赤霉菌NT‑1及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种赤霉菌(gibberellasp.nt-1)及其在cu²⁺吸附去除中的应用。

背景技术：

果林业生产中由于大量施用波尔多液等含铜杀菌剂，造成铜在果园土壤中的大量累积，而肥料和农药的不当施用以及长年种植果树引起的果园土壤酸化则会进一步增加土壤中铜的生物有效性，增加果树吸收富集铜的风险，降低果品的产量和质量，进而威胁人体健康。果园酸化和铜复合污染土壤的微生物修复技术中首要解决的问题是筛选对复合污染具有较高耐性和吸附能力的微生物菌株。尽管已有研究分离鉴定了一些对重金属铜具有一定耐性和吸附性能的菌株，但这些菌株大多对酸度的耐性较差，无法在酸化与重金属复合污染的果园土壤中生长。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种赤霉菌(gibberellasp.nt-1)及其在cu²⁺吸附去除中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种赤霉菌(gibberellasp.nt-1)，赤霉菌为串珠状赤霉(gibberellamoniliformis)，已于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：cgmccno.13888。

所述赤霉菌(gibberellasp.nt-1)在马铃薯葡萄糖固体培养基上生长迅速，菌落呈较规则圆形、边缘整齐、质地为丝绒状，与培养基结合较为紧密。28℃下培养3d时直径即可达到56～58mm，菌落呈乳白或淡黄色，中心稍突起(图1a)；培养至7d时，菌丝已接近布满整个平板，并开始产红褐色色素，菌落中心也变为淡红色(图1b)。

一种赤霉菌(gibberellasp.nt-1)的应用，所述赤霉菌(gibberellasp.nt-1)在去除cu²⁺中的应用。

具体为：将赤霉菌(gibberellasp.nt-1)接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养至对数期；将培养至对数生长期的菌悬液接入至含cu²⁺的环境中震荡培养，即实现吸附去除环境中的cu²⁺；该菌株nt-1对溶液中cu²⁺的吸附去除率可达45.6％。

所述培养至对数期赤霉菌(gibberellasp.nt-1)接入至酸性的含cu²⁺的环境中震荡培养，即实现吸附去除环境中的cu²⁺。

所述震荡培养条件为28℃、150rpm振荡培养。所述酸性为ph值为5.0。

一种铜离子去除剂，去除剂为赤霉菌(gibberellasp.nt-1)的菌悬液。

所述赤霉菌(gibberellasp.nt-1)的菌悬液为将赤霉菌(gibberellasp.nt-1)接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养至对数期。

本发明所具有的优点：本发明从长期种植苹果并喷施含铜农药波尔多液的果园土壤中分离、筛选出赤霉菌nt-1(gibberellasp.nt-1)，该菌株具有较强的耐酸、耐铜和cu²⁺吸附去除能力，该菌在酸性条件下对cu²⁺吸附去除的效应，为进一步研发酸化和铜复合污染果园土壤的生物修复提供了新资源和新思路，具有十分广泛的应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例提供的nt-1菌落形态特征，其中：a：培养至3d；b：培养至7d；

图2为本发明实施例提供的nt-1菌丝和孢子的光学显微照片，其中：a：物镜为40倍；b：物镜为100倍；

图3为本发明实施例提供的菌株nt-1的系统发育树；

图4为本发明实施例提供的菌株nt-1的生长曲线；

图5为本发明实施例提供的不同因素对铜吸附去除率的影响；其中：a：ph的影响；b：温度的影响；c：接种量的影响；d：初始cu²⁺浓度的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

本发明菌株具有较强的耐酸、耐铜特性和铜吸附能力，在28℃、ph5.0、初始cu²⁺浓度为200mgl^-1时，5d内对溶液中cu²⁺的吸附去除率可达45.6％。该菌株在酸化和重金属铜复合污染土壤的生物修复中具有很好的应用前景。

实施例1：耐铜菌株nt-1的分离与鉴定

(1)耐铜菌株nt-1的分离与筛选

本发明的菌株nt-1是从长期种植苹果并喷施含铜农药波尔多液的果园土壤中分离、筛选出的。分离的培养基为基础培养基(马铃薯葡萄糖培养基)和铜选择培养基(将cuso4·5h2o配成cu²⁺浓度为10gl^-1的贮备液，分别加入牛肉膏蛋白胨基础培养基和马铃薯葡萄糖基础培养基中，调节至所需铜浓度)。固体培养基是在液体培养基中加入20gl^-1琼脂。

分离筛选步骤：取5g新鲜土样于装有50ml无菌水的三角瓶中振荡20min，制成土壤浸提液。将浸提液逐级稀释至10^-3、10^-4、10^-5后，分别取0.1ml涂布于含铜离子浓度为200mgl^-1的选择培养基，28℃培养2d后，挑选单菌落重新划线分离后继续培养，最后选取生长速度相对较快、菌落特征典型的菌进一步纯化。将筛选出的长势较好的菌株继续加入到含铜离子浓度为200mgl^-1的铜选择培养基中，培养5d后离心取上清液，测定其中铜离子含量，比较其铜去除率，以筛选出铜耐受能力高、铜去除率高的菌株，作为目的菌株。

通过所述的分离与筛选工作，获得一株生长速度快、铜耐受性高、对铜去除率高的菌株nt-1，具有良好的应用前景。

(2)菌株的形态学与分子生物学鉴定

将筛选到的耐铜真菌接种于马铃薯葡萄糖平板，置于28℃恒温培养箱中培养1周，观察真菌菌落的生长特征，采用插片法在显微镜下观察菌丝的形态及其分生孢子的着生方式。提取耐铜菌株的基因组dna，依据真菌its1-5.8s-its4区域中保守序列设计并合成引物(正向引物its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；反向引物its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3')进行pcr扩增。pcr扩增体系(50μl)条件为：模板dna5μl，mix(2×)25μl，引物its12μl，引物its42μl，ddh2o16μl。pcr反应条件：94℃2.5min，94℃30s；57℃1min；72℃1.5min，循环35次；72℃延伸3min。对扩增产物进行电泳检测，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将所得的序列与ncbi数据库中已有its基因序列进行blast分析，并选取同源性相近的菌株，采用mega6.0软件构建系统发育树。

nt-1在马铃薯葡萄糖固体培养基上生长迅速，菌落呈较规则圆形、边缘整齐、质地为丝绒状，与培养基结合较为紧密。28℃下培养3d时直径即可达到56-58mm，菌落呈乳白或淡黄色，中心稍突起(图1a)；培养至7d时，菌丝已接近布满整个平板，并开始产红褐色色素，菌落中心也变为淡红色(图1b)。

用插片法在光学显微镜下观察菌丝的生长状况，结果表明，菌丝细长有分支，且呈不对称分支；分生孢子梗发生于基质。分生孢子有两种形态，小型分生孢子为卵圆形，结构紧凑，着生于单生瓶梗上，在瓶梗顶端聚成球团，颜色较深(图2a)；大型分生孢子为纺锤形，数量较多，着生于菌丝分枝处(图2b)。

将nt-1的测序结果在ncbi数据库进行blast比对分析，发现菌株nt-1与串珠状赤霉菌gibberellamoniliformis(genbank登录号jf499676.1)的相似性为100％，结合nt-1菌株的形态学特征，初步将菌株nt-1鉴定为赤霉菌属真菌(gibberellasp.nt-1)。图3该菌株的系统发育树。

实施例2：耐铜菌株nt-1生长曲线的测定

采用干重法，吸取1ml新鲜的菌株种子液，接种于含有50ml马铃薯葡萄糖液体培养液的三角瓶中，28℃、150rpm恒温培养，每隔8h取出3个平行样品进行抽滤，将抽滤后的菌丝置于80℃的烘箱中烘干至恒重并称重，绘制生长曲线。

菌株nt-1的生长曲线如图4所示。在28℃、150rpm的条件下，nt-1接种8h后就进入了对数生长期，并于96h后进入稳定期。

实施例3：菌株nt-1对不同浓度铜胁迫的耐性特征与生理响应

挑取一环nt-1菌丝接种于含cu²⁺浓度分别为100、200、300、400、500和600mgl^-1的马铃薯葡萄糖固体培养基上，置于28℃的恒培养箱中培养5d，观察菌丝在固体平板上的生长情况，测量并记录菌落直径。

将菌株nt-1的种子液接种于含cu²⁺浓度分别为100、200、300、400、500和600mgl^-1的马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于28℃、150rpm的恒温振荡器中培养5d，观察菌株在液体培养基中的生长情况，将菌液离心后于80℃烘干至恒重，测量并记录菌丝生物量干重。

由表1可知，培养5d时，nt-1在含cu²⁺浓度超过300mgl^-1平板上的生长受到显著抑制，随着铜浓度的增加，菌落生长半径进一步减小，在含cu²⁺浓度超过400mgl^-1的平板上几乎不能生长。

表1不同cu²⁺浓度胁迫下nt-1的生长状况

“—”表示菌落无法生长。

在含铜液体培养基中，随着cu²⁺浓度的不断提高，菌株的生长也逐渐受到抑制。当cu²⁺浓度达到500mgl^-1时，菌株生长速率明显减慢，并在培养液底部相互缠绕，形成直径2mm左右的菌丝球。当cu²⁺浓度达到600mgl^-1时，菌株的生长明显受到抑制，但经过5d的培养，仍能观察到一定量的菌丝生长，说明该菌株在溶液条件下对cu²⁺的耐性比在固体培养条件下强。

实施例4：赤霉菌(gibberellasp.nt-1)菌株对溶液中cu²⁺的吸附去除作用

不同因素对菌株吸附铜的影响

实验条件：将5ml处于对数生长期的nt-1种子液接种至50ml含cu²⁺浓度为200mgl^-1的马铃薯葡萄糖液体培养基中，在ph5.0、28℃、150rpm的条件下恒温振荡培养5d。

为考察不同因素对nt-1吸附cu²⁺浓度的影响，按上述实验条件分别改变以下参数：(1)初始cu²⁺浓度的影响：分别配制cu²⁺浓度为100、200、300、400、500、600mgl^-1的培养液；(2)ph的影响：采用1moll^-1的hcl和naoh溶液调节培养基的ph分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；(3)温度的影响：恒温振荡器的培养温度分别设置为20℃、28℃和37℃；(4)接种量的影响：分别按5％、10％和20％的浓度(体积比)接种对数生长期的nt-1种子液。

上述所有实验均设不接菌的处理作为对照，每个处理重复3次。培养结束后，将菌液转移至离心管，于4000rmin^-1离心15min，取上清液过0.45μm的滤膜，稀释后采用火焰原子吸收分光光度计(tas-990，北京普析通用公司)测定溶液中cu²⁺含量。

数据处理方法：去除率(％)＝(溶液中cu²⁺的起始浓度-溶液中cu²⁺的终浓度浓度)/溶液中cu²⁺的起始浓度×100％。

(1)将nt-1接种到不同ph的含铜培养基中培养5d，其对铜的去除率影响如图5a所示。菌株nt-1在ph3.0-8.0范围内均能生长，表明该菌有较强的适应能力。当溶液初始ph处于3.0-5.0时，菌株对铜的去除率随ph的增加而显著增强，并于ph＝5.0时达到最大值24.4％；当溶液初始ph处于5.0-8.0时，nt-1菌株对铜的去除率随ph的增加逐渐降低，表明菌株nt-1具有较强的耐酸特性，这也与nt-1菌株是筛选自酸化和铜复合污染果园土壤的特征相符合。

(2)由图5b可知，在20-28℃范围内，nt-1对铜的去除率随温度升高而增大，在28℃时达到最大值。此后，随着温度的升高，nt-1对铜的去除率逐渐降低。这一结果表明，菌株nt-1对生长温度具有较广泛的适应性，在20-37℃范围内均能生长。

(3)由图5c可知，随着接种量的增加，nt-1对铜的去除率显著提高。但当接种量从10％提高至20％时，溶液中铜的去除率并没有随接种量的增加而成比例增加，菌体吸附结合位点利用率下降。因此，从微生物修复的成本与效应综合考虑，接种量以10％为宜。

(4)由图5d可知，随着体系中cu²⁺浓度的逐渐增加，菌株nt-1对cu²⁺的去除率呈显著下降趋势，当cu²⁺浓度在100-300mgl^-1的范围内时，nt-1对cu²⁺的去除率均达20％以上；当cu²⁺浓度>300mgl^-1时，nt-1对cu²⁺的去除率显著降低，表明高浓度的cu²⁺对菌体的生长及细胞膜表面的官能团产生了较强的毒性效应，使菌株nt-1的生长受到显著抑制，进而抑制了菌丝的生长及其对cu²⁺的吸附能力。