为差异有极显著性意义。

6实验结果

6.1北葶苈子中提取北葶新碱a对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响

与正常组相比，北葶苈子中提取北葶新碱a能显著诱导性未成熟雌性小鼠子宫系数的增加(p<0.05)。提示北葶苈子中提取北葶新碱a在体内具有雌激素样作用。见表1。

表1北葶苈子中提取北葶新碱a对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响(n＝10)

注:与正常组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

6.2北葶苈子中提取北葶新碱a对mcf--7细胞促增殖作用

北葶苈子中提取北葶新碱a在10μm时与正常组比，对mcf-7细胞有显著的促增殖作用(p<0.05)。提示北葶苈子中提取北葶新碱a在体外具有雌激素样作用。见表2。

表2北葶苈子中提取北葶新碱a对mcf-7细胞增殖的影响(n＝6)

注:与正常组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

6.3ici182,780对北葶苈子北葶新碱a促mcf--7细胞增殖的影响

北葶苈子北葶新碱a能显著促进mcf-7细胞的增殖(p<0.05)；但当与雌激素受体阻断剂ici182,780共同干预时，北葶新碱a的促增殖作用消失，与正常组相比无统计学意义。提示北葶苈子北葶新碱a对mcf-7细胞的促增殖作用是通过雌激素受体介导发挥的，见表3。

表3ici182,780对北葶新碱a促mcf-7细胞增殖的影响(n＝6)

注:与正常组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

6.4北葶苈子中提取北葶新碱a对血清e2、lh、fsh的影响

与正常组相比，北葶苈子中提取北葶新碱a能显著增加小鼠血清e2、fsh的水平，但基本不影响血清lh的水平(p<0.05)。提示北葶苈子中提取北葶新碱a在体内具有雌激素样作用，可能与其增加体内e2以及fsh的水平有关。见表4。

表4北葶苈子中提取北葶新碱a对血清e2、lh、fsh的影响(n＝10)

注:与正常组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

子宫中含有大量的雌激素受体(ers)，雌激素类物质通过与该受体结合，可诱导子宫靶蛋白(ips)含量增加，表现为子宫组织增生等，因此可以通过测定外源雌激素对性未成熟小鼠子宫促增长作用来评价药物的雌激素样活性。本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体重之比(子宫系数)作为评价雌激素样活性的指标。实验结果表明，北葶新碱a可显著增加性未成熟小鼠子宫系数，提示其在体内具有雌激素样作用。

mcf-7细胞是雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株，能特异地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖，是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。实验结果发现，北葶新碱a在浓度为10μm时对mcf-7细胞有显著的促增殖作用。ici182,780是一类新型的纯雌激素受体拮抗剂，可以显著地减弱或抑制由配体与雌激素受体结合所激发的、并受雌激素应答元件(ere)调控的雌激素信号转导途径。当北葶新碱a与ici182,780共同作用时，其对mcf-7细胞的促增殖作用被显著抑制。提示北葶新碱a在体内、体外均有一定的雌激素样作用，且是通过雌激素受体途径发挥作用的。

雌二醇是体内主要由卵巢成熟滤泡分泌的一种天然雌激素，能促进和调节女性性器官及副性征的正常发育。促黄体生成素由垂体产生的一种激素在在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。卵泡刺激素是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，主要作用为促进卵泡成熟，促进整个卵巢长大。研究发现，北葶苈子中北葶新碱a可以显著性增加未成熟雌性小鼠的血清e2以及fsh的水平，但对lh的影响不大。推测北葶苈子中提取北葶新碱a增加小鼠子宫系数发挥雌激素样活性可能与其增加体内e2以及fsh的水平有关。

综上，从北葶苈子的水提物中分离并鉴定的北葶新碱a，实验结果显示北葶新碱a在体内、体外均有一定的雌激素样作用，且是通过雌激素受体途径发挥作用的，可有效用于制备雌激素类药物，开发了北葶苈子的新用途，具有实际的临床意义和良好的应用推广价值。