一种人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的制备方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及基因工程和生物工程技术，尤其是涉及一种人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的制备方法及包括根据该制备方法制得的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的检测试剂盒。

背景技术：

自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis，aih)属于自身免疫性肝病(autoimmuneliverdisease，ald)中的一种。aih是一种特发性累及肝脏实质的非化脓性炎症性肝病，以女性多见。具有血清转氨酶升高明显，高γ球蛋白血症，出现循环自身抗体为特点，且常伴有其他自身免疫性疾病，如桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、肾小球肾炎等。它主要包括4种自身抗体：抗核抗体(ana)、抗平滑肌抗体(sma)、抗肝肾微粒体i型抗体(抗lkm-1)和抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(抗sla/lp)。

虽然aih存在多种自身抗体，但多数自身抗体并不是aih特异性抗体。抗sla/lp(solubleliverantigen/liverpancreas)抗体为少数公认的高特异性aih自身抗体，在aih所有相关抗体中最具有诊断价值。抗sla/lp抗体为aih-ⅲ型的血清学标志，临床上常用于aih的诊断和鉴别诊断。抗sla/lp抗体在aih中的阳性率为10％-30％，阳性患者多为年轻女性，多伴有高免疫球蛋白血症。

本案发明人发现目前市售的抗sla/lp抗体的检测试剂盒灵敏度低，且结果不稳定，经过进一步的试验研究发现直接购买的重组sla/lp抗原融合蛋白会因批间差等因素缺少稳定性，在使用的过程中容易产生沉淀，导致检测试剂盒使用效果较差。因此，开发一种能够高效制备出稳定、纯度高的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的方法十分迫切，有助于后续诊断试剂的开发。

技术实现要素：

有鉴于此，为了达到上述目的，本发明提供了一种人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的制备方法，该方法不仅产率高，而且得到的抗原融合蛋白稳定、纯度高。

为了达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)人工合成人可溶性肝抗原/肝胰抗原基因到表达载体pet-21a(+)上，形成重组载体pet-21a(+)/humansla/lp；

2)所述重组载体经转化后进入大肠杆菌bl21中形成表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp；

3)挑选表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp进行人可溶性肝抗原/肝胰抗原基因融合表达，收集菌体；

4)利用亲和层析方法进行纯化，获得人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白。

优选地，步骤2)中所述转化采用化学转化中的热激法。

进一步优选地，步骤2)中表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp制备步骤包括：在大肠杆菌bl21中加入所述重组载体pet-21a(+)/humansla/lp和重蒸水，经热激后冰浴；之后加入lb培养基，进行温育以使细菌复苏，再离心后弃去上清液，细胞重悬，得到重组质粒转化产物；接着将重组质粒转化产物和阴性对照样本涂布于含有氨苄青霉素的平板上；倒置培养皿，培养过夜，得到表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp。

优选地，步骤3)中的人可溶性肝抗原/肝胰抗原基因融合表达步骤为：挑取所述表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp的单菌落至含氨苄青霉素的lb培养基中过夜培养；再取培养后的菌液加入到含氨苄青霉素的lb培养基中，培养至od600＝0.6；向培养好的菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，培养诱导后离心，收集菌体。

优选地，步骤4)中所述利用亲和层析方法进行纯化为采用镍柱对人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白进行纯化。

进一步优选地，步骤4)中人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的纯化步骤为：在步骤3)收集的菌体中加入细菌裂解缓冲液和苯甲基磺酰氟，悬浮混匀之后，在冰浴条件下进行超声破碎，离心后收集沉淀，加入结合缓冲液，混匀后超声破碎，离心后收集包涵体上清并进行纯化；平衡柱子的工作温度后用结合缓冲液平衡柱子，从柱子上部加入收集到的上清液，收集上样流出液，且让上样流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力；用漂洗缓冲液洗涤树脂并收集漂洗流出液，重复该步骤，直至漂洗流出液的吸光度稳定在280nm基线处，以除去杂质蛋白；用洗脱缓冲液将his标签蛋白从树脂上洗脱下来并收集洗脱流出液，重复此步骤，直至洗脱流出液的吸光度稳定在280nm基线处，收集人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白。

优选地，所述步骤还包括人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的sds-pag和bca蛋白浓度检测，步骤为：分别取步骤4)中收集的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白与上样缓冲液混匀，在金属浴中煮沸，离心后上样，在电泳条件下运行，然后在凝胶成像仪中，检测人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的表达。

优选地，所述步骤还包括人可溶性肝抗原/肝胰抗原基因融合的阴性血清和阳性血清的蛋白质印迹法分析：取纯化后的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白，经sds-page电泳并电转移，脱脂奶粉封闭后，分别取人可溶性肝抗原/肝胰抗原的阴性血清和阳性血清孵育后，清洗，然后用碱性磷酸酶偶联鼠抗人igg的二抗孵育，再次清洗，显影后检测人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白。

进一步优选地，所述显影为采用氯化硝基四氮唑蓝显色液与暗室自显影。

本发明还提供了一种抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体igg的检测试剂盒，包括抗原试剂，所述抗原试剂包括偶联有生物素的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白，所述人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白为根据上述人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的制备方法所制得的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白。在具体的实施例中，该检测试剂盒包括偶联有生物素的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的抗原试剂、碱性磷酸酶标记的抗人igg的抗体试剂、磁微粒分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品、清洗液等。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明的一种人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的制备方法，该方法不仅产率高，而且得到的抗原融合蛋白稳定、纯度高。

附图说明

图1为实施例五中人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白纯化前后的电泳图；

图2为实施例六中人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的免疫印迹图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明优选的实施方式进行详细说明。

以下实施例中，原核表达系统为大肠杆菌bl21，表达载体为pet-21a(+)，大肠杆菌bl21和表达载体均购自invitrogen公司。培养基为由1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％nacl组成的lb培养基，ph为7.0。

生化试剂：piercebcaproteinassaykit购自thermofisher公司，pmsf(苯甲基磺酰氟)购自merck公司，precisionplusprotein标准品和readygeltris-hcl预制胶均购自bio-rad公司。

实施例一人可溶性肝抗原/肝胰抗原基因人工合成

原核表达载体是具有多克隆位点且可通过多个调控原件在原核表达系统进行调控表达外源基因的分子生物学载体。使用时不限制选择使用的常规载体，本实施例选择使用pet-21a(+)载体。

根据genbank已公开的人sep(o-phosphoserine)trna：sec(selenocysteine)trnasynthase的mrna序列(genbank序列登录号：bc117202)见序列表1，氨基酸序列见序列表2。可溶性肝抗原/肝胰抗原基因经优化后由人工直接合成到表达载体pet-21a(+)上，形成重组载体pet-21a(+)/humansla/lp。

实施例二表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp制备

原核表达系统是可以表达外源基因的原核细胞，使用时不限制使用宿主细胞，本实施例选择使用大肠杆菌bl21。

转化方法是指可以促使外源基因进入宿主细胞的方法，包括化学转化和物理转化方法。本实施例采用化学转化中的热激法。

具体的步骤为：

1.取出制备好的大肠杆菌bl21感受态细胞，放在冰水上融化。

2.之后在每100l感受态细胞加入上述重组载体pet-21a(+)/humansla/lp10μl或ddh2o1μl(阴性对照样本)，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30min。

3.将含有上述物质的离心管放置于42℃水浴中热激90s后快速将离心管转移至冰浴，放置2min。

4.之后在每根离心管中加入500μllb培养基，在37℃摇床温和250rpm摇动下温育1h，使细菌复苏，4000rpm离心3min，弃去约500μl上清，细胞重悬，得到重组质粒转化产物。

5.将重组质粒转化产物100μl、阴性对照样本100μl，均匀涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的平板上。

6.倒置培养皿，37℃下培养过夜，得到表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp。

实施例三人可溶性肝抗原/肝胰抗原基因融合表达

挑取表达菌株bl21-pet21a(+)-sla/lp单菌落至6ml含100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb培养基中，37℃、250rpm条件下过夜培养；取5ml菌液加入到500ml含amp的lb中，37℃、250rpm条件下培养至od600＝0.6；向上述培养好的菌液中加入终浓度为1mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，于37℃、180rpm条件下培养诱导4h，之后10000rpm离心5min，收集菌体。

实施例四人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的纯化

纯化是指利用蛋白的物理性质经色谱柱进行亲和纯化，从而获得较高纯度的蛋白。本实施例采用镍柱对目的融合蛋白进行纯化，具体的步骤为：

1.加入20-30ml细菌裂解缓冲液(50mmtris，10％glycerol，0.1％tritonx-100，100ug/mllysozyme，ph8.0)至上述收集的菌体中，且以1：1000比例加入适量的苯甲基磺酰氟(pmsf)，悬浮混匀之后，在冰浴条件下进行超声破碎(工作5s，间隙10s，输出功率550w)，在4℃、9500rpm条件下离心20min，收集上清液进行纯化。

2.同时向上述离心后得到的沉淀加入20ml含有8m尿素的结合缓冲液(bindingbuffer)(20mmtris-hcl，10mm咪唑，ph8.0)，混匀后超声破碎(工作5s，间隙10s，输出功率250w，冰浴)，离心收集包涵体上清液，并进行纯化。

3.平衡柱子的工作温度，在室温下进行纯化。

4.用3倍树脂体积的结合缓冲液(bindingbuffer)平衡柱子，以0.5ml/min的流速过柱。

5.从柱子上部加入样品，且让上样流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。

6.用3倍树脂体积的漂洗缓冲液(washingbuffer)(20mmtris-hcl，50mm咪唑，ph8.0)洗涤树脂并收集漂洗流出液；重复该步骤，用新的收集管收集漂洗流出液，直至漂洗流出液的吸光度稳定在280nm基线处，此步骤是为了除去杂质蛋白。

7.用3倍树脂体积的洗脱缓冲液(elutingbuffer)(20mmtris-hcl，500mm咪唑，ph8.0)将his标签蛋白从树脂上洗脱下来并收集洗脱流出液；重复此步骤，直至洗脱流出液的吸光度稳定在280nm基线处，收集人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白。

步骤1和2是为了确定人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白在离心后的上清液中还是沉淀中，进一步的研究(即实施例五)发现目标融合蛋白在沉淀中，所以在后续的生产制造中直接收集离心后的沉淀即可，上清液可舍弃。

实施例五人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的sds-pag和bca蛋白浓度检测

分别取实施例四中收集的样品各30ul与10ul上样缓冲液(4×蛋白sds上样缓冲液)混匀，在金属浴中99℃煮沸5min，10000rpm离心30s后上样，在180v电泳条件下运行约30min；在凝胶成像仪中，检测人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的表达，见图1，图中i表示包涵体，p表示诱导后且纯化前样品，f表示上样流出液，w表示漂洗收集液，e1-4表示洗脱收集液。经检测发现，人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白可以在原核系统中表达，且通过纯化从包涵体上清中得到90％以上纯度的目的蛋白(理论分子大小约55kd)。

采用piercebcaproteinassaykit测定洗脱组分(e1-e3)中目的蛋白的浓度，结果见表1。

表1bca测定可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白

由上表可知，500ml诱导表达量可获得近4mg较高纯度的sla/lp融合蛋白。

实施例六人可溶性肝抗原/肝胰抗原基因融合的阴性血清和阳性血清蛋白质印迹法(westernblot)分析

取纯化后的蛋白经sds-page电泳并电转移至聚偏氟乙烯(pvdf)膜，5％脱脂奶粉封闭2h后，分别去取人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白阴性血清和阳性血清孵育1h后，清洗液清洗3次，每次5min，然后用碱性磷酸酶(ap)偶联鼠抗人igg的二抗孵育后，清洗液清洗3次，每次5min，用氯化硝基四氮唑蓝(nbt)显色液与暗室自显影，检测人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的表达，见图2，图中e-n表示阴性血清检测纯化后的sla/lp，e-p表示阳性血清检测纯化后的sla/lp，p-p表示阳性血清检测诱导表达前的菌体裂解液。由此可知，该原核系统中表达且纯化出的蛋白是预期所需的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白。

实施例七人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的功能性平台验证

取实施例四中制备的可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白与市售的可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白按同样的工艺偶联生物素，并配制成相应的试剂盒，试剂盒包括偶联有生物素的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白的抗原试剂、碱性磷酸酶标记的抗人igg的抗体试剂、磁微粒分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品、清洗液等。用两种试剂盒同时检测临床收集的256份血清(有欧蒙elisa检测结果)，结果如表2和表3所示。

表2重组sla/lp制备试剂检测结果

表3市售sla/lp制备试剂检测结果

由表2和表3可知，实施例四中重组的可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白所制成试剂盒的检测灵敏度96.49％(55/57)及特异性97.99％(195/199)较市售可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白所制成试剂盒的灵敏度91.23％(52/57)和特异性95.48％(190/199)有明显的提升。

实施例八稳定性对比

对实施例四纯化后的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白和市售的可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白所制成的试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的稳定性实验，结果见下表。

表4稳定性对比数据

从上表数据可以看出实施例四纯化后的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白所制备的试剂盒标准品发光强度的变化等指标均在正常范围之内且优于市售的试剂盒，表明实施例四纯化后的人可溶性肝抗原/肝胰抗原融合蛋白所制备的试剂盒的稳定性优异。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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<110>苏州浩欧博生物医药有限公司

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