一种调控作物农艺性状的方法及获得转基因作物的方法与流程

文档序号：11767666阅读：519来源：国知局

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种调控作物农艺性状的方法及获得转基因作物的方法。

背景技术：

玉米(zeamaysl.)是世界粮食作物中产量最高的谷类作物，增产潜力巨大，在农业中有极其重要的地位。玉米株高和叶片数农艺性状是玉米理想株型设计的重要组成部分，在提高玉米产量方面发挥至关重要的作用。

玉米株型是主要的综合农艺性状，直接影响玉米的种植密度，进而影响产量和经济效率，适当的株高是玉米理想株型设计的一个重要指标。农业生产史上，农作物整体株高的降低对世界农业产生了深远的影响，上世纪七十年代小麦和水稻矮杆绿色革命的爆发显著提高了世界粮食产量。玉米中相关统计数据表明：机械化收割和耐密性的改良对玉米增产的贡献远高于单株产量的增加，矮秆、早熟和适合于密植的玉米新品种培育与推广已经成为未来大农业时代的主流发展方向。玉米株高受环境因素的影响较大，但主要还是受遗传因素决定。

株高、叶片数和叶片分布形态是设计理想株型玉米最重要的因素之一；玉米穗的穗长、穗行数、行粒数等都是跟产量密切相关的性状，而这些性状又和遗传因素密切相关。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种调控作物农艺性状的方法；通过该方法可以调控和农作物的产量。

本发明的第二目的在于提供一种基获得转基因作物的方法，该获得转基因作物的方法，能够制备获得性能和性状优异的转基因作物。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种调控作物农艺性状的方法，调控作物zmcol3基因表达，实现调控农作物农艺性状。

一种获得转基因作物的方法，包括：将zmcol3基因或zmcol3基因组序列连接到表达载体，得到转化载体，并将转化载体转移到宿主菌，得到转化宿主菌，然后将转化宿主菌侵染农作物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的一种调控作物农艺性状的方法，通过调控zmcol3基因的表达，实现调控农作物性状的目的；通过获得转基因作物的方法育种获得的基因工程植物，具有较为优异的农艺性状，可以提高农作物的产量；可以在一定程度上满足粮食自给率，还能增加农户的收入，保障粮食安全；具有较高的实际应用价值和推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1提供的zmcol3-a基因过表达载体示意图；

图2为本发明实验例2提供的转基因玉米中zmcol3-a基因相对表达水平分析图；

图3为本发明实验例2提供的转基因玉米阳性材料与阴性材料植株表型对比图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种调控作物农艺性状的方法及获得转基因作物的方法进行具体说明。

一种调控作物农艺性状的方法，调控作物zmcol3基因表达，实现调控农作物农艺性状。

进一步地，zmcol3基因的碱基序列如seqidno.1所示。

进一步地，zmcol3基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，zmcol3基因包括zmcol3基因组序列，zmcol3基因组序列的碱基序列如seqidno.3所示。

进一步地，调控为正向调控。

通过正向调控基因的表达，达到调控农作物农艺性状的目的。

进一步地，农艺性状包括株高、叶片数和产量性状。

一种获得转基因作物的方法，将zmcol3基因或zmcol3基因组序列连接到表达载体，得到转化载体，并将转化载体转移到宿主菌，得到转化宿主菌，然后将转化宿主菌侵染农作物。

进一步地，宿主菌为农杆菌。

进一步地，农作物为单子叶植物。

进一步地，单子叶植物为玉米。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种zmcol3基因或zmcol3基因组序列克隆的方法及载体的构建。

将具有遗传多样性的、田间实验中表现出良好适应性的368份自交系分别种植于海南、云南、四川、广西、重庆、河南、湖北、北京和吉林省等多个不同纬度，不同日照时间的地点；采集不同种植地的自交系样本三到六叶期幼嫩叶片，并提取基因组dna，进行全基因组关联分析gwas(genome-wideassociationstudy)。发现zmcol3基因组序列与玉米的开花期相关。

克隆得到zmcol3基因组序列，zmcol3基因组序列的碱基序列如seqidno.3所示；获得zmcol3基因组序列的编码序列zmcol3基因，zmcol3基因的碱基序列如seqidno.1所示；zmcol3基因编码的含cct结构域的转录因子的氨基酸序列如seqidno.2所示。

zmcol3基因过表达载体的构建

1.1人工合成zmcol3基因组序列(命名为zmcol3-a)，并且在zmcol3基因组序列的两端引入saci和spei酶切位点；将引入酶切位点的zmcol3基因组序列克隆到puc57载体上，得到puc57：：zmcol3-a重组载体，经过菌落pcr和测序验证，序列无突变；

1.2用saci和spei分别双酶切puc57：：zmcol3-a重组载体和pcambia3300-zmubi载体；并分别回收双酶切片段；

1.3用连接酶连接回收的双酶切片段；得到zmcol3基因组序列的过表达重组载体pcambia3300-zmubi：：zmcol3-a的载体质粒。

过表达重组载体pcambia3300-zmubi：：zmcol3-a的结构示意图参见图1。

实施例2

本实施例提供zmcol3基因组序列的过表达重组载体pcambia3300-zmubi：：zmcol3-a的遗传转化。

过表达重组载体pcambia3300-zmubi：：zmcol3-a转化农杆菌及阳性克隆鉴定

1.1取200μl农杆菌感受态，加入1-2μl质粒dna，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水；浴5min，加入800μlyep培养基；

1.2在28℃条件下，100rpm恢复培养3h，5000g离心1min，弃上清；

1.3加入100μlyep培养基；重悬菌体，涂布于含相应抗生素的yep平板上，28℃，培养36-48h；

1.4挑取单菌落于5mlyep培养基(含相应抗生素)中，28℃，200rpm培养48h后，提取质粒dna，进行pcr和酶切验证。验证正确的单克隆进行保菌，用于后续的实验。

农杆菌侵染玉米幼胚及植株再生

2.1取适量含目的载体的农杆菌eha105菌体悬浮于yep液体培养基中，28℃，震荡培养，使菌处于对数期；3000rpm离心10min弃上清，菌体用n6液体培养基洗涤，离心收集菌体并用含有100mm乙酰丁香酮的n6液体培养基悬浮菌体，调整od550在0.3左右；

2.2剥离授粉后9-12天的hiii幼胚，幼胚直径1.5-2.0mm；经诱导形成胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织浸于菌体悬浮液5min，取出并沥干菌液；

2.3将胚性愈伤组织转移至共培养基，28℃黑暗培养3天；

2.4三天后将胚性愈伤组织转移到静息培养基上，28℃黑暗培养7-10天；

2.5静息培养后，将胚性愈伤组织转移到含有双丙氨膦的筛选培养基中，28℃黑暗培养，每两周继代一次，直至上筛选出抗性愈伤组织；

2.6将抗性愈伤组织转移至分化培养基，再生植株，然后炼苗移栽；获得4个成功转化的转化事件(1-4、1-39、26-12和29-5)，然后收获种子。

待移栽大田的转基因苗长至7-8片叶时，取叶片提取dna，采用pcr技术进行检测，测得zmcol3基因的表达量显著提高。

实施例3

本实施例对实施例2获得转基因玉米材料进行农艺性状调查。

转基因玉米材料在短日照条件下株高等田间农艺性状的调查

2016年冬季和2017年春季，转基因玉米实验材料在海南省进行播种。所有试验遵循正常田间生产方式统一管理。所有田间试验遵循正常大田生产方式统一管理。株高的调查玉米种子成熟后从植株最高的穗顶到地面的距离；叶片数量调查玉米种子成熟后整株叶片数、主穗位上叶片数和主穗位下叶片数；茎节数调查玉米种子成熟后整株茎节数、主穗位上茎节数、主穗位下茎节数。

参见图2，柱状图代表zmcol3-a转基因植株，红色柱状图代表非转基因对照；1-39、1-4、26-12和29-5代表独立的阳性转化事件；不同转化事件随机选择的阴性和阳性单株转录水平检测结果表明：zmcol3-a稳定导入玉米中，且表达量显著增加；代表性的株系如图3所示；“+”代表zmcol3-a阳性转化事件，“-”代表非转基因对照；a图是长日照条件下2016年吉林省公主岭大田条件下的开花时株系比较图；b图是长日照条件下2016年吉林省公主岭大田条件下的玉米植株开花后株高比较图；c图是长日照条件下2016年吉林省公主岭大田条件下的雄穗和雌穗比较图；d图是长日照条件下2016年吉林省公主岭大田条件下茎节数比较图。可以从图3d明确看出，zmcol3-a基因的转基因玉米的株高和穗位明显高于非转基因的对照组。

zmcol3-a过表达的转基因植株的zmcol3-a基因表达量在一定程度上与株高、穗位高呈正相关。

表1短日照条件下转基因玉米与非转基因对照田间农艺性状调查

bc2f2表示对应的回交2代再自交2代获得的群体，bc3f1表示回交3代再自交1代获得群体

从表1可以看出，2016年冬季海南省短日照条件下株高、穗位高穗上茎数和高穗下茎数等田间农艺性状调查结果表明：短日照条件下：zmcol3-a过量表达1-4转化事件相比对照，株高增加约15厘米，穗位高增加约12厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约0.5个；zmcol3-a过量表达26-12转化事件相比对照，株高增加约17厘米，穗位高增加约12厘米穗下茎节数(叶片数)增加约0.9个。

2017年春季海南省短日照条件下株高等田间农艺性状调查结果表明：短日照条件下：zmcol3-a过量表达1-39转化事件相比对照，株高增加约4.5厘米，穗位高增加约12厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约1.3个；zmcol3-a过量表达29-5转化事件相比对照，株高增加约14厘米，穗位高增加约14厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约1.8个。

从表1可以看出；过表达zmcol3-a基因，转基因玉米在短日照条件下株高、穗位高穗上茎数和高穗下茎数增加，两者表现出明确的正相关关系。

转基因玉米材料在长日照条件下株高等田间农艺性状的调查

2016年所有田间实验材料在吉林省公主岭市进行播种。播种时间为5月初；所有田间试验遵循正常大田生产方式统一管理。

株高的调查：玉米种子成熟后从植株最高的穗顶到地面的距离；叶片数量调查：玉米种子成熟后整株叶片数、主穗位上叶片数和主穗位下叶片数；茎节数调查玉米种子成熟后整株茎节数、主穗位上茎节数、主穗位下茎节数；产量相关性状依据正常大田测试标准进行。

长日照条件下转基因玉米的农艺性状调查结果见表2。

表2长日照条件下转基因玉米田间农艺性状调查结果

bc1f1表示对应的回交1代再自交1代获得的群体，bc3f1表示回交3代再自交1代获得群体

从表2的结果可以看出，长日照条件下：zmcol3-a过量表达1-39转化事件bc1f1世代相比对照，株高增加约11厘米，穗位高增加约23厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约1.2个；zmcol3-a过量表达29-5转化事件相比对照，株高增加约14厘米，穗位高增加约14厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约1.8个，总穗下茎节数(叶片数)增加约1.6个；zmcol3-a过量表达1-39转化事件bc2f1世代相比对照，株高增加约23厘米，穗位高增加约13厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约0.9个，总穗下茎节数(叶片数)增加约1.4个；zmcol3-a过量表达1-4转化事件相比对照，株高增加约30厘米，穗位高增加约20厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约1个，总穗下茎节数(叶片数)增加约1.5个；zmcol3-a过量表达26-12转化事件相比对照，株高增加约16厘米，穗位高增加约16.5厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约1.1个，总穗下茎节数(叶片数)增加约1.5个；zmcol3-a过量表达29-5转化事件相比对照，株高增加约23厘米，穗位高增加约18厘米，穗下茎节数(叶片数)增加约1.1个，总穗下茎节数(叶片数)增加约1.1个。

转基因玉米产量相关性状的田间调查

转基因玉米的产量相关性状包括每穗穗轴重(g)、每穗粒重(g)、百粒重(g)、容重(g/l)、穗长(cm)、穗直径(mm)、穗行数、行粒数、穗轴直径(mm)、粒长(mm)、粒宽(mm)和粒厚(mm)等。

产量性状田间调查结果见表3。

表3转基因玉米的产量性状调查结果

从表3可以看出，zmcol3-a过量表达1-39转化事件相比对照，每穗穗轴重(g)、每穗粒重(g)、百粒重(g)、容重(g/l)、穗直径(mm)、粒长(mm)等产量性状明显增加；zmcol3-a过量表达1-4转化事件相比对照，每穗穗轴重(g)、每穗粒重(g)、容重(g/l)、穗长(mm)等产量性状明显增加；zmcol3-a过量表达26-12转化事件相比对照，每穗穗轴重(g)、每穗粒重(g)、容重(g/l)、穗长(mm)、行粒数等产量性状明显增加。

从表3可以看出；过表达zmcol3-a基因，转基因玉米的产量相关性状都有一定程度的提高，两者表现出明确的正相关关系。

综上所述，本发明实施例提供的zmcol3-a基因，在过表达的情况下，能提高玉米的株高、穗位高等农艺性状，在一定程度上可以增大玉米的生物质产量；同时过表达zmcol3-a基因也能提高玉米的产量性状，由于产量性状与玉米的产量密切相关，所以本发明提供的zmcol3-a基因具有较高的实用性和较高的推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

sequencelisting

<110>吉林省农业科学院

<120>一种含有cct结构域的转录因子及其编码基因、载体、宿主菌和应用

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>335

<212>prt

<213>zeamays

<400>1

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151015

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354045

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859095

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130135140

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145150155160

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210215220

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245250255

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260265270

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290295300

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305310315320

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325330335

<210>2

<211>1008

<212>dna

<213>zeamays

<400>2

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<212>dna

<213>zeamays

<400>3