小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型的制作方法

本发明属于机体免疫技术领域，尤其涉及一种小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型。

背景技术：

免疫耐受是指机体免疫系统接受某种抗原作用后产生的特异性的免疫无应答状态。对特异性抗原产生免疫耐受的个体，再次接触该抗原刺激后，不发生免疫应答或不能发生用常规方法可检测到免疫应答。因此正常的免疫耐受机制对维持机体健康至关重要。目前对免疫耐受产生的机制还不十分明了。虽然近年来国际上和国内对损害免疫耐受的因素研究进展很快，但对于使已经形成的免疫耐受损伤的恢复及其导致的疾病的康复还远不能令人满意。动物实验和临床研究表明，免疫耐受失常和多种疾病的发病有关，例如过敏性疾病(如哮喘、食物过敏)，自身免疫性疾病(如糖尿病、系统性红斑狼疮)以及某些非特异性炎症病(如炎症性肠病)等。这些疾病的发病人数众多，每年治疗这些疾病的医疗费用耗资巨大。因此，由于免疫耐受失常而引起的疾病对人类的健康和社会经济有重大的负面影响。gal-1是凝集素家族成员之一。凝集素(lectins)是一类非抗体、对糖蛋白上的糖类具有高度特异性的结合蛋白；具有凝集细胞和沉淀聚糖的作用。在哺乳动物体内已发现15种gal亚型。由于免疫细胞表面富含糖蛋白，gal-1能通过和糖蛋白(例如t细胞受体，cd45，cd43，cd7，cd3，cd2，前b细胞受体等)结合而调节免疫细胞的功能。研究表明，gal-1能调节dc的活性，增强il-10的表达，引起t细胞凋亡，使treg活化，为treg的免疫抑制功能所必需，调节b细胞的生命周期，诱导长寿浆母细胞(llpc)表达免疫耐受分子tgf-β。哮喘病人体内gal-1的水平下降；结肠炎小鼠肠粘膜中gal-1显著减少。食物过敏小鼠的免疫细胞gal-1含量显著降低，并和血清tnf-α水平呈负相关关系(p<0.01)；哮喘病人和慢性结肠炎也有这些现象。tnf-α可以抑制gal-1在免疫细胞中表达。受gal-1作用后，iec可表达tgf-β，对微生物产物引起的炎症反应(如分泌il-8)也明显降低。肠道免疫耐受系统在维持肠粘膜健康和功能中有至关重要的作用；然而还没有建立有关检测指标。

综上所述，现有技术存在的问题是：肠道免疫耐受系统在维持肠粘膜健康和功能中有至关重要的作用；现有技术没有建立有关检测指标。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型。

本发明是这样实现的，一种小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型，所述小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型为：一部分gal-1缺陷小鼠用gal-1腹腔注射，0.25mg/只，每日一次，共7天；分别从gal-1缺陷小鼠，b6小鼠和用gal-1注射过的小鼠取小肠。

本发明的另一目的在于提供一种所述小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型的建立方法，所述小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型的建立方法包括以下步骤：

步骤一，获取gal-1缺陷小鼠；

步骤二，一部分gal-1缺陷小鼠用gal-1腹腔注射，0.25mg/只；每日一次，共7天；

步骤三，分别从gal-1缺陷小鼠，b6小鼠和用gal-1注射过的小鼠取小肠，装于ussing室系统上；

步骤四，用尤丝室系统测定上皮屏障功能；

步骤五，取小肠分离lpmc，用流式细胞仪检测免疫耐受细胞；包括cd19+il-10+b细胞；cd19+tgf-β+b细胞；cd4+cd25+foxp3+t细胞；cd4+cd25+il-10+t细胞。

进一步，所述步骤四中测定上皮屏障功能包括记录电导和用辣根过氧化物酶为示踪剂测定上皮层通透性。

进一步，所述步骤五中用facs计数耐受型dc，treg，th1细胞，th2细胞和耐受型b细胞；在收集细胞前3个小时在培养液中加蛋白转运抑制剂。

进一步，所述耐受型dc为cd11c⁺il-10⁺，或cd11c⁺tgf-β⁺；treg为cd4⁺cd25⁺foxp3⁺；th1细胞为cd4⁺cd25⁺ifn-γ⁺；th2细胞为cd4⁺cd25⁺il-4⁺；耐受型b细胞为cd19⁺il-10⁺，或cd19⁺tgf-β⁺。

本发明的优点及积极效果为：检测模型能诱导出抗原特异性调节性t细胞，恢复病人体内的抗原特异性免疫耐受，从而抑制过敏反应。表明gal-1有免疫调节功能；肠粘膜是形成口服耐受的重要器官；进一步观察gal-1对肠粘膜的免疫耐受特性的调节；并且从观察iec在诱导和维持肠粘膜免疫耐受中的作用这一全新的切入点着手，揭示iec在免疫耐受方面的功能，揭示肠粘膜诱导免疫耐受的内在机制。

附图说明

图1是本发明实施提供的小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型的建立方法流程图。

图2是本发明实施提供的小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型的建立方法实现流程图。

图3是本发明实施提供的gal-1的管理显着降低肥大细胞计数在肠道组织示意图。

图4是本发明实施提供的gal-1明显减少示意图。

图5是本发明实施提供的gal-1防止特异性抗原ova示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型为：一部分gal-1缺陷小鼠用gal-1腹腔注射，0.25mg/只，每日一次，共7天；分别从gal-1缺陷小鼠，b6小鼠和用gal-1注射过的小鼠取小肠。

如图1所示，本发明实施例提供的小鼠肠粘膜上皮屏障功能和肠粘膜免疫耐受细胞检测模型的建立方法包括以下步骤：

s101：获取gal-1缺陷小鼠；

s102：一部分gal-1缺陷小鼠用gal-1腹腔注射，0.25mg/只；每日一次，共7天；

s103：分别从gal-1缺陷小鼠，b6小鼠和用gal-1注射过的小鼠取小肠，装于ussing室系统上；

s104：测定上皮屏障功能，包括记录电导和用辣根过氧化物酶(hrp)为示踪剂测定上皮层通透性；

s105：取小肠分离lpmc，检测免疫耐受细胞。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述.

1、实验设计原理：肠粘膜上皮屏障是内稳态的主要指标之一，免疫耐受机能失常时内稳态往往失调；推测gal-1缺陷时会有肠粘膜免疫耐受的细胞成分异常和内稳态异常。

2、实验条件：

(1)从深圳华大基因服务公司获取gal-1缺陷小鼠。

(2)一部分gal-1缺陷小鼠用gal-1腹腔注射(0.25mg/只；注射gal-1的时间和剂量可根据实验结果调整)，每日一次，共7天。

(3)分别从gal-1缺陷小鼠，b6小鼠和用gal-1注射过的小鼠取小肠，装于ussing室系统上。

(4)测定上皮屏障功能【包括记录电导和用辣根过氧化物酶(hrp)为示踪剂测定上皮层通透性】。

(5)取小肠分离lpmc，检测免疫耐受细胞。用facs计数耐受型dc(cd11c⁺il-10⁺，或cd11c⁺tgf-β⁺)，treg(cd4⁺cd25⁺foxp3⁺)，th1细胞(cd4⁺cd25⁺ifn-γ⁺)，th2细胞(cd4⁺cd25⁺il-4⁺)和耐受型b细胞(cd19⁺il-10⁺，或cd19⁺tgf-β⁺)。为了提高facs检测效率，在收集细胞前3个小时在培养液中加蛋白转运抑制剂(如brefeldina)。

3、检测方法包括：

(1)检测gal-1缺陷小鼠肠粘膜中免疫耐受细胞

分别检测、分析和比较gal-1缺陷小鼠和正常小鼠肠粘膜中和免疫耐受机制有关的主要细胞成分(如耐受型dc，th1，th2，treg和breg)的数量和比例。

(2)用重组的gal-1调节gal-1缺陷小鼠肠粘膜免疫耐受细胞数量，给gal-1缺陷小鼠加用体外重组的gal-1到各组实验，看能不能使上述各项指标恢复到正常小鼠的水平。

(3)测定gal-1缺陷小鼠肠上皮屏障功能，上皮屏障功能正常对维持机体的内稳态至关重要。肠上皮屏障功能是肠粘膜内稳态的重要指标之一；免疫耐受失常时常导致上皮屏障功能障碍；以肠上皮屏障功能为例来观察gal-1缺陷时对肠粘膜内稳态的影响；检测gal-1缺失对肠上皮屏障功能的影响；分析、比较gal-1缺陷小鼠和正常小鼠的实验结果。

(4)用食物过敏动物模型测试gal-1在肠粘膜免疫耐受诱导中的作用

首先给gal-1缺陷小鼠和正常小鼠口服抗原(卵白蛋白，ova)，诱导肠粘膜的免疫耐受。然后使肠粘膜致敏(建立食物过敏小鼠模型)。测定的指标除了肠粘膜过敏指标(包括速发性和迟发性过敏反应指标)之外，还要测定和免疫耐受有关的指标；分析、比较gal-1缺陷小鼠和正常小鼠的实验结果，另外，观察外源性gal-1在诱导免疫耐受中的作用，在实验中加用外源性gal-1，观察外源性gal-1诱导免疫耐受的作用。

本发明的实施例的gal-1抑制肠道过敏反应的机制，观察到抑制肠道gal-1肥大细胞活化的影响。gal-1的管理显着降低肥大细胞计数在肠道组织(图3)。取小鼠血清进行elisa分析。结果表明，血清组胺，肥大细胞活化的标志物，明显增强小鼠特异性抗原致敏，并通过处理gal-1明显减少(图4)。

图5的数据表明，gal-1防止特异性抗原ova，结合致敏肥大细胞在致敏小鼠小肠。为了测试这一点，产生的骨髓源性肥大细胞(bmmcs)被准备ova特异性ige抗体；细胞分别在文化接触到卵子或卵/gal-1。正如预期的那样，暴露于ova诱导的肥大细胞活化明显表现在β-释放妖术到培养液中，而暴露于ova/gal-1没有。结果显示gal-1可以结合ige/fcεri复合体对致敏肥大细胞表面防止特异性抗原ova对配合物。为了测试这一点，从培养细胞收集；制备了bmmcs的细胞提取物的免疫共沉淀分析。结果表明，一个复杂的卵/ige/fc从暴露于ova的肥大细胞提取物中检测到εri。由于有丝分裂原活化蛋白激酶(mapkp38)和核因子(nf)-κb参与肥大细胞活化(25)，检查了mapk的水平，κb，nf-κb在bmmcsκ。结果表明，暴露于特定的抗原水平升高，卵，mapk和nf-κbκ降低致敏的人κb水平。结果表明，致敏小鼠的cd4+cd25+调节性t细胞频率明显低于对照组。

gal-1提高疗效的坐在肠道的过敏反应，建立了ova和ct(霍乱毒素，sigmaaldrich)的食物过敏模型。从5周，致敏小鼠坐或/和gal-1处理。治疗1周后，用特异性抗原ova致小鼠免疫，第二天处死小鼠，观察肠道过敏反应。结果表明：坐便组小鼠体重明显下降。在gal-1/小鼠坐组体重constantlysimilar向天真的对照小鼠。小鼠不降体重gal-1。单核细胞大量浸润，肥大细胞和eosinophilsin在坐组观察肠粘膜，这是明显不与gal-1/小鼠坐治疗。血清组胺，肥大细胞脱颗粒的标志物，在坐组明显高于的gal-1/坐组。肠上皮细胞屏障通透性葡聚糖在gal-1/坐组也比在坐组明显减少。此外，对ova致敏小鼠gal-1/坐以及抗cd25抗体(抑制treg细胞)；事实上，在小鼠肠道过敏反应相似，患者独自坐。与gal-1/治疗坐抑制特定ige的血清水平，提高血清特异igg4，抑制血清il-4、减少全身性过敏反应，包括核心温度下降、腹泻和诱导抗原特异性调节性t细胞，未完成治疗小鼠无论是独自坐或gal-1单独gal-1/坐治疗延长在肠道过敏反应的抑制作用确定有效抑制gal-1/坐在肠道过敏反应持续更长的时间，用ova致敏小鼠/ct，与坐或/和gal-1两周的小鼠。小鼠在常规生活状态下维持12个月。然后通过灌胃给小鼠特异性抗原ova，并于24小时后处死小鼠。如上述程序所分析，单独治疗的小鼠在肠道内表现出明显的过敏反应，血清组胺、特异性ige和血清il-4水平升高，核心温度下降，并出现腹泻。与gal-1/小鼠坐治疗显示在肠道无明显的过敏反应，检测不到血清ige和无全身过敏反应后ova的挑战，而采用gal-1的小鼠有类似的结果，采用独坐。具体的tregs与gal-1/小鼠检测坐治疗。消除tregs废除免疫治疗的效果。结果表明，与传统的坐，坐的gal-1治疗可抑制肠道过敏反应，可以持续至少一年。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。