一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其在植物基因编辑中的应用的制作方法

本发明属于crispr/cas9系统的sgrna表达载体设计及应用领域，特别涉及利用酶切插入法构建多个靶位点序列sgrna表达载体，实现植物多基因编辑的方法。

背景技术：

2013年，成簇的规律间隔性短回文重复序列及相关核酸酶cas9被报道可用于基因的编辑。该系统经过几年的发展，迅速成为最火热的基因组编辑技术。对于四倍体的油菜、六倍体的小麦等多倍体作物来说，大多数基因存在多个拷贝，基于传统的正向或反向遗传学来解析其基因功能或进行性状改良具有很大的难度。因此，开发能够同时修饰多个位点的crispr/cas9基因编辑系统对于植物基因功能研究、品种改良等都具有十分重要的意义。

crispr/cas9表达系统进入生物体细胞内转录后，需要独立的靶向sgrna序列与cas9蛋白结合完成目标位点的编辑。目前，常用的crispr/cas9系统将含不同靶位点序列的sgrna表达盒和cas9表达盒整合到双元载体上同时表达，每一个靶位点sgrna表达盒由不同的启动子启动表达，导致针对同一基因多位点或多基因进行编辑的载体构建变得很复杂，在很大程度上限制了crispr/cas9系统同时进行多位点或者多个基因编辑的能力。真核生物中的trna前体(pre-trnas)在真核细胞中可被内源的rnasep和rnasez识别剪切去除5′和3′端的多余序列，且该识别剪切主要针对trna接纳茎，d-loop臂以及tψc-loop臂结构而非特定的trna前体序列。另外，trna所含的内部启动子元件boxaandb可以协助招募rna聚合酶iii复合体，使trna自身序列可以作为转录增强子而提升rna聚合酶poliii型启动子的表达水平。根据trna的上述剪接加工特点，可以将trna与sgrna序列融合，形成一个多顺反子基因，将两个或者更多的sgrna序列串联在同一表达载体上，利用内源trna加工系统生成大量的携带靶向序列的sgrna，引导cas9核酸酶对同一基因的多个位点或多个基因多个位点进行编辑，提高突变效率。另外，鉴于trna及其加工系统在所有生物中是相当保守的，用该系统表达sgrna序列进行靶向序列选择时，摆脱了针对不同的poliii型启动子对于靶向序列第一个碱基应为g碱基或者a碱基的限制，因此，基于该系统的使用，可大大拓宽目标位点序列的可选择范围。因此，基于trna-sgrna序列很快就在水稻、玉米、小麦等单子叶植物中被应用于基因编辑。

早先报道的trna-sgrna表达系统进行目标靶序列的组装是通过goldengate法进行，实现含目标靶序列的多个trna-sgrna表达序列的串联需要设计多条引物，进行多轮pcr才能完成多个靶位点的组装。另外，将目标靶序列连同trna-sgrna序列直接进行化学合成则大大增加了成本。目前，利用trna-sgrna/cas9系统进行多位点基因编辑尚未在双子叶植物中被报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种trna-sgrna表达序列，使针对多个目标靶序列的组装可以通过简单的酶切插入的方式逐步组装到trna-sgrna表达载体中，实现多位点的基因编辑；组装有不同目标靶序列的trna-sgrna表达序列单元重复插入cas9基因表达载体，可同步实现多个靶位点或者多基因的编辑；另外，针对不同性状的编辑需要，可灵活进行不同基因的组合编辑。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种trna-sgrna表达序列，其特征在于：trna序列、typeii内切酶位点、sgrna序列依次排列为独立的转录单元，将4个所述转录单元串联排列，串联排列的4个转录单元中所述typeii内切酶依次分别为bbsi、bsai、bsmbi和bfuai。本发明将特定的typeii内切酶bbsi、bsai、bsmbi和bfuai的酶切位点引入到该trna-sgrna系统中，并通过特定的组合方式构成了一种新的trna-sgrna表达序列及载体，基于该表达序列载体，(1)可利用酶切法插入多个靶向序列，无需采用goldengate法进行多靶位点序列的组装时大量的引物合成和pcr扩增组装；(2)避免了直接化学合成包含多个靶位点序列在内的sgrna表达序列导致成本较高的问题；(3)该新的trna-sgrna表达序列及其载体中，在每一个sgrna序列与cas9蛋白结合的42bp柄状区域序列均延长10bp，同时将该区域序列中的一串胸腺嘧啶(t)第四个胸腺嘧啶碱基替换成胞嘧啶碱基(c)，改造后的sgrna序列有利于基因编辑效率的提高；(4)利用该trna-sgrna序列表达载体与cas9基因共表达，可灵活进行单基因多位点或多目标基因定点敲除的组合，有利于农作物多基因调控性状的改良。

上述trna-sgrna表达序列，其特征在于：序列如seqidno.1所述。

将上述trna-sgrna表达序列的4个串联转录单元的上游连接rna聚合酶iii型启动子，如来自拟南芥的iii型启动子u6-26，u6-29，u6-1或u3-b启动子(或者来自其他植物的类似rna聚合酶iii型启动子)融合，可获得相应的trna-sgrna表达盒。如u6-26：：trna-sgrna表达盒序列信息如seqidno.2所述。

上述序列中的u6-26启动子可分别置换为下述拟南芥的iii型启动子如u6-29，u6-1和u3-b等不同的启动子序列，例如启动子序列依次分别为seqidno.3-5。本发明中驱动trna-sgrna序列表达的启动子也包括除拟南芥外的其他植物的rna聚合酶iii型启动子。

上述trna-sgrna表达序列及表达盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)人工合成可分别由如拟南芥的rna聚合酶iii型启动子u6-26，u6-29，u6-1和u3-b等不同的启动子驱动的trna-sgrna表达盒(合成的详细序列信息见前面所述)并克隆于常见的puc质粒、pbluescriptiisk质粒中。其中trna-sgrna结构重复序列中分别在合成时引入bbsi，bsai，bsmbi和bfuai内切酶识别位点，用于不同靶序列的插入，同时在trna-sgrna表达盒的5’端和3’端在合成时直接添加或另行通过pcr扩增的方式引入不同的酶切位点，满足插入cas9表达载体不同位置，实现trna-sgrna序列和cas9基因共表达以及进行多个trna-sgrna表达盒插入cas9表达载体，实现多基因组合编辑的目的。

(2)目标基因靶向序列组装入trna-sgrna表达盒

靶位点引物设计

根据目标基因待编辑的靶位点序列，按如下序列信息设计两条互补引物对：

引物1：5’-tgcannnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’

引物2：5’-aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’(n＝a，t，c或g)

靶序列的组装

按如下所述程序分别将不同的靶序列逐次装载入trna-sgrna表达盒相应位点。如先组装靶向序列a到bbsi位点，获得含有第一个靶向序列的载体用bsai酶切后再组装第二个靶向序列b；获得的含有a、b靶向序列的载体再用bsmbi酶切后组装第三个靶向序列c；获得的含有a、b、c靶向序列的载体再用bfuai酶切后组装第四个靶向序列d，这样依次获得组装有4个不同靶向序列的trna-sgrna表达盒载体。而上述针对不同靶向位点组装的先后顺序可利用上述四个酶切位点随机进行，不局限于仅按上述顺序组装4个不同靶位点。

靶序列的组装方法：

按表1所示，将靶向位点互补引物对(引物1和引物2)加ddh2o轻微混匀后，95℃变性5min，放置室温1h以上。室温下复性后的引物对按1∶250比例稀释备用。

表1目标基因靶序列引物互补为dna双链体系

按表2所示酶切体系进行u6-26：：trna-sgrna表达盒载体的酶切，琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下切下目的条带。

表2trna-sgrna表达盒载体酶切体系

按表3所示体系添加各成分，轻微混匀后，4℃过夜连接。

表3靶序列组装连接体系

将上述连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂板后用表4所示的pcr体系筛选含插入靶序列的阳性克隆。其中上游的f引物分别为：

u6-26f：5′-cgttgaacaacggaaactcgacttg-3′(u6-26：：trna-sgrna)

u6-29f：5′-ctgatagattgtatatccatgttt-3′(u6-29：：trna-sgrna)

u6-1f：5′-ccgtgggagaaatctcaaaattcc-3′(u6-1：：trna-sgrna)

u3-bf：5′-tttactttaaattttttcttatgc-3′(u3-b：：trna-sgrna)

或其他植物rna聚合酶iii型启动子5′端上游序列。下游r引物则分别为插入靶位点的反向互补引物：5’-aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’。筛选到的阳性克隆进行测序验证，确认靶向位点序列已经成功插入trna-sgrna表达序列相应位置中。

表4含目标靶序列克隆的pcr筛选体系

装载目标靶序列的trna-sgrna表达盒与cas9基因表达框的组装

将上述测序验证后的trna-sgrna含1-4个靶向序列的表达盒用表达盒两端的限制性酶切位点切下(如u6-26：：trna-sgrna表达盒两端位点分别为bamhi和ecori位点)插入pcacas9载体(该载体能在植物细胞中表达cas9蛋白，且cas9基因表达框外序列含单一的hindiii，ecori，bamhi，xbai等酶切位点)用bamhi和ecori酶切后相应位置，获得同时表达含目标靶向序列的trna-sgrna序列以及cas9基因的载体。获得的这个共表达载体可继续装载含其他基因靶向序列的trna-sgrna表达盒，从而实现更多目标基因的编辑。

trna-sgrna序列和cas9基因共表达载体进行植物基因编辑

将含目标靶向位点的trna-sgrna序列和cas9基因共表达载体转化农杆菌eha105或者lba4404，利用农杆菌介导的遗传转化法将相应共表达载体导入目标植物细胞中获得转基因植株。获得的转基因植株利用ctab法提取植株总dna，在目标基因相应的靶位点上下游设计引物，用高保真pcr聚合酶进行扩增。转基因植株获得的pcr产物与相应野生植株pcr产物进行测序比对分析，确定靶基因是否发生片段缺失或者碱基突变，并计算相应的基因编辑效率。进一步对突变植株用高保真酶扩增目标区域片段，插入pbluescriptiisk质粒的ecorv位点。连接产物转化大肠杆菌后在涂布20μlx-ga1(50mg/ml)和20μliptg(0.1mol/l)的平板上进行蓝白斑筛选，挑白斑进行阳性克隆检测以及测序分析，统计靶基因碱基突变类型及频率。根据上述结果分析trna-sgrna序列中不同位置的靶向位点是否能够在植物中完成相应的基因编辑。

有益效果

1.利用本发明trna-sgrna表达序列和表达盒可以实现多靶位点、多基因组合编辑。本发明中单个trna-sgrna表达盒仅能插入4个靶向位点，但通过在cas9植物表达载体中串联trna-sgrna表达盒可以实现远超4个靶向位点的目的。(1)不同iii型启动子驱动的trna-sgrna表达盒串联。如u6-26：：trna-sgrna/u6-29：：trna-sgrna串联表达盒可以实现8个靶向位点的编辑；u6-26：：trna-sgrna/u6-29：：trna-sgrna/u6-1：：trna-sgrna串联表达盒可以实现12个靶向位点的编辑；u6-26：：trna-sgrna/u6-29：：trna-sgrna/u6-1：：trna-sgrna/u3-b：：trna-sgrna串联表达盒可以实现高达16个靶向位点的编辑。(2)通过改变表达盒两端的酶切位点(如引入同尾酶bglii和bamhi酶切连接后两个酶识别位点缺失)，可以实现相同启动子驱动的trna-sgrna表达盒的多次插入，如u6-26：：trna-sgrna/u6-29：：trna-sgrna/u6-1：：sgrna-trna/u3-b：：trna-sgrna/u6-26：：trna-sgrna，该串联结构中含2个u6-26：：trna-sgrna表达盒，可靶向30个位点，从而实现更多的靶向位点或多个基因的组合编辑。(3)由于本发明中针对目标基因的靶向位点的组装是在中间载体中完成，因此，在将其插入cas9表达载体时，可以根据拟研究目标性状，针对相应调控目标基因进行多个表达盒的串联组装，从而灵活实现不同目标基因编辑的自由组合，达到改良多基因调控性状的目的。

2.本发明提供的基于植物细胞内源trna加工系统的sgrna表达序列可用于单子叶植物以及双子叶植物的基因编辑，利用trna-sgrna/cas9系统进行多位点基因编辑尚未在双子叶植物中被报道。将sgrna序列和拟南芥gly-trna前体trna结构序列融合形成一个多顺反子的trna-sgrna结构序列，融合的多顺反子的trna-sgrna结构序列在rna聚合酶iii启动子的驱动下表达，表达产物能被诸如烟草、甘蓝等双子叶植物细胞内源rnasep和rnasez识别并剪切，生成大量的携带靶向序列的sgrna，引导cas9核酸酶对同一基因多个位点或多个基因多个位点进行编辑。相对已有的基于crispr/cas9系统的基因编辑技术，本发明提供了一套更为高效、简便、易操作的适用于植物的多位点、多基因编辑的技术方案，该方案对多基因调控性状的研究以及农作物多性状的改良有重要意义。基于基本的生物化学原理，推断该trna-sgrna结构序列还可用于昆虫如果蝇的基因编辑，应用范围广泛。

3.本发明trna-sgrna表达序列(盒)及其载体不仅具有高效的基因编辑效率，而且其靶向作用具有较高的特异性，可实现定点的点突变。

附图说明

图1实施例1甘蓝srk3基因靶位点c区域pcr产物测序

图2实施例1甘蓝srk3基因各靶位点突变统计

图3实施例1slg3基因的靶位点与srk3基因靶位点的序列比对

图4实施例1slg3基因靶位点1突变类型统计

图5实施例2pcacas-trna-pds-abc介导的烟草ntpds基因突变的表型

图6实施例3ms1基因靶位点c区域的pcr产物测序

图7实施例3ms1基因各靶位点单克隆测序统计

图8实施例3srk3基因靶位点c区域pcr产物测序

图9实施例3srk3基因各靶位点单克隆测序统计

具体实施方式

结合以下具体实施案例，进一步说明本发明。应理解，这些实施例不用于限制本发明的范围。本实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所使用材料均可由公司购进。

实施例1利用trna-sgrna序列表达实现甘蓝自交不亲和相关基因srk的突变

1、人工合成本发明所示u6-26：：trna-sgrna表达盒序列。

2、根据甘蓝自交不亲和系f416的srk3单倍型基因序列以及crispr/cas9基因编辑系统对靶位点序列要求，选取srk3基因a、b、c、d四个目标靶位点，设计如下靶位点互补引物退火为双链dna片段。

(1)srk3基因靶位点a互补引物序列：

sgsrk-1f：5-tgcagtggcagagcttctcgccaa-3

sgsrk-1r：5-aaacttggcgagaagctctgccac-3

(2)srk3基因靶位点b互补引物序列：

sgsrk-2f：5-tgcaaaccctatatccaactccac-3

sgsrk-2r：5-aaacgtggagttggatatagggtt-3

(3)srk3基因靶位点c互补引物序列：

sgsrk-3f：5-tgcagtgggatctttagagtgcat-3

sgsrk-3r：5-aaacatgcactctaaagatcccac-3

(4)srk3基因靶位点d互补引物序列：

sgsrk-4f：5-tgcaggcaataatcttgtcctcct-3

sgsrk-4r：5-aaacaggaggacaagattattgcc-3

含合成的u6-26：：trna-sgrna序列的载体用bbsi酶切，将退火后的srk3基因靶位点a双链dna片段插入u6-26：：trna-sgrna中，获得含有靶位点a的表达盒trna-srk-a；trna-srk-a再用bsai酶切，将退火的srk3基因靶位点b双链dna片段插入trna-srk-a，获得含有靶位点a、b的表达框trna-srk-ab；随后依次将srk基因靶位点c、d双链dna片段组装到trna-srk-ab以及trna-srk-abc中，获得含有表达4个srk基因靶位点序列的trna-srk-abcd载体。

3、用bamhi和ecori酶切含有4个靶位点的trna-srk-abcd载体，将切下的trna-srk-abcd表达盒插入pcacas9载体bamhi和ecori切后的位点，获得同时表达trna-srk-abcd序列以及cas9基因的植物共表达载体。

4、将含trna-srk-abcd序列以及cas9基因共表达载体利用液氮冻融法转化农杆菌感受态eha105后转化甘蓝下胚轴，经过多轮筛选培养获得转基因甘蓝植株。

5、对获得的29株甘蓝转基因植株的靶位点序列区域pcr产物进行测序，与对应的野生型植株pcr产物序列比对，发现29株植株的srk基因在靶位点序列区域有突变发生，编辑效率达到100％(图1)。为进一步判断发生突变的具体类型，随机挑选3株植株，将靶位点区域的pcr产物序列插入pbluescriptiisk质粒ecorv位点，挑阳性克隆进行测序(每株单克隆测序不少于5个)分析(图2)。结果表明，trna-sgrna/cas9系统能够实现单基因的多位点进行编辑。

将4个srk3基因的靶位点与f416自交不亲和系中与srk3基因高度同源的slg3基因比对后发现：在slg3基因序列中有与srk3基因靶位点d完全相同的序列；和靶位点a有两个碱基的错配；和靶位点c有五个碱基的错配。因此，在slg3基因靶位点a、c存在脱靶风险(图3)。对获得的29株转基因植株的slg3目标区域测序分析，有潜在脱靶效应的靶位点a、c未发生脱靶效应，10株转基因植株在slg3基因靶位点d发生了突变，编辑效率为34.5％。对突变植株靶位点做单克隆测序突变频率达81.3％(图4)。本案例结果表明trna-sgrna表达序列对甘蓝基因的靶向作用具有较高特异性，同时可实现导入一个trna-sgrna表达序列进行多个同源基因的敲除。

实施例2利用trna-sgrna序列表达实现烟草pds基因的突变

1、人工合成本发明所示u6-26：：trna-sgrna表达盒序列。

2、根据普通烟草pds基因序列以及crispr/cas9基因编辑对靶位点序列要求，选取pds基因a、b、c共3个目标靶位点，设计如下靶位点互补引物退火为双链dna片段。

(1)ntpds基因靶位点a互补引物序列：

sgntpds1f：5-tgcagccgttaatttgagagtcca-3

sgntpds1r：5-aaaccggactctcaaattaacggc-3

(2)ntpds基因靶位点b互补引物序列：

sgntpds2f：5-tgcagctgcatggaaagatgatga-3

sgntpds2r：5-aaactcatcatctttccatgcagc-3

(3)ntpds基因靶位点c互补引物序列：

sgntpds3f：5-tgcagaggcaagagatgtcctagg-3

sgntpds3r：5-aaaccctaggacatctcttgcctc-3

含合成的u6-26：：trna-sgrna序列的载体用bbsi进行酶切，将退火后的ntpds基因靶位点a双链dna片段插入u6-26：：trna-sgrna中，获得含有靶位点a的表达盒trna-pds-a；获得的trna-srk-a再用bsai酶切，将退火后的ntpds基因靶位点b双链dna片段插入，获得含有靶位点a、b的表达框trna-pds-ab；将退火后的ntpds基因靶位点c双链dna片段插入trna-pds-ab载体的bsmbi位点，获得含有表达3个ntpds基因靶位点序列的trna-sgrna-abc载体。

3、将含有ntpds基因靶位点的trna-sgrna-abc载体用bamhi和ecori酶切下表达盒插入到pcacas9载体bamhi和ecori切后的位点，获得同时表达针对烟草ntpds基因的trna-sgrna-abc序列以及cas9基因的植物共表达载体。

4、将含trna-sgrna-abc序列以及cas9基因共表达载体利用液氮冻融法转化农杆菌感受态eha105后转化烟草叶盘，经过多轮筛选培养获得转基因烟草植株。

八氢番茄红素脱氢酶(pds)基因编码植物类胡萝卜素合成关键酶，敲除该基因可使植物叶绿素合成受阻而出现白化现象，突变容易被发现，快速判断是否发生基因功能丧失(图5)。将转化叶盘数、出现白化芽的叶盘数、分化出的愈伤数、出现白化的愈伤数、愈伤中突变位点数作为参数进行统计(表5)。观察比较pcacas-trna-pds-abc介导的ntpds基因的叶盘突变率达到100％，获得的抗除草剂愈伤的突变率为94.2％。说明trna-sgrna/cas9系统能够高效的编辑烟草基因组。

表5pcacas-trna-pds-abc编辑烟草ntpds基因的统计

实施例3利用trna-sgrna序列表达实现甘蓝ms1基因以及srk基因的双突变

1、人工合成本发明所示u6-26::trna-sgrna表达盒序列。

2、根据甘蓝自交不亲和系f416的ms1基因(雄性不育相关基因)序列以及crispr/cas9基因编辑系统对目标靶位点序列要求，选取ms1基因中a、b、c、d四个目标靶位点，设计如下靶位点互补引物退火为双链dna片段。

(1)ms1基因靶位点a互补引物序列：

sgms1-1f：5-tgcagcctttctaaaactagaagg-3

sgms1-1r：5-aaacccttctagttttagaaaggc-3

(2)ms1基因靶位点b互补引物序列：

sgms1-2f：5-tgcagagtagcaaaaggagagccg-3

sgms1-2r：5-aaaccggctctccttttgctactc-3

(3)ms1基因靶位点c互补引物序列：

sgms1-3f：5-tgcagaggttaagagaggcttcga-3

sgms1-3r：5-aaactcgaagcctctcttaacctc-3

(4)ms1基因靶位点d互补引物序列：

sgms1-4f：5-tgcaaagttggtcctttcagctcg-3

sgms1-4r：5-aaaccgagctgaaaggaccaactt-3

合成的u6-26::trna-sgrna序列通过下述引物进行pcr扩增：u6-26fx：5’-cctctagattcgttgaacaacggaaactcgact-3’；trna-r1：5’-gaggatccattcgaagggacaaaaaaaaagcaccg-3’。在其pcr扩增产物两端分别导入xbai和bamhi位点，pcr产物插入pbluescriptiisk质粒的ecorv位点处，获得u6-26::trna-sgrna表达盒5’为xbai位点，3’为bamhi位点的载体。该载体用bbsi进行酶切，将退火后的ms1基因靶位点a双链dna片段插入u6-26::trna-sgrna中，获得含有靶位点a的表达盒trna-ms1-a；再用bsai酶切trna-ms1-a，将退火后的ms1基因靶位点b双链dna片段插入trna-ms1-a，获得含有靶位点a、b的表达框trna-ms1-ab；依次将ms1基因靶位点c、d双链dna片段组装到trna-ms1-ab以及trna-ms1-abc，获得含有表达4个ms1基因目标靶位点序列的trna-ms1-abcd载体。

3、将trna-ms1-abcd载体用xbai和bamhi切下含有ms1基因4个靶位点序列表达盒插入到案例1中含trna-srk-abcd序列、cas9基因共表达载体的xbai和bamhi切后位点，获得同时表达trna-ms1-abcd序列、trna-srk-abcd序列以及cas9基因的植物共表达载体。

4、将含trna-ms1-abcd序列、trna-srk-abcd序列以及cas9基因共表达载体利用液氮冻融法转化农杆菌感受态eha105后转化甘蓝下胚轴，经过多轮筛选培养获得转基因甘蓝植株。

5、首先对获得的18转基因植株的ms1基因的靶位点序列区域进行pcr扩增片段的测序，与野生型植株pcr产物序列比对发现，有5株转基因植株ms1基因的靶位点序列区域发生了突变，编辑效率达到27.8％(图6)。为了进一步判断发生突变的具体类型，pcr克隆5株植株靶位点区域序列，插入pbluescriptiisk质粒的ecorv位点处，挑选阳性克隆进行测序分析。

结果发现ms1基因在4个靶位点均有突变发生，其中有1个单株在两个靶位点同时发生了突变(图7)。另外，对ms1基因已经发生突变的5株植株中的srk3基因进行突变检测。首先设计引物对srk3基因4个靶位点区域序列进行扩增，扩增产物pcr测序后与从野生型植株获得的pcr产物序列进行比对，发现已经检测到ms1基因突变的5株转基因甘蓝植株中均发生了srk3基因的突变(图8)。进一步的克隆测序分析显示在srk3基因的4个位点均发生了碱基插入以及缺失等类型突变(图9)。其中在2个靶位点发生突变的有3株，3个靶位点发生突变的l株，4个靶位点均发生突变的1株。

上述结果显示，将多个trna-sgrna表达盒序列进行串联表达，可以在同一植株中实现多个基因的突变。

上述实施例为本发明的具体实施提供了参考，在本发明的基础上做出一些改进或修改，但不偏离本发明精神同样属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>西南大学

<120>一种基于内源trna加工系统的多靶序列sgrna表达载体及其在植物基因编辑中的应用

<160>

<210>1

<211>757

<212>trna-sgrna表达序列

<213>artificial(人工序列)

<220>

<221>

<222>（1）..（77）

<223>拟南芥gly-trna序列

<222>（78）..（99）

<223>typeii内切酶bbsi

<222>（100）..（185）

<223>sgrna序列

<222>（186）..（262）

<223>拟南芥gly-trna序列

<222>（263）..（282）

<223>typeii内切酶bsai

<222>（283）..（368）

<223>sgrna序列

<222>（369）..（445）

<223>拟南芥gly-trna序列

<222>（446）..（465）

<223>typeii内切酶bsmbi

<222>（466）..（551）

<223>sgrna序列

<222>（552）..（628）

<223>拟南芥gly-trna序列

<222>（629）..（654）

<223>typeii内切酶bfuai

<222>（655）..（740）

<223>sgrna序列

<400>1

aacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttc60

gattcccggctggtgcagggtcttcgttacagaagacctgtttcagagctatgctggaaa120

cagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtc180

ggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccg240

ggttcgattcccggctggtgcaagagaccctgcagggtctctgtttcagagctatgctgg300

aaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccga360

gtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagac420

ccgggttcgattcccggctggtgcaagagacggttacacgtctctgtttcagagctatgc480

tggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcac540

cgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtaca600

gacccgggttcgattcccggctggtgcaaatcgcaggtgttacaacctgcattcgtttca660

gagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaa720

aagtggcaccgagtcggtgctttttttttgtcccttc757

<210>2

<211>1212

<212>trna-sgrna表达盒序列

<213>artificial(人工序列)

<220>

<221>

<222>（1）..（6）

<223>限制性内切酶识别位点

<222>（7）..（449）

<223>atu6-26启动子

<222>（1207）..（1212）

<223>限制性内切酶识别位点

<400>2

ggatcccgttgaacaacggaaactcgacttgccttccgcacaatacatcatttcttctta60

gctttttttcttcttcttcgttcatacagtttttttttgtttatcagcttacattttctt120

gaaccgtagctttcgttttcttctttttaactttccattcggagtttttgtatcttgttt180

catagtttgtcccaggattagaatgattaggcatcgaaccttcaagaatttgattgaata240

aaacatcttcattcttaagatatgaagataatcttcaaaaggcccctgggaatctgaaag300

aagagaagcaggcccatttatatgggaaagaacaatagtatttcttatataggcccattt360

aagttgaaaacaatcttcaaaagtcccacatcgcttagataagaaaacgaagctgagttt420

atatacagctagagtcgaagtagtgattgaacaaagcaccagtggtctagtggtagaata480

gtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgcagggtcttcgttaca540

gaagacctgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccg600

ttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggta660

gaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgcaagagaccct720

gcagggtctctgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagt780

ccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtg840

gtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgcaagagac900

ggttacacgtctctgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggct960

agtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtcta1020

gtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgcaaat1080

cgcaggtgttacaacctgcattcgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttga1140

aataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttttgt1200

cccttcgaattc1212

<210>3

<211>353

<212>u6-29启动子

<213>artificial(人工序列)

<400>3

ctgatagattgtatatccatgtttagttggattaaatatcaaagatctcttacagttagt60

ttcgttcttaatccaaactactgcagcctgacagacaaatgaggatgcaaacaattttaa120

agtttatctaacgctagctgttttgtttcttctctctggtgcaccaacgacggcgttttc180

tcaatcataaagaggcttgttttacttaaggccaataatgttgatggatcgaaagaagag240

ggcttttaataaacgagcccgtttaagctgtaaacgatgtcaaaaacatcccacatcgtt300

cagttgaaaatagaagctctgtttatatattggtagagtcgactaagagattg353

<210>4

<211>313

<212>u6-1启动子

<213>artificial(人工序列)

<400>4

ccgtgggagaaatctcaaaattccggcagaacaattttgaatctcgatccgtagaaacga60

gacggtcattgttttagttccaccacgattatatttgaaatttacgctgagtgtgagtga120

gacttgcataagaaaataaaatctttagttgggaaaaaattcaataatataaatgggctt180

gagaaggaagcgagggataggcctttttctaaaataggcccatttaagctattaacaatc240

ttcaaaagtaccacatcgcttaggtaaagaaagcagctgagtttatatatggttagagac300

gaagtagtgattg313

<210>5

<211>325

<212>u3-b启动子

<213>artificial(人工序列)

<400>5

tttactttaaattttttcttatgcagcctgtgatggataactgaatcaaacaaatggcgt60

ctgggtttaagaagatctgttttggctatgttggacgaaacaagtgaacttttaggatca120

acttcagtttatatatggagcttatatcgagcaataagataagtgggctttttatgtaat180

ttaatgggctatcgtccatagattcactaatacccatgcccagtacccatgtatgcgttt240

catataagctcctaatttctcccacatcgctcaaatctaaacaaatcttgttgtatatat300

aacactgagggagcaacattggtca325

<210>6

<211>527

<212>甘蓝srk3基因靶位点区域序列:＞srk3

<213>artificial(人工序列)

<400>6

gacattgtccgacagaacctatgtatggattgccaacagagataaccctatatccaactc60

cactggaaccctcaaaatctcaggcaataatcttgtcctccttggtgactccaataaacc120

tgtttggtcgacgaatctaactagaagaagtgagagatctccagtggtggcagagcttct180

cgccaacggaaacttcgtgatgcgagactccaacaacaacgatgcaagtcaatttttatg240

gcaaagtttcgattaccctacagatactttgcttcctgacatgaaactgggttacgacct300

aaaaacagggctggacagattccttacatcatggagaagtttagatgatccgtcaagcgg360

gaatttctcgtacaggctcgaaacccgaaagtttcctgaattttatttaaggagtgggat420

ctttagagtgcatcggagtggtccatggaatggaatccgatttagtggcataccagatga480

ccaaaagttgagttacatggtttacaatttcacagataatagtgaag527

<210>7

<211>4543

<212>烟草ntpds基因靶位点区域序列:＞ntpds

<213>artificial(人工序列)

<400>7

aaacagttgagtacttctttaatccttcctaattctttgtcaggggtatctttttgtggg60

taacggccaaaccaccacaaatttccagttcccacttttaactctttaacttcaattcaa120

ctagtttatttccttttgcttcctacaactataacatagtcttggtttcagaatccacaa180

cttgaaatacaactcctaggcggtttcattccgaggtaagaaatgattttgcttttcttt240

ggttacatcagctgaatgctttacttgagaaaagctttctctttttttcctttctttgat300

gtgtaccgcccgtttatgatcttggtatttgctcttttttgtactcgtccggactttaac360

ttgattttgtgggtgaagtattaaaacaagttttatatggactgtaaaagctagaatctt420

ttttacttttgcatataaatttgtataataaatgcttatgaacctgcatataaatttgta480

taataaatgcatatggccatttgaaaaagaaaaggaattccacatagtatttagattcac540

aagtgggacaatcttcttacactgaaatatctttatgtcaggcttaatttaccgctattt600

tgctcagtaaaatgccccaaattggacttgtttctgccgttaatttgagagtccaaggta660

attcagcttatctttggagctcgaggtcttcgttgggaactgaaagtcaagatggtcgct720

tgcaaaggaatttgttatgttttggtagtagcgactccatggggcataagttaaggattc780

gtactcccagtgccacgaccagaagattgacaaaggactttaatcctttaaaggtttgtt840

ttgaatgcgaaagtgtgatgatggatttatggtcattgaatttatgatcttgggcatata900

ttctctaaaataagagaagtatatcttgccattcaggtagtctgcattgattatccaaga960

ccagagctagacaatacagttaactatttggaggcggcgttattatcatcatcatttcgt1020

acttcctcacgcccaactaaaccattggagattgttattgctggtgcaggtgattttttc1080

cggtcatctatatttgtagtcttcatttctctttcttcggaaggaagatcattctattag1140

ttgtattatcactagaatatttacctgggcattcttttctgattaactgttttggaccgc1200

aaaattttaggttcttacttcttcgccattttgcaactaatcaacaagtcccagctgatt1260

agattaggagcggtttgaaaattcgtttgttttgatctatttttgccgtcactccattta1320

tatacatatctattctctcttatcatctgagccatgataagcaggtgaacgtgctgtcta1380

ttgggtggcatgtccaaaggatcattctgaaatattggaggctaatgaatcaatatcttg1440

tgcaagattgatctcactatacctataatcagagtacttagagttccaaaaatttcaaaa1500

ccaattgaaaagtcaaacgagttacatataggggttgcactcttctaaggcttgcaatct1560

gtgagaaaaagatgagaaggagatcttcatatttcatctttactagtctggaccactgac1620

cggttagcagttttcaacgtgttcttcaacttggcttgcaaaatactgtgccggtcattt1680

ctcttgtattgtcatcaactggttgattatctgagtacctaaagaaagaatgttatatgc1740

atgattcattctgctgtactataaaagatataataaagaatgctagccgaggtactacat1800

agccttttccaataaatagaagctgtaacatgattctaattcattttttttgcaatatca1860

ggtttgggtggtttgtctacagcaaaatatctggcagatgctggtcacaaaccgatattg1920

ctggaggcaagagatgtcctaggtggaaaggtgaagaagatccagtctttcctttaattt1980

tattcctttttcttttgtgtccttccctattgatagtcccttttcaggaaggcttctgtt2040

tgttttatttaaaatcatttttcatactctttaaacattcagttgctcaaacaattgcaa2100

gggtgttcactattcctattcntatatatatatctgtttttggaggaaattgatatgtcc2160

taaaattttccagctttactactaataaagttggttgtcgaaaaattatacagcatatta2220

ggtaaaagatatggaaagtatattattatcattctctattattttatgattcagtcaatt2280

ttacccgtcctgttgggtgtatttctcgtataaatacagtcttatctgtgagatgctatg2340

tgaattagctgttgttttcagtatagaacactatcttagtctgttttatcttactgaagc2400

agtcaccaagaatctagctgtataggctaaaatattgaattagcattaatctttatctgt2460

tctgcacctgaatacttatacctcccttttaggtagctgcatggaaagatgatgatggag2520

attggtatgagactgggttgcatatattctgtaagtttgactcctcaagaatgcgtactt2580

taatcttctaatacagtcatagcaatttctttcaagatcttttttgtccattaatcagat2640

agcaatccctgtttgtcttttgttttttgcaaataaccaatttttgtcagtcgatctgta2700

ttctgccttgcctctcttttttcatctgttaatttcgtatggtgactcatacaagttggt2760

gcatctcctttaagttggggcttacccaaatatgcagaacctgtttggagaactagggat2820

taacgatcgattgcagtggaaggaacattcaatgatatttgcgatgcctaacaagccagg2880

ggaattcagccgctttgattttcctgaagctcttcctgcgccattaaatggtaagtactt2940

aatcatgagtaaattttttcccttctgtattgaatattgattatgcaaacttccccagta3000

aggtatgaaattgattagtccattaatacctctggcgcattgctaacattaaaagaacat3060

aaaggttcattacgtcttgatcagaatttctgcatgtagctaaagtgattgagtgtatgt3120

acaaatttttacacattgcaagcataagccagttattgttatctcttattttcatttctc3180

tagctgtatctcttattctcatttctctatctatgtgttattacttctacaggaattttg3240

gccatactaaagaacaatgaaatgcttacatggcccgaaaaagtcaaatttgctattgga3300

ctcttgccagcaatgcttggagggcaatcttatgttgaagctcaagacggtttaagtgtt3360

aaggactggatgagaaagcaagtgcgtgatcattttatcttactcttttagctcataacc3420

ttgaagacatagttgacttgcaagttgttgatttaacatgttagaaatgtctacctgcct3480

ttccttttctaacaacatacatcttgcaaaactcatcagcagctatttgcttaattgctt3540

ttcagggtgtgcctgatagggtgacagatgaggtgttcattgccatgtcaaaggcactta3600

acttcataaaccctgacgagctttcgatgcagtgcattttgattgctttgaacagatttc3660

ttcaggttagaatcctgatccaccctcaaaacaaaaagagagaaagggatatagtcctac3720

caaagctgtaaatcatgtttgggacctgacatattggtgcaggaaacttatgagtgaact3780

tgtccactcagtttaacttttctgatatatttgaattatcaatttgcaggagaaacatgg3840

ttcaaaaatggcctttttagatggtaaccctcctgagagactttgcatgccgattgttga3900

acatattgagtcaaaaggtggccaagtcagactaaactcacgaataaaaaagattgagct3960

caatgaggatggaagtgtcaaatgttttatactgaataatggcagtacaattaaaggaga4020

tgcttttgtgtttgccactccaggtataatatccattatactagtatcgatgcttccagt4080

tttcacatttttaatatgaatttataaatttttgctggcttttgattatccgattagtgg4140

atatcttcaagcttcttttgcctgaagactggaaagagatcccatatttccaaaagttgg4200

agaagctagtgggagttcctgtgataaatgtccatatatggttagtgatgaaaattttac4260

ttgtcagtgtttgttcttcctctagcatatctatgtatgtgcgtgtaaatgtctatacgt4320

acataaacatgtagtcctctgtttttgtgttaacttccattgaatgaggaacttatggat4380

gtacgcttttccaaaactttgattggacacattgctttgtgttttcaactttgatgagca4440

gaactaccattgtttagctattagtggttgagattcctattgaaaagatttgtataaatt4500

taatttgcaggtttgacagaaaactgaagaacacatctgataa4543

<210>8

<211>1699

<212>甘蓝ms1基因靶位点区域序列：>boms1

<213>artificial(人工序列)

<400>8

atgtcgaatctgattcgaacagatcttccaaagaagaggaagagaggagaaagtacggtt60

tttaggctgaagactttcggagagacaggacatcccgctgagctgaaccagttgtctttt120

agagacaaccttgggaagcttcttgagtttggtcactttgagagctccggtctcatggga180

agttggtcctttcagctcgaggttcatcgtcacccaaatcctctatatgttcttctcttt240

gtcgtcgaagagcccatcgaagcctctcttaacctccgttgcaaccattgccaatatgtt300

ggtgacgtcatctccctctttctctccacttctctcattgtctatatatattttgcatat360

cgatatctatctatctatatgtgtgtgtgcatgctgatacatccataatatgatcaacga420

tcacaacgtaacaataaaaagacctgataagataatttagctcaccgagtaagcattttt480

cgttgcatatctatgaaaaatataacaagcggaaaaaaaaatgatatggtgatccaagag540

tgttggaggctcaacctcttttagaaggatgatagtttcattgattcaaatttcatatgt600

taattttaatatgttacatgtaataggtcaacaatatgtattatgcatttatttatggaa660

cattacaggttggggaaaccacatgatatgcaacaagaagtaccatttcgtgatcccctc720

aaaggaaacaatggccgcctttctaaaactagaaggaggaatcttggtttctcccgaaaa780

agaaagcctctcccatcttgtggaacttcaaggccatgtccttcacggctttttccactc840

caacggatttggtcacttgctctcaatcaatggcatcgagtccggttccgacttaaccgg900

tcatcaagtcatggagttgtgggatcgcctctgctctggtttaaaggccaggtatacgta960

ttaagattataattatcatcttttatatttgtatacgttgtgcaatgttcacgtgataca1020

tatcatatggtactaaaccattcagcagaattctatgacttgtcataaataataaagttt1080

ggatttttaaccatttaattcatggtagtcaagtgctttgaagattcaacacatggttga1140

gagcaatttcaaccatactagtaactttgttaactcaagaaaccaccactttatagaact1200

tgggacgaaattctggattttagtttcgaattatagatattattcgaattttctcttttg1260

cttttagttataaatttcacatattaggccattttattagaaatggtaacaattatttgt1320

atcttattatgttatggtatatatgttggatataggaaaatagggttgaacgatgcatcg1380

cacaagaaagggatggaactgaggctgctgcatggagtagcaaaaggagagccgtggttc1440

ggtcgttggggttaccggttcgggtcagggacatacggagtgactcaaaagatttacgag1500

aaggcacttgagtcggtccgcaacgtacccttgtgtttgcttaaccatcacctaaccagc1560

cttaaccgtgagactccaatcctcttgtcaaggtatcaaactttatccaccgagccattg1620

attactctcagtgatctcttcatgttcatgcttcatctccattcgcgtcttccaagagac1680

aactacatgaataactccc1699

<210>9

<211>13969

<212>pcacas9植物表达载体序列：>pcacas9

<213>artificial(人工序列)

<400>9

gaattcctcgagtacgtaggatccatttaaattctagaggcgcgccgatatcctctctta60

aggtagcgagctcttaattaatagggataacagggtaattaactataacggtcctaaggt120

agcgatggcaaacagctattatgggtattatgggtggttctttatgcggacactgacggc180

tttatgcctgcaggtcgcgagcgatcgcggtaccgcccgggcgtcgacaggcctgatcta240

gtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcgctatattttgtttt300

ctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaacccatctcataaata360

acgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacagaaattatatga420

taatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaatgtttg480

aacgatctgcagtcacttcttcttcttagcctgtccagccttcttggtagcagctggtct540

cttatctcctccaagctgagaaagatcgattctggtctcgtaaagtccggtgatagactg600

gtggataagggtagcatcaagaacctccttggtagaggtgtatctttttctatcgatggt660

ggtatcgaagtacttgaaagcagctggagcaccaaggttggtaagggtgaaaaggtggat720

gatgttctcagcctgctctctgattggcttatctctgtgcttgttgtaagcagaaagaac780

cttatcaaggttagcatcagcaaggataactctcttagagaactcagagatttgctcgat840

gatctcatcaaggtagtgcttgtgctgctcaacgaaaagctgcttctgctcgttatcctc900

tggagatcccttcaacttctcgtagtgagaagcaaggtaaaggaagttaacgtacttaga960

tggaagagcaagctcgtttcccttctgaagctctccagcagaagcaagcattctctttct1020

tccgttctcaagctcgaaaagagagtactttggcaacttgatgataagatccttcttaac1080

ctccttgtatcccttagcctcaaggaaatcgattgggttcttctcgaaagaagaacgctc1140

catgatggtgattccaagaagctccttaacagacttcaacttcttagactttcccttctc1200

aaccttagcaacaacaagaacagagtaagcaacggttggagaatcgaatcctccgtactt1260

ctttgggtcccaatccttctttctagcgatcaacttatcagagtttctctttggaaggat1320

agactccttagagaatcctccggtctgaacctcggttttcttaacgatgttaacctgtgg1380

catagaaagaacctttctaacggtagcgaaatctcttcccttatcccaaacgatctctcc1440

ggtctctccgttggtctcgataagtggtctctttctgatctctccgttagcaagggtgat1500

ctcggtcttgaagaagttcatgatgttagagtagaagaagtacttagcggtagcctttcc1560

gatctcctgctcagacttagcgatcatctttctaacatcgtaaaccttgtaatctccgta1620

aacgaactcagactccaactttgggtacttcttgataagagcggttccaacaacagcgtt1680

aaggtaagcatcgtgagcgtggtggtagttgttgatctctctaaccttgtagaactggaa1740

atcctttctgaaatcagaaaccaacttagacttcaaggtgataaccttaacctctctgat1800

caacttatcgttctcatcgtacttggtgttcatacgagaatcaaggatctgagcaacgtg1860

cttggtgatctgtctggtctcaacaagctgtctcttgatgaatccagccttatcaagctc1920

agaaagtcctcctctctcagccttggtaaggttatcgaactttctctgggtgatcaactt1980

agcgttaagaagctgtctccagtagttcttcatcttcttaacaacctcctcagatggaac2040

gttatcagactttcctctgttcttatcagaacgggtaagaaccttgttatcgatagaatc2100

atccttcaagaaagactgtggaacgatgtgatcaacatcgtaatcagaaagtctgttgat2160

gtcaagctcctgatcaacgtacatatctcttccgttctgaaggtagtaaaggtacaactt2220

ctcgttctgaagctgggtgttctcaactgggtgctccttcaagatttgagatccaagctc2280

cttgattccctcctcgattctcttcattctctcacgagagttcttctgtcccttctgggt2340

ggtctggttctctctagccatctcgataacgatgttctctggcttgtgtctacccataac2400

cttaacaagctcatcaacaaccttaacggtctgaaggattcccttcttgatagctggaga2460

tccagcaaggttagcgatgtgctcgtgaagagaatctccctgtccagaaacctgagcctt2520

ctggatgtcctccttgaaggtaagagaatcatcgtggataagctgcatgaagtttctgtt2580

agcgaatccatcagacttcaagaaatcaaggatggtctttccagactgcttatctctgat2640

tccgttgatcaacttacgagaaagtctaccccatccggtgtatcttcttctcttcaactg2700

cttcataaccttatcatcgaaaaggtgagcgtaggtcttgagtctctcctcgatcatctc2760

tctatcctcgaaaagggtaagggtaagaacgatgtcctcaaggatgtcctcgttctcctc2820

gttatcaaggaaatccttatccttgatgatcttcaaaagatcgtggtaggttccaagaga2880

agcgttgaatctatcctcaactccagagatttcaacagaatcgaagcactcgatcttctt2940

gaagtaatcctccttcaactgcttaacggtaacctttctgttggtcttgaaaagaagatc3000

aacgatagccttcttctgctctccagaaaggaaagctggctttctcattccctcggtaac3060

gtacttaaccttggtaagctcgttgtaaacggtgaagtactcgtaaagaagagagtgctt3120

tggaagaaccttctcgtttggaaggttcttatcgaagttggtcattctctcgatgaaaga3180

ctgagcagaagctcccttatcaacaacctgcacatcaacaaattttggtcatatattaga3240

aaagttataaattaaaatatacacacttataaactacagaaaagcaattgctatatacta3300

cattcttttattttgaaaaaaatatttgaaatattatattactactaattaatgataatt3360

attatatatatatcaaaggtagaagcagaaacttacctcctcgaagttccaaggggtgat3420

ggtctcctcagactttctggtcatccaagcgaaacgagagtttcctctagcaagtggtcc3480

aacgtagtatgggattctgaaggtaaggatcttctcgatcttctctctgttatccttcaa3540

gaatgggtagaaatcctcctgtctacgaaggatagcgtgaagctctccaaggtggatctg3600

gtgtgggatagatccgttatcgaaggttctctgctttctaagaagatcctctctgttcaa3660

cttaacaagaagctcctcggttccatccatcttctcaaggattggcttgatgaacttgta3720

gaactcctcctgagaagctcctccatcgatgtatccagcgtatccgttcttagactgatc3780

gaagaagatttccttgtacttctctggaagctgctgtctaacaagagccttcaaaagggt3840

aagatcctggtggtgctcatcgtatctcttgatcatagaagcagaaagtggagccttggt3900

gatctcggtgttaactctaaggatgtcagaaagaaggatagcatcagaaaggttcttagc3960

agcaaggaaaagatcagcgtactgatctccgatctgagcaagaaggttatcaagatcatc4020

atcgtaggtatccttagaaagctgcaacttagcatcctcagcaagatcgaagttagactt4080

gaagtttggggtaagtccaagagaaagagcgataaggtttccgaaaagtccgttcttctt4140

ctctcctggaagctgagcgataaggttctcaagtctacgagacttagaaagtctagcaga4200

aaggatagccttagcatcaactccagaagcgttgattgggttctcctcgaaaagctggtt4260

gtaggtctgaacaagctggatgaacaacttatcaacatcagagttatctgggttaaggtc4320

tccctcgataaggaagtgtcctctgaacttgatcatgtgagcaagagcaaggtagataag4380

tctaagatcagccttatcggtagaatcaaccaacttctttctaaggtggtagatggttgg4440

gtacttctcgtggtaagcaacctcatcaacgatgtttccgaagattgggtgtctctcgtg4500

cttcttatcctcctcaacaaggaaagactcctcaagtctgtggaagaaagaatcatcaac4560

cttagccatctcgttagagaagatttcctgaaggtagcagattctgttctttcttctggt4620

gtatcttcttctagcggttctcttcaatctggtagcctcagcggtctctccagaatcgaa4680

aagaagagcaccgataaggttcttcttgatagagtgtctatcggtgtttccaagaacctt4740

gaacttcttagatggaaccttgtactcatcggtgataacagcccatccaacagagttggt4800

tccgatgtcaagtccgatagagtacttcttatcagcagctggaactccgtggattccaac4860

ctttctcttcttctttggagccatcttatcatcatcatccttgtaatccttatcatcatc4920

atccttgtaatccatggtggaagtatttgaaagaaaattaaaaataaaaagatctcctct4980

ccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtg5040

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