一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新型表达cry3a杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

榆树是多种天然林的重要组成部分。在我国，许多品种被用作道路观赏、花园装饰、土壤保护而广泛种植。然而，近几十年，许多成年榆树死于虫害。对此，许多森林保护者和研究人员在这一森林病害的防治上做了大量的工作，并开发了许多用于昆虫防治的化学和生物制剂。然而，许多化学杀虫剂，如有机磷农药、有机氯农药，已被证明对环境和人类健康造成伤害。

苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensis(bt)分泌的杀虫晶体蛋白(icps)因其对害虫具有高度专一毒杀作用，且对环境和人畜安全的特性，成为世界上应用最广泛的一类微生物杀虫剂。根据杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性，可将他们划分为17群94亚类，目前已报道的编码cry蛋白的基因达300多个，其中cry1类的表达产物对鳞翅目昆虫有特异毒性，而cry3类的表达产物对鞘翅目昆虫有特异毒性。国内外一般都优先选用cry3aa基因作为抗虫基因转入微生物构建具有抗鞘翅目昆虫杀虫活性的bt工程菌。

公开号为cn105647952a的文献公开了一种新型原核表达载体的构建及生防菌开发应用，方法通过orf对orf的方式替换掉原有载体的gfp蛋白，利用原载体翻译gfp蛋白的启动子来表达目的基因，通过重组构建验证，得到一种兼具杀虫、抑菌功能的生防菌。

技术实现要素：

本发明的目的是通过优化，创新改进现有常规表达载体难表达或不表达外源基因的缺陷，提供一种新型表达cry3a杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用，实现外源基因cry3a杀虫蛋白在野生b.pyrrociniajk-sh007内生菌中的高效表达。

本发明解决所述技术问题的方案是：一种新型表达cry3a杀虫蛋白的植物内生工程菌，该工程菌的dna序列如序列表seqidno：1所示。

一种新型表达cry3a杀虫蛋白的植物内生工程菌的构建方法，包括如下步骤，

(1)cry3aa的人工合成：cry3aa的密码子序列来自于苏云金芽孢杆菌，cry3aa根据大肠杆菌密码子偏好进行优化，通过引物设计，合成dna；

(2)重组质粒构建：将t7rna聚合酶基因利用同源重组的方式连接到phkt2载体上，得到重组质粒phkt2-t7rnapol；在重组质粒phkt2-t7rnapol上构建吡咯伯克霍尔德氏菌b.pyrrocinia-cry3aa表达载体质粒，得到重组质粒phkt2-cry3aa；

(3)cry3aa基因在吡咯伯克霍尔德氏菌b.pyrrociniajk-sh007中的表达：将重组质粒phkt2-cry3aa导入b.pyrrociniajk-sh007感受态细胞,涂布浓度为50ug/ml含甲氧苄啶抗生素的lb抗性平板上，30℃过夜培养；cry3aa的蛋白表达通过将重组菌接于lb培养基，采用30℃，220r/min摇培，待od600＝0.8时,加终浓度为0.1mmol/liptg,并迅速升温到42℃，继续培养4h，然后取工程菌液离心，再将沉淀重悬于pbs缓冲液,利用超声波破碎后离心收集细胞裂解液。

一种新型表达cry3a杀虫蛋白的植物内生工程菌在防治榆蓝叶甲中的应用。

本发明选用了针对鞘翅目害虫的cry3a杀虫蛋白，运用t7超表达系统，通过对cry3a密码子的优化、表达载体的筛选、插入位置的分析、诱导条件浓度等的组合优化，实现了重组工程菌的构建，使具有抑菌功效的植物内生菌吡咯伯克霍尔德氏菌jk-sh007高效表达了cry3a蛋白。通过生测实验，工程菌b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)被证明对榆树甲虫幼虫具有较好的控制效果。本发明建立了以吡咯伯克霍尔德氏菌为宿主的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的表达系统，将有助于开发环保的生物农药，具有相当的生防潜力。

附图说明

序列表seqidno:1是本发明生防菌的dna序列；

图1为phkt2-t7rnapol质粒图谱；

图2为t7rna聚合酶和phkt2线性化载体扩增电泳分析结果，其中，m为λ-ecot14i分子标记，条带1为t7rna聚合酶，条带2为phkt2线性化载体；

图3为phkt2-cry3aa质粒图谱；

图4为t7启动子-cry3aa-t7终止子以及phkt2-t7rna线性化载体的电泳分析结果，其中，m为λ-ecot14i分子标记，条带1位t7启动子-cry3aa-t7终止子，条带2为phkt2-t7rna聚合酶线性化载体；

图5为吡咯伯克霍尔德氏菌jk-sh007重组子dna提取的琼脂糖凝胶电泳图，图中，n为phkt2-t7rna聚合酶质粒dna；

图6为b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)重组子的pcr验证图，图中，n为phkt2-t7rnapol阴性对照，条带1到8为阳性重组子cry3a的pcr验证；

图7为b.pyrrociniajk-sh007表达cry3aa融合蛋白sds-page和蛋白质印迹分析结果，图中，m为蛋白分子标记，条带1为b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-t7rnapol)的全蛋白图谱，条带2为b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)的全蛋白图谱，箭头指的为cry3aa(about70kda)；

图8为b.pyrrociniajk-sh007重组菌液对榆蓝叶甲幼虫的毒杀存活率统计图，取中位浓度0.83g/l湿重的b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)工程菌及b.pyrrociniajk-sh007(阴性对照)(n＝15)。

具体实施方式

实施例1

一种新型表达cry3a杀虫蛋白的植物内生工程菌，该工程菌的dna序列如序列表seqidno：1所示。

上述工程菌的构建方法如下：

(1)cry3aa的人工合成及优化

cry3aa的密码子序列来自于苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensis[genbankid:m84650.1]，加上n末端6×his标签，根据大肠杆菌密码子偏好进行优化，通过dnawork软件进行引物设计，合成dna(https://hpcwebapps.cit.nih.gov/cgi-bin/dnaworks)。cry3aa核苷酸序列利用引物(如表1所示)通过重叠pcr技术拼接而成。

表1用于t7启动子-6×his标签-cry3aa-t7终止子dna合成的引物序列

(2)重组质粒构建

为了实现t7启动子在jk-sh007中对cry3aa基因的表达，首先将t7rna聚合酶基因利用同源重组的方式连接到phkt2载体上，载体骨架片段通过反向的pcr技术从phkt2中扩增而来，引物为phkt2f1/r1(见表2)，t7rna聚合酶[产品编号：p001509]通过引物t7rnapolf/r(见表2)从大肠杆菌bl21(de3)扩增得到，然后将扩增的目的片段和载体按照1:3(100ng载体：300ngdna片段)的比例混合，然后转移到大肠杆菌xl-10gold感受态细胞中，重组质粒通过测序确定为phkt2-t7rnapol，具体如图1～2所示。

吡咯伯克霍尔德氏菌b.pyrrocinia-cry3aa表达载体质粒构建方法同上，利用引物cry3af/r、phkt2f2/r2(见表2)分别扩增目的片段和载体片段，其中pbluescriptsk(+)载体利用反向pcr扩增出t7promoter-6×his-cry3aa-t7teldna结构,重组质粒通过测序鉴定确定为phkt2-cry3aa，具体如图3～4所示。

表2本研究中的引物序列

注：表中标注下滑线的序列分别为phkt2和phkt2-t7rnapol表达载体的同源臂。

(3)cry3aa基因在吡咯伯克霍尔德氏菌b.pyrrociniajk-sh007中的表达

将重组phkt2-cry3aa质粒导入b.pyrrociniajk-sh007感受态细胞，重组菌通过dna提取及pcr验证结果如图5～6所示。然后涂布浓度为50ug/ml含甲氧苄啶抗生素的lb抗性平板上，30℃过夜培养。将新重组菌株命名为b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)。cry3aa的蛋白表达通过将重组菌接于lb培养基，采用30℃，220r/min摇培，待od600＝0.8时,加终浓度为0.1mmol/liptg，并迅速升温到42℃，继续培养4h.能后取工程菌液(6000×g,10min)离心，再将沉淀重悬于pbs(100mmol/l,ph7.8)缓冲液,利用超声波破碎(10℃,120w,15min)，离心收集细胞裂解液进行sds-page分析。

(4)sds-page和蛋白浓度测定

蛋白样品采用4％-12％(w/v)sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离。通过考马斯亮蓝r-250染色检测目标蛋白条带。用bradford蛋白浓度试剂盒测定蛋白质浓度。

(5)蛋白质印迹western-blot

蛋白质样品在4％–12％tris-glycine凝胶分离，然后转移到硝酸纤维素膜，膜浸泡在10毫升tbst(20mmol/ltris-hcl，150mol/lmnacl,0.05％吐温20)和10％(w/v)脱脂奶中，室温1h。westernblot分析采用了一抗(单克隆抗-6×hisigg抗体，1:3000稀释)和二抗羊抗鼠igg-hrp(辣根过氧化物酶标记，1:5000稀释)。采用ecl发光液检测底物；信号经x光压片、洗片记录。

经sds-page和westernblot蛋白免疫鉴定分析，如图7所示，结果清晰显示工程菌phkt2-cry3aa在野生吡咯伯克霍尔德氏菌中成功表达分子量为70kda的蛋白。将此条带割胶，进一步通过基质辅助激光解吸离子飞行质谱进行分析，确定其为cry3aa杀虫蛋白。使用bradford法对蛋白定量，获得约3.05g/l的总蛋白浓度，通过定量计算得到了在诱导蛋白表达中，诱导表达的cry3aa杀虫蛋白约占15.6％。

(6)b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)中cry3aa杀虫蛋白生物活性评价

为检验工程菌jk-sh007(phkt2-cry3aa)毒杀二龄榆蓝叶甲幼虫活性，实验选取了0.21-3.32g/l五个不同梯度湿重的发酵菌液浸泡榆树叶，每个稀释浓度接种15条二龄榆蓝叶甲幼虫，实验做三个重复，死亡率采用每隔8h记录一次，直到96h调查死亡结果。结果如图8所示：b.pyrrociniajk-sh007重组菌对榆蓝叶甲幼虫致死效果明显，尤其当浓度为3.32g/l时，b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)工程菌对榆蓝叶甲幼虫致死率高达88.89％。通过计算得出，b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)的致死中浓度lc50为0.63(0.48-0.82)g/l。

sequencelisting

<110>湖州师范学院

<120>一种新型表达cry3a杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用

<130>2017

<160>63

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>11060

<212>dna

<213>bacillusthuringiensis

<400>1

ctcgggccgtctcttgggcttgatcggccttcttgcgcatctcacgcgctcctgcggcgg60

cctgtagggcaggctcatacccctgccgaaccgcttttgtcagccggtcggccacggctt120

ccggcgtctcaacgcgctttgagattcccagcttttcggccaatccctgcggtgcatagg180

cgcgtggctcgaccgcttgcgggctgatggtgacgtggcccactggtggccgctccaggg240

cctcgtagaacgcctgaatgcgcgtgtgacgtgccttgctgccctcgatgccccgttgca300

gccctagatcggccacagcggccgcaaacgtggtctggtcgcgggtcatctgcgctttgt360

tgccgatgaactccttggccgacagcctgccgtcctgcgtcagcggcaccacgaacgcgg420

tcatgtgcgggctggtttcgtcacggtggatgctggccgtcacgatgcgatccgccccgt480

acttgtccgccagccacttgtgcgccttctcgaagaacgccgcctgctgttcttggctgg540

ccgacttccaccattccgggctggccgtcatgacgtactcgaccgccaacacagcgtcct600

tgcgccgcttctctggcagcaactcgcgcagtcggcccatcgcttcatcggtgctgctgg660

ccgcccagtgctcgttctctggcgtcctgctggcgtcagcgttgggcgtctcgcgctcgc720

ggtaggcgtgcttgagactggccgccacgttgcccattttcgccagcttcttgcatcgca780

tgatcgcgtatgccgccatgcctgcccctcccttttggtgtccaaccggctcgacggggg840

cagcgcaaggcggtgcctccggcgggccactcaatgcttgagtatactcactagactttg900

cttcgcaaagtcgtgaccgcctacggcggctgcggcgccctacgggcttgctctccgggc960

ttcgccctgcgcggtcgctgcgctcccttgccagcccgtggatatgtggacgatggccgc1020

gagcggccaccggctggctcgcttcgctcggcccgtggacaaccctgctggacaagctga1080

tggacaggctgcgcctgcccacgagcttgaccacagggattgcccaccggctacccagcc1140

ttcgaccacatacccaccggctccaactgcgcggcctgcggccttgccccatcaattttt1200

ttaattttctctggggaaaagcctccggcctgcggcctgcgcgcttcgcttgccggttgg1260

acaccaagtggaaggcgggtcaaggctcgcgcagcgaccgcgcagcggcttggccttgac1320

gcgcctggaacgacccaagcctatgcgagtgggggcagtcgaaggcgaagcccgcccgcc1380

tgccccccgagcctcacggcggcgagtgcgggggttccaagggggcagcgccaccttggg1440

caaggccgaaggccgcgcagtcgatcaacaagccccggaggggccactttttgccggagg1500

gggagccgcgccgaaggcgtgggggaaccccgcaggggtgcccttctttgggcaccaaag1560

aactagatatagggcgaaatgcgaaagacttaaaaatcaacaacttaaaaaaggggggta1620

cgcaacagctcattgcggcaccccccgcaatagctcattgcgtaggttaaagaaaatctg1680

taattgactgccacttttacgcaacgcataattgttgtcgcgctgccgaaaagttgcagc1740

tgattgcgcatggtgccgcaaccgtgcggcaccctaccgcatggagataagcatggccac1800

gcagtccagagaaatcggcattcaagccaagaacaagcccggtcactgggtgcaaacgga1860

acgcaaagcgcatgaggcgtgggccgggcttattgcgaggaaacccacggcggcaatgct1920

gctgcatcacctcgtggcgcagatgggccaccagaacgccgtggtggtcagccagaagac1980

actttccaagctcatcggacgttctttgcggacggtccaatacgcagtcaaggacttggt2040

ggccgagcgctggatctccgtcgtgaagctcaacggccccggcaccgtgtcggcctacgt2100

ggtcaatgaccgcgtggcgtggggccagccccgcgaccagttgcgcctgtcggtgttcag2160

tgccgccgtggtggttgatcacgacgaccaggacgaatcgctgttggggcatggcgacct2220

gcgccgcatcccgaccctgtatccgggcgagcagcaactaccgaccggccccggcgagga2280

gccgcccagccagcccggcattccgggcatggaaccagacctgccagccttgaccgaaac2340

ggaggaatgggaacggcgcgggcagcagcgcctgccgatgcccgatgagccgtgttttct2400

ggacgatggcgagccgttggagccgccgacacgggtcacgctgccgcgccggtagcactt2460

gggttgcgcagcaacccgtaagtgcgctgttccagactatcggctgtagccgcctcgccg2520

ccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcga2580

cctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccgtttttatcaggctctggga2640

ggcagaataaatgatcatatcgtcaattattacctccacggggagagcctgagcaaactg2700

gcctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaa2760

ccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcgaa2820

tttgctttcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaccag2880

gcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgc2940

agtcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaaca3000

aaatattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcg3060

atcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcg3120

attaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtga3180

gcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattggagctccaccgcggtggcggccgctc3240

tagaactagtggatcccccgggctgcagttaattaaccaggcatcaaataaaacgaaagg3300

ctcagtcgaaagactgggcctttcgttttataagcttaggtgagaacatccctgcctgaa3360

catgagaaaaaacagggtactcatactcacttctaagtgacggctgcatactaaccgctt3420

catacatctcgtagatttctctggcgattgaagggctaaattcttcaacgctaactttga3480

gaatttttgtaagcaatgcggcgttataagcatttaatgcattgatgccattaaataaag3540

caccaacgcctgactgccccatccccatcttgtctgcgacagattcctgggataagccaa3600

gttcatttttctttttttcataaattgctttaaggcgacgtgcgtcctcaagctgctctt3660

gtgttaatggtttcttttttgtgctcatacgttaaatctatcaccgcaagggataaatat3720

ctaacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgcatgtactaag3780

gaggttgtatggaacaacgcataaccctgaaagattatgcaatgcgctttgggcaaacca3840

agacagctaaagatcaagaatgttgatcttcagtgtttcgcctgtctgttttgcaccgga3900

atttttgagttctgccccccggggatctctcacctaccaaacaatgcccccctgcaaaaa3960

ataaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggt4020

gatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgacgctcttaaaaatta4080

agccctgaagaagggcagcattcaaagcagaaggctttggggtgtgtgatacgaaacgaa4140

gcattggcgcctcgagtaatttaccaacactactacgttttaactgaaacaaactggaga4200

ctcataatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgct4260

atcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcc4320

cttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaa4380

cttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactc4440

cctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaag4500

cgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcacc4560

attaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagca4620

agcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaa4680

gctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctac4740

aagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggc4800

gaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgag4860

atgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggt4920

caagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgca4980

ggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtgg5040

actggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgt5100

actcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaa5160

gcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgcc5220

aacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaa5280

gaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaa5340

cgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagcctt5400

gagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttac5460

aacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgat5520

atgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactac5580

tggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctgagcgc5640

atcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggag5700

aacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtac5760

gctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacggg5820

tcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcg5880

gttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtc5940

aacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgacc6000

gatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggt6060

caatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggct6120

tacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagct6180

attgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggct6240

aagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactgg6300

cttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagatt6360

cttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaa6420

tacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacag6480

cctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatc6540

gctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggca6600

cacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccg6660

gctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtct6720

tgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattg6780

gacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcg6840

gacttcgcgttcgcgtaagaattcttaattaagagcttatcgataccgtcgacctcgagg6900

gggggcccggtacccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaa6960

tcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacata7020

cgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacatta7080

attgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaa7140

tgaatcggccaacgcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcg7200

gataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggg7260

cagcagccatcatcaccaccatcatagcagcgggctggtacctcggggttcgcacatggc7320

gagcatgaccggtggccagcaaatgggacgcggaagtatgaccgcggataacaataccga7380

agcgctggattcctcaaccacgaaagatgttattcaaaaaggcatttcagtggtgggcga7440

tctgcttggcgtcgtcgggtttccttttggcggtgctttggtgtcgttttacaccaattt7500

ccttaataccatctggccgagcgaagatccgtggaaggcgtttatggagcaggtggaggc7560

ccttatggatcagaaaatcgccgattatgccaagaataaggctctggcggaactgcaagg7620

tctgcaaaataacgtcgaggattacgtgagcgcactgtcgagttggcagaaaaacccagc7680

cgctcctttccgcaacccgcacagccaggggcgtattcgtgaactgttcagccaagccga7740

aagccactttcgtaatagcatgccgtcgtttgcgattagcggttatgaagtcctgttcct7800

gaccacctatgcgcaggccgcaaatacccatcttttcctgcttaaggacgcccagatcta7860

tggtgaagaatggggctatgaaaaagaggatatcgcggaattttacaagcgtcaattaaa7920

gcttacccaggaatataccgaccattgcgtgaaatggtataacgttggcctggataagtt7980

acgtggcagctcctacgaatcttgggtgaatttcaatcgttaccgtcgggagatgacctt8040

aaccgtgctggatctgattgcgctgtttcccctgtatgatgtccgtctgtatccgaagga8100

agtgaaaaccgaactgacccgtgatgtgctgaccgatccgattgttggcgtgaacaacct8160

gcgcggctacggaaccacctttagtaatatagaaaactatattcgtaaaccgcatctgtt8220

tgattatctgcatcgcattcaatttcatacgcggtttcagcccgggtattacggcaatga8280

ctcgtttaactattggtccggcaattatgtgagcacccgtccgagcattggctctaatga8340

tataatcacaagcccattttatgggaataagagcagcgagccggtgcagaatttagaatt8400

caacggcgaaaaagtatatcgtgctgtcgcgaataccaatcttgcggtgtggccatcggc8460

ggtgtacagcggcgtgaccaaagtggagtttagccagtataatgaccagaccgacgaagc8520

aagcacccaaacctacgatagcaaacgtaacgtgggcgcagtgagctgggactctattga8580

tcagttgccacctgagaccaccgatgaaccgctggaaaaagggtactcacaccagcttaa8640

ctacgttatgtgtttcttaatgcagggttctcgcggcaccatcccggtccttacatggac8700

ccataagtcagttgatttctttaacatgattgacagcaagaagatcacccagctgccgtt8760

ggtcaaagcctataagctgcagagcggagcgagcgtggtggctggaccacgtttcaccgg8820

aggagacataatacagtgtactgaaaatggcagcgcagcgaccatctatgtgaccccgga8880

tgtgtcttatagccagaagtaccgggcacgtattcattacgcgagcacctcccagattac8940

ctttactctgagcctggacggtgcgccgttcaatcaatactactttgataaaaccattaa9000

caaaggcgataccctgacctataactcttttaacctggcatccttctcgactccctttga9060

actgagcggaaataacctgcaaattggcgtaaccggtctgtctgctggcgataaagtgta9120

tatagataaaatcgagttcattcccgtgaattagtgaaagcttgcggccgcactcgagca9180

ccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggc9240

tgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgag9300

gggttttttgctgaaagggcggtttgcgtattgggcgcatgcataaaaactgttgtaatt9360

cattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgcca9420

gcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcga9480

agaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattgg9540

ctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgt9600

aacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcac9660

tccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacac9720

tatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaattcacgaacccagttga9780

cataagcctgttcggttcgtaaactgtaatgcaagtagcgtatgcgctcacgcaactggt9840

ccagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggcgcagtggcggttttcatggcttgtt9900

atgactgtttttttgtacagtctagcctcgggcatccaagctagctaagcgcgttacgcc9960

gtgggtcgatgtttgatgttatggaacagcaacgatgttacgcagcagggtagtcgccct10020

aaaacaaagttaggcagccgttgtgctggtgctttctagtagttgttgtggggtaggcag10080

tcagagttcgatttgcttgtcgccataatagattcacaagaaggattcgacatgggtcaa10140

agtagcgatgaagccaacgctcccgttgcagggcagtttgcgcttcccctgagtgccacc10200

tttggcttaggggatcgcgtacgcaagaaatctggtgccgcttggcagggtcaagtcgtc10260

ggttggtattgcacaaaactcactcctgaaggctatgcggtcgagtccgaatcccaccca10320

ggctcagtgcaaatttatcctgtggctgcacttgaacgtgtggcctaagaattccggatg10380

agcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttattttt10440

ctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattg10500

agcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggt10560

ggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataa10620

ctcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttac10680

gtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagg10740

gacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcgaagac10800

gaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttctt10860

agacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcgcccgcgttcctgctggcgctgggc10920

ctgtttctggcgctggacttcccgctgttccgtcagcagcttttcgcccacggccttgat10980

gatcgcggcggccttggcctgcatatcccgattcaacggccccagggcgtccagaacggg11040

cttcaggcgctcccgaaggt11060

<210>2

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcgga48

<210>3

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattccccta60

<210>4

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatca60

<210>5

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtgcgaaccccgaggtaccagcccgctgctatgatggtggtgatgatggctgctgcccat60

<210>6

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tacctcggggttcgcacatggcgagcatgaccggtggccagcaaatgggacgcggaagta60

<210>7

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ggttgaggaatccagcgcttcggtattgttatccgcggtcatacttccgcgtcccatttg60

<210>8

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gcgctggattcctcaaccacgaaagatgttattcaaaaaggcatttcagtggtgggcgat60

<210>9

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

accaaagcaccgccaaaaggaaacccgacgacgccaagcagatcgcccaccactgaaatg60

<210>10

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

ttttggcggtgctttggtgtcgttttacaccaatttccttaataccatctggccgagcga60

<210>11

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ccataagggcctccacctgctccataaacgccttccacggatcttcgctcggccagatgg60

<210>12

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

aggtggaggcccttatggatcagaaaatcgccgattatgccaagaataaggctctggcgg60

<210>13

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gctcacgtaatcctcgacgttattttgcagaccttgcagttccgccagagccttattctt60

<210>14

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

cgtcgaggattacgtgagcgcactgtcgagttggcagaaaaacccagccgctcctttccg60

<210>15

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cttggctgaacagttcacgaatacgcccctggctgtgcgggttgcggaaaggagcggctg60

<210>16

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

tcgtgaactgttcagccaagccgaaagccactttcgtaatagcatgccgtcgtttgcgat60

<210>17

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ggcctgcgcataggtggtcaggaacaggacttcataaccgctaatcgcaaacgacggcat60

<210>18

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

cacctatgcgcaggccgcaaatacccatcttttcctgcttaaggacgcccagatctatgg60

<210>19

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

aaaattccgcgatatcctctttttcatagccccattcttcaccatagatctgggcgtcct60

<210>20

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

aaaagaggatatcgcggaattttacaagcgtcaattaaagcttacccaggaatataccga60

<210>21

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

aacttatccaggccaacgttataccatttcacgcaatggtcggtatattcctgggtaagc60

<210>22

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

taacgttggcctggataagttacgtggcagctcctacgaatcttgggtgaatttcaatcg60

<210>23

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

cagatccagcacggttaaggtcatctcccgacggtaacgattgaaattcacccaagattc60

<210>24

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

ccttaaccgtgctggatctgattgcgctgtttcccctgtatgatgtccgtctgtatccga60

<210>25

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

cggtcagcacatcacgggtcagttcggttttcacttccttcggatacagacggacatcat60

<210>26

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

ccgtgatgtgctgaccgatccgattgttggcgtgaacaacctgcgcggctacggaaccac60

<210>27

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

caaacagatgcggtttacgaatatagttttctatattactaaaggtggttccgtagccgc60

<210>28

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

ttcgtaaaccgcatctgtttgattatctgcatcgcattcaatttcatacgcggtttcagc60

<210>29

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

cggaccaatagttaaacgagtcattgccgtaatacccgggctgaaaccgcgtatgaaatt60

<210>30

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

gactcgtttaactattggtccggcaattatgtgagcacccgtccgagcattggctctaat60

<210>31

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

cgctgctcttattcccataaaatgggcttgtgattatatcattagagccaatgctcggac60

<210>32

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

attttatgggaataagagcagcgagccggtgcagaatttagaattcaacggcgaaaaagt60

<210>33

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

ggccacaccgcaagattggtattcgcgacagcacgatatactttttcgccgttgaattct60

<210>34

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

aatcttgcggtgtggccatcggcggtgtacagcggcgtgaccaaagtggagtttagccag60

<210>35

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

gtaggtttgggtgcttgcttcgtcggtctggtcattatactggctaaactccactttggt60

<210>36

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

agcaagcacccaaacctacgatagcaaacgtaacgtgggcgcagtgagctgggactctat60

<210>37

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

ttccagcggttcatcggtggtctcaggtggcaactgatcaatagagtcccagctcactgc60

<210>38

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

accgatgaaccgctggaaaaagggtactcacaccagcttaactacgttatgtgtttctta60

<210>39

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>39

taaggaccgggatggtgccgcgagaaccctgcattaagaaacacataacgtagttaagct60

<210>40

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>40

gcaccatcccggtccttacatggacccataagtcagttgatttctttaacatgattgaca60

<210>41

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

gctttgaccaacggcagctgggtgatcttcttgctgtcaatcatgttaaagaaatcaact60

<210>42

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

gctgccgttggtcaaagcctataagctgcagagcggagcgagcgtggtggctggaccacg60

<210>43

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>43

cgctgccattttcagtacactgtattatgtctcctccggtgaaacgtggtccagccacca60

<210>44

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>44

gtgtactgaaaatggcagcgcagcgaccatctatgtgaccccggatgtgtcttatagcca60

<210>45

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

ctgggaggtgctcgcgtaatgaatacgtgcccggtacttctggctataagacacatccgg60

<210>46

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>46

cgcgagcacctcccagattacctttactctgagcctggacggtgcgccgttcaatcaata60

<210>47

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

aggtcagggtatcgcctttgttaatggttttatcaaagtagtattgattgaacggcgcac60

<210>48

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

aaaggcgataccctgacctataactcttttaacctggcatccttctcgactccctttgaa60

<210>49

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

cagaccggttacgccaatttgcaggttatttccgctcagttcaaagggagtcgagaagga60

<210>50

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

aattggcgtaaccggtctgtctgctggcgataaagtgtatatagataaaatcgagttcat60

<210>51

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

tgcggccgcaagctttcactaattcacgggaatgaactcgattttatctatatacacttt60

<210>52

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>52

aagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaa60

<210>53

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

gctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctc60

<210>54

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

ctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggg60

<210>55

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

ctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagag35

<210>56

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

gttttaactgaaacaaactggagactcataatgaacacgattaacatcgctaaga55

<210>57

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>57

ataagctcttaattaagaattctaatgatttacgcgaacgcgaagtccgactct54

<210>58

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>58

gaattcttaattaagagcttatcgatacc29

<210>59

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

tatgagtctccagtttgtttcagttaa27

<210>60

<211>52

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

cgttggccgattcattaatgcagctcgatcccgcgaaattaatacgactcac52

<210>61

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

ccaatacgcaaaccgccctttcagcaaaaaacccctcaagacc43

<210>62

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

ggcggtttgcgtattgg17

<210>63

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

cgttggccgattcattaatgcagct25