一种牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体及制备方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体及制备方法。

背景技术：

到目前为止仅有报道称跨膜附睾蛋白1(transmembraneepididymalprotein1,teddm1)在附睾中表达，研究最多的是人附睾蛋白4(he4)，he4是一种新的肿瘤标志物，其发病率位居三大妇科恶性肿瘤的第三位，研究其生物功能，对于妇科恶性肿瘤的治疗具有重要临床意义。

我们首次研究发现teddm1在牛卵巢中也有表达，我们研究发现teddm1是g蛋白偶联受体，通过在牛卵巢的颗粒细胞中扩增获得teddm1全长cds序列，分析其结构发现具有g蛋白偶联受体的结构，有7个跨膜螺旋结构，3个胞外环，3个胞内环，1个c端，1个n端。为了进一步研究其在牛卵泡发育过程中在信号转导和激素调节过程中发挥的作用，需进行teddm1的表达研究。但目前国内市场并无teddm1的多克隆抗体销售，限制了teddm1的表达研究工作。

技术实现要素：

本发明提供的一种牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体及制备方法，该多克隆抗体能够与teddm1的抗原发生作用，为teddm1的表达研究工作奠定基础。

本发明提供的目的是一种牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体的制备方法，所述多克隆抗体以人工合成多肽为抗原，采用动物免疫方法制备而成；所述人工合成多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。

优选的，上述牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体的制备方法，具体过程如下：

以2.5kg体重的新西兰大白兔为对象，首免每只加入250μg人工合成多肽与250μg弗氏完全佐剂的混合物，颈部皮下多点注射；三周后二次免疫，每只加入250μg人工合成多肽与250μg弗氏完全佐剂的混合物，颈部皮下多点注射；两周后三次免疫，同样加入250μg人工合成多肽与250μg弗氏完全佐剂的混合物，颈部皮下多点注射；第三次免疫后14d，颈动脉采血，制备血清，得到兔多抗血清，所述兔多抗血清即为牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体。

本发明还提供了一种根据上述方法制备的多克隆抗体。

与现有技术相比，本发明提供的一种牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体及制备方法，具有以下有益效果：

我们首次研究发现牛跨膜附睾蛋白1(teddm1)在牛卵巢中也有表达，teddm1是g蛋白偶联受体，通过在牛卵巢的颗粒细胞中扩增获得teddm1全长cds序列，分析其结构发现具有g蛋白偶联受体的结构，有7个跨膜螺旋结构，3个胞外环，3个胞内环，1个c端，1个n端。本发明制备的多克隆抗体能够与牛跨膜附睾蛋白1的抗原发生作用，为牛跨膜附睾蛋白1的表达研究工作奠定基础。

附图说明

图1为teddm1和β-actin蛋白在牛第二大卵泡和最大卵泡颗粒细胞中westernblotting结果图；

其中，odf1泳道均是最大卵泡，odf2泳道均是第二大卵泡；

图2为牛同一卵泡波内第二大卵泡和最大卵泡颗粒细胞中teddm1蛋白表达量定量分析；

其中，odf1是最大卵泡，odf2是第二大卵泡；

图3为teddm1在牛同一卵泡波内的免疫组化定位分析结果(放大400倍)；

其中，图3a、图3b是最大卵泡；图3c、图3d是第二大卵泡；图3中gc为卵泡层；tc为层。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，羊抗兔hrp等试剂均为市售。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。

本发明提供了一种牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体的制备方法，所述多克隆抗体以人工合成多肽为抗原，采用动物免疫方法制备而成；所述人工合成多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述人工合成多肽的核苷酸序列是牛跨膜附睾蛋白1的特异性抗原核苷酸序列进行修饰，即在seqidno.2所示第859-900位序列的第一个核苷酸之前添加“tgc(对应的是半胱氨酸)”后合成的，其抗原位置不在牛跨膜附睾蛋白1的跨膜区序列上。添加半胱氨酸是因为半胱氨酸带有巯基，一方面便于与纯化柱子填料是可以结合；另一方面因为前期免疫兔子制备多克隆抗体时，通过半胱氨酸将人工合成多肽与蛋白载体klh((keyholelimpethemocyanin)偶联，偶联上蛋白载体klh后可以增加免疫原性。

一、该多克隆抗体的制备方法如下：

步骤1，动物免疫

两只2.5kg体重的新西兰大白兔，免疫方法如下:首免每只加入250μg人工合成多肽和与250μg的弗氏完全佐剂的混合物(500μg的剂量)，颈部皮下多点注射；三周后二次免疫，每只加入250μg人工合成多肽与250μg弗氏完全佐剂的混合物(500μg的剂量)，颈部皮下多点注射；两周后三次免疫，同样加入250μg人工合成多肽与250μg弗氏完全佐剂的混合物(500μg的剂量)，颈部皮下多点注射；第三次免疫后14d，颈动脉采血，制备血清，得到兔多抗血清，所述兔多抗血清即为牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体。

其中，弗氏完全佐剂对人工合成多肽起乳化作用。

步骤2，elisa检测(血清抗体滴定检测制备的兔多抗血清)

步骤2.1，抗原名称：人工合成多肽，所述人工合成多肽的核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.1所示；

步骤2.2，包被：用包被缓冲液(coatingbuffer：na2co3和nahco3的缓冲液)将步骤2.1的抗原稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl稀释液，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1×tbst缓冲液以每孔180μl洗1次。

步骤2.3，封闭：每孔加入1％bsa，37℃条件下温育1h。

步骤2.4，抗体稀释：步骤1得到的兔多抗血清以1:200，1:1000，1：5000，1:10000，1:20000，1:60000，1:240000的稀释度稀释，分别得到不同浓度的抗体稀释液。

步骤2.5，加样：抗体稀释液以50μl/孔加样。

步骤2.6，温育：37℃条件下温育1h，用tbst缓冲液以200μl/孔洗涤两遍。

步骤2.7，加酶标二抗：羊抗兔hrp以1:5000稀释，37℃条件下温育45min。

步骤2.8，洗涤：用tbst缓冲液以200μl/孔洗涤三遍。

步骤2.9，显色：以100μl/孔加入tmb显色液5min。

步骤2.10，读数(od)：酶标仪测定od450nm读数，结果如表1所示。

表1抗体elisa检测数据

由表1可知，样品稀释度1:20000时，检测结果为1.207(两组数据的平均值)，说明制备的兔多抗血清中牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体效价高。

步骤3，多克隆抗体纯化

步骤3.1，层析填料：sulfo-link-gel(西宝生物科技(上海)股份有限公司)。

步骤3.2，层析柱制作：裸肽交联填料，半胱氨酸封闭，所述裸肽为a蛋白或者g蛋白。

步骤3.3，柱预处理：50mmpbs，ph7.4，20ml，流速60ml/h。

步骤3.4，血清上样：15ml步骤1制备的多克隆抗体，50mmpbs，ph7.4稀释至20ml，重复上样一次。

步骤3.5，清洗：50mmpbs，ph7.4，30ml，流速60ml/h。

步骤3.6，抗体洗脱：0.1mglycine-hcl，ph3.0，收集洗脱液，得到纯化的多克隆抗体。

步骤3.7，层析柱洗涤：50mmpbs，ph7.4，该pbs中含有0.02g/100ml的硫柳汞钠。

步骤3.8，层析柱贮存：4℃。

步骤3.9，ph值调节：以1m的碳酸氢钠调节ph7.4。

多克隆抗体纯化过程中不添加防腐剂，不加甘油、bsa。

步骤4，elisa检测纯化的多克隆抗体

步骤4.1，抗原包被：抗原(人工合成多肽)以1μg/ml的浓度包被，4℃包被过夜。

步骤4.2，封闭：1％bsa，37℃条件下温育1h。

步骤4.3，纯化的多克隆抗体稀释：以1:200，1:1000，1:5000，1:10000，1:20000，1:60000，1:240000的稀释度稀释，分别得到不同浓度的纯化抗体稀释液。

步骤4.4，加样：纯化抗体稀释液以50μl/孔加样，37℃条件下温育1h。

步骤4.5，洗涤：用tbst缓冲液以200μl/孔洗涤2遍。

步骤4.6，加酶标二抗：羊抗兔hrp以1:5000稀释使用，37℃条件下温育45min。

步骤4.7，洗涤：用tbst缓冲液以200μl/孔洗涤3遍。

步骤4.8，显色：以100μl/孔加入tmb显色液，5min.

步骤4.9，读数(od)：酶标仪测定od450nm读数，结果如表2所示。

表2纯化的多克隆抗体的elisa检测数据

纯化的多克隆抗体需要再经过elisa检测，由表2可知，纯化的多克隆抗体1:5000>0.6，经过检测发现抗体纯化后效价没有达到1:10000>0.6，抗体效价过低还需要浓缩步骤5，如果抗体纯化后效价达到1:10000>0.6则不用浓缩，需要说明的是，以表2中两组数据的平均值作为检测od值，计算效价。

步骤5抗体浓缩

用millipore超滤浓缩管纯化的多克隆抗体，得到抗体浓缩液，然后进行抗体检测。

(1)抗体浓缩液的用量：5ml

(2)使用核酸蛋白测定仪测定iggod280的浓度，得到igg浓度为0.92mg/ml。

(3)elisa方法同步骤4，结果如表3所示。

表3抗体浓缩液的elisa检测数据

结论：elisa检测1:10000>0.6，抗体检测合格，需要说明的是，以表2中两组数据的平均值作为检测od值，计算效价。

二、抗体westernbloting检测

所有试验均设3个重复(3个生物学重复，3个技术重复)。

(1)方法：使用蛋白提取试剂盒(碧云天，中国)提取每组牛卵泡总蛋白(包括最大卵泡odf1和第二大卵泡odf2)。以牛血清蛋白(bsa)作为标准，使用bca方法测定蛋白浓度。蛋白变性，97℃，5min。12％的sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每组蛋白上样量相等(25μg/泳道)，然后转膜(硝酸纤维素nc膜，0.22μm)。脱脂奶粉封闭1.2h。用tbst缓冲液稀释抗体：anti-teddm1(1:500，前述制备的多克隆抗体)，anti-β-actin(1:1000，cwbio，china)，稀释的抗体孵育nc膜，4℃过夜。用加有0.1％tween-20的tbs清洗nc膜后，羊抗兔hrp二抗(1:10000，cwbio，china)室温下孵育2h。清洗nc膜后，用eeclwesternblot试剂盒(cwbio，china)检测并曝光。运用image-proplus6.0(mediacybernetics,usa)软件对每组蛋白的光密度信号进行定量分析，并用β-actin值作为内参。所有试验均设3个重复。

(2)结果：

通过westernbloting测定了牛颗粒层细胞(granulosacells，gcs)中提取的总蛋白中teddm1的表达水平，它的分子量为34kda(图1)。图1为teddm1和β-actin蛋白在牛第二大卵泡和最大卵泡颗粒细胞中westernblotting结果图；其中odf1泳道均是最大卵泡，odf2泳道均是第二大卵泡。图2为同一卵泡波内第二大卵泡和最大卵泡颗粒细胞中teddm1蛋白表达量定量分析；其中，odf1泳道均是最大卵泡，odf2泳道均是第二大卵泡，*表示差异显著，p<0.05，n＝3，误差线代表±s.e.。牛发情周期第一卵泡波中第二大卵泡(thesecondlargestfollicleatonsetofdeviation，odf2)颗粒细胞中teddm1蛋白表达量比最大卵泡(thelargestfollicleatonsetofdeviation，odf1)中的高1.73倍，差异显著(图2)。

说明本发明方法制备而成的多克隆抗体具有良好的效果。

三、抗体的免疫组织化学定位

所有试验均设3个重复(3个生物学重复，3个技术重复)。

(1)方法：将卵泡置于暗盒中，用4％多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋。teddm1的免疫组织化学检测运用之前描述的方法(westernbloting法)完成。用teddm1的多克隆抗体(前述制备的多克隆抗体)检测。设置平行对照，包括pbs或已经用10μg/ml牛teddm14℃过夜预孵育过的兔抗teddm1抗体孵育的切片。每组样品获得的三个连续切片均被验证。

(2)结果：运用免疫组化测定牛teddm1在卵泡内的定位。图3为牛teddm1在同一卵泡波内的免疫组化定位分析结果(放大400倍)；其中，图3a、图3c使用的一抗为pbs；图3b、图3d使用的一抗为teddm1多克隆抗体；图3a、图3b是最大卵泡；图3c、图3d是第二大卵泡；图3中gc为卵泡层；tc为层，标尺20μm。从图3中可以看出teddm1在odf1和odf2的颗粒细胞层和膜细胞层中均有表达(图3b，图3d)。当相邻的切片用pbs做阴性对照孵育时，在gcs中没有检测到显著的免疫反应性(图3a，图3c)。

进一步说明本发明方法制备而成的多克隆抗体具有良好的效果。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120>一种牛跨膜附睾蛋白1的多克隆抗体及制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

cysserglulysaspaspglnalaleuleuserlysserserpro

151015

<210>2

<211>903

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgggaacctttatcggtcacgtgtatccagggttgttcctactcgcatacggactgtat60

cgagcggtagtggtctccaaagctgtgatactcagcgactctttcccggatccttctttg120

cctcccaagaataaggggagatgggccaggctgtggaaaatgtcccacagaggtttgctg180

aagatgctggccggctttggcttgatggcgtatgagatcagctgtgttgagagaggattg240

acgctgatgaacagggacctgccaccaagattcatgtacgccaaacagtggcagcacctc300

accatgttcatcctcctcaccctcaatggctgtatagacatcatgagcaaaaacttgctg360

tcccaacgctgtgtgcccctagagaaagggatcttggtgctgaccttttatgtgctcctg420

ctgctattggtgtcgcatgtccaggactctgtgggggtggagatgcatgttcactctctg480

ctcatcttggtggtgttgctgctgatgctggtgttcaccgccaagctgtgggctcccgac540

acgtttcaactcgctgtgatcgagacctttctgtttcagatgatgggttcctggctggta600

caggcaggcttcattctgtacaaaccagtctctggctacccgtgggaggatgataacatt660

agtgacatcatgtttgttaccaccttcttctgttggcatgtgatgatcaatgctttgtgc720

ctgctgggtatctatggagtgtcttccttttggcatcgttgctaccatcctagctggaag780

ctgacggggtccagagaagctccaggttacatatactccaggagacccctctaccaattg840

ctacaggaagtggagcagtcagagaaagatgaccaggctctgctttcaaagagttcaccc900

tga903

<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgctcagagaaagatgaccaggctctgctttcaaagagttcaccc45