本发明属于医药技术领域，更确切地说，是涉及一类具有神经元损伤保护作用的化合物及其制备方法、含有它们的药物组合物和作为神经系统疾病药物的用途。
背景技术：
“脑卒中”(cerebralstroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，cva)，是一种急性脑血管疾病，由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑卒中已成为我国主要的死亡原因之一，而缺血性脑卒中占脑卒中的60-80％。具有高致残、高致死的特点。因此针对脑卒中的治疗成为目前神经系统疾病的重要研究课题。除急性期溶栓外，神经保护剂对脑卒中患者的康复有要的意义。
目前研究用于神经保护的药物主要有谷氨酸受体拮抗剂、自由基清除剂、钙通道拮抗剂、γ-氨基丁酸(gaba)激动剂、胞二磷胆碱、炎症反应抑制剂、雌激素、促红细胞生成素(epo)等，部分实验证明有一定神经保护作用，临床效果还需进一步研究，临床急需开发新的药物作为神经保护剂用于治疗脑卒中。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，开发新的具有神经保护作用的化合物，用于制备治疗脑卒中及其他神经系统疾病的药物。
为解决上述问题，本发明提供了具有式i结构的化合物及其药学上可接受的盐：
其中：
r1、r2为：氢，卤素；
r3为：氢，烷基，苯甲基，苯乙基。
本发明具有式i结构的化合物及其药学上可接受的盐，优选的式i化合物为：
本发明式i结构的化合物及其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐指：化合物与无机酸、有机酸成盐。
特别地本发明所述药学上可接受的盐指：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、葡萄糖酸盐。
本发明式i化合物的制备方法，其中中间体ⅱ在液溴和三氯甲烷存在下室温反应生成中间体ⅲ，中间体ⅲ和中间体ⅳ在乙腈和碳酸氢钠存在下，室温反应，加水淬灭反应，经萃取，洗涤，纯化最终制得化合物ⅰ，
其中r1、r2、r3如权利要求1所述。
另一种本发明式i化合物的制备方法，其中中间体ⅱ在乙酸乙酯和溴化铜存在下反应生成中间体ⅲ，中间体ⅲ和中间体ⅳ在n,n-二甲基甲酰胺和碳酸氢钠存在下，室温反应，加水淬灭反应，经萃取，洗涤，纯化最终制得化合物ⅰ,
其中r1、r2、r3如权利要求1所述。
本发明还涉及一种治疗神经系统疾病的药物组合物，它包含治疗有效量的任一项所述的具有式i结构的化合物或其药学上可接受的盐及一种或多种药用载体。其中所述神经系统疾病为脑卒中。
另外本发明还涉及所述的具有式i结构的化合物及其药学上可接受的盐在用于制备治疗神经系统疾病的药物方面的用途。其中所述神经系统疾病为脑卒中。
尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以药物制剂的形式使用，给药途径可以是非肠道途径(如静脉、肌肉给药)及口服给药。
本发明化合物的药物组合物制备如下：使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
药物组合物以及单元剂型中含有的活性成份(本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定地加以应用，所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节。
本发明的具有式i结构的化合物或其药学上可接受的盐，具有明显的神经保护作用，对脑卒中及其他神经系统疾病有重要意义。
下面通过药效学实验进一步说明本发明化合物的神经保护作用。
1材料与方法：
1.1实验材料
1.1.1实验动物实验用鼠为spf级spraguedawley大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。其中孕16-18天大鼠用于神经元培养。
1.1.2主要试剂及仪器dmem培养基、neurobasal培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶购invitrogen公司。细胞培养板、细胞培养瓶及离心管购自corning公司。2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,aaph),cck-8细胞活性试剂盒购自东仁公司。
1.2实验方法
1.2.1原代神经元培养
用10％水合氯醛将16－18天孕龄大鼠麻醉后，置于超净工作台内，无菌条件下分离出胚胎，转移到neuralbasal培养基中。取皮层，剔除脑膜、血管，用培养基洗涤2次，剪碎，吹打分散细胞，0.25％胰酶消化10分钟，过滤去除所有组织块，将细胞混悬于含10％胎牛血清的dmem培养基中，接种于24孔培养板中，第二天去除培养板中的培养基，更换为神经元培养基：含有2％b-27添加剂的neuralbasal培养基，之后隔天换液。7天后用于实验。
1.2.2aaph诱导的细胞损伤和细胞活力检测：
2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,aaph)溶于dmem中制备1mm；5mm；10mm；20mm和40mm的溶液，分别加入到神经元中，同时加入cck-8溶液，作用4小时后在利用分光光度计测定495nm波长的吸光度，从而分析细胞活力，观察aaph对细胞活力的影响。
1.2.3新化合物对神经元的保护作用。
原代培养神经元，先用40mm的aaph诱导损伤4h。更换培养基并加入不同浓度的新化合物d6，d14，d21，d22，其中每种化合物低浓度为1μm，中浓度为10μm，高浓度为100μm。保护24h，加入cck-8溶液，作用4小时后在利用分光光度计测定495nm波长的吸光度，从而分析细胞活力，判断对神经元的保护作用。
1.2.4新化合物的抗凋亡作用
原代培养神经元，先用40mm的aaph诱导损伤4h。更换培养基并加入不同浓度的新化合物d6，d14，d21，d22，其中每种化合物低浓度为1μm，中浓度为10μm，高浓度为100μm。保护24h，加入抗凋亡检测试剂溶液，之后再荧光显微镜下观察凋亡细胞的数量，分别记录10个视野的正常细胞，凋亡细胞，并计算其百分比。从而判断新化合物的抗凋亡作用。
1.2.5统计与分析
本实验结果均用spss15.0进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较用方差分析。p<0.05有统计学意义。
表1本发明化合物对aaph诱导的神经元的保护作用
表2本发明化合物对aaph诱导的神经元的抗凋亡作用
2.结果：
2.1aaph能够模拟脑卒中制备神经元损伤模型
原代培养神经元表达神经元特异性标记物神经丝蛋白(neurofilament,nf)表明培养的细胞分别为神经元，而给予不同浓度aaph可对神经元造成损伤，细胞活性随aaph浓度的增加而下降。其中40mmaaph可以明显诱导神经元的损伤。
2.2新化合物能够减轻神经元损伤
在40mmaaph诱导神经元损伤后加入脑苷肌肽-星形胶质细胞条件培养基作用24h。之后检测神经元细胞活力。结果表明新化合物(表1)能够逆转aaph造成的神经元损伤，结果具有统计学意义。
2.3新化合物能够降低细胞凋亡
通过1.2.4新化合物的抗凋亡作用试验，统计凋亡细胞百分比(表2)表明本发明化合物对细胞具有抗凋亡作用。
具体实施方式
下面将详细参考本发明的各实施例，尽管结合示例性实施例描述了本发明，但应该理解，本说明书并未意欲将本发明限制于这些示例性实施例。相反，本发明不仅意欲覆盖这些示例性实施例，而且也覆盖包含在由所附权利要求书限定的本发明的实质和范围内的各种替代、修改、等价形式和其他实施例。
实施例1
本发明化合物d6的制备
依次将6.7g(40mmol)d1，16.6g(120mmol)碳酸钾，30mldmf加入100ml梨型瓶，40摄氏度搅拌10分钟后，加入5.2ml(44mmol)d2，40摄氏度下反应4h，冷却至室温，向反应瓶内加入冰水，过滤，水洗，干燥后得白色粉末状固体产物d312g(39.1mmol)，产率97.7％；
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ2.55(s，3h)，3.95(s，3h)，5.23(s，2h)，6.89(d，j＝8.0hz，1h)，7.32，(m，1h)，7.38(t，1h)，7.43(m，2h)，7.50(br.d.,1h),7.55(br.s.,1h)；
依次将2048(8mmol)d3，50ml三氯甲烷加入200ml梨型瓶，0.5ml(8mmol)液溴溶于50ml三氯甲烷在室温下缓慢滴加如反应瓶中，滴加完成后反应2h，反应结束后用饱和硫代硫酸钠洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，硅胶柱纯化，得到1.4g白色粉末状产物d4，产率52.4％。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ3.82(s，3h)，4.85(s，2h)，5.21(s，2h)，7.18(d，j＝8.0hz，1h)，7.40(m，3h)，7.45(m,2h)，7.49(br.s.,1h),7.66(br.d.,j＝8.0hz，1h)；
依次将334mg(1mmol)d4，5ml乙腈，0.1ml对氟苯胺(1.1mmol)，168mg碳酸氢钠加入50ml梨型瓶内，室温反应12h，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，饱和氯化钠溶液洗涤，硅胶柱纯化，得到180mg淡黄色粉末状产物d6，产率51.9％。
d6化学信息：分子式：c22h20fno3，分子量：365，纯度：98％，外观：淡黄色粉末。
光谱数据：1hnmr(500mhz,cdcl3)δ3.95(s,3h),4.53(s,2h),5.26(s,2h),6.66(m,2h),6.93(m,3h),7.33(m,1h),7.39(m,3h),7.44(m,3h),7.56(m,2h)；13cnmr(500mhz,dmso-d6)δ50.59,56.33,70.55,111.14,113.08,113.91,115.69,115.87,123.00,128.54,128.70,128.84,129.16,137.16,145.55,149.57,152.96,154.23,156.06,195.09
实施例2
本发明化合物d14的制备
依次将2656mg(16mmol)d1，50ml乙酸乙酯，7.0g(28mmol)溴化铜加入100ml茄形瓶内，搅拌回流5h，反应物冷却后用硅藻土过滤，滤液依次用饱和硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，减压蒸干，硅胶柱纯化，得到2.2g白色粉末状产物d11，产率56％；
依次将370mg(1.5mmol)d11，5mln,n-二甲基甲酰胺，0.2ml对氟苯胺(2.0mmol)，252mg碳酸氢钠加入50ml梨型瓶内，室温反应3h，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，饱和氯化钠溶液洗涤，硅胶柱纯化，得到200mg黄色粉末状产物d14，产率48.5％。
d14化学信息：分子式:c15h14fno3，分子量:275，纯度:98％，外观:淡黄色粉末。
光谱数据：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ3.86(s,3h),4.56(s,2h),5.73(s,1h),6.68(m,2h),6.92(m,3h),7.54(d,j＝2.0hz,1h),7.65(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),10.03(s,1h)；13cnmr(500mhz,dmso-d6)δ50.4356.37,111.80,113.89,115.71,115.86,123.42,127.55,145.60,148.25,152.70,154.14,155.97,195.28实施例3
本发明化合物d21的制备
化合物d11的制备参见实施例2
依次将370mg(1.5mmol)d11，5mln,n-二甲基甲酰胺，0.2ml2,4-二氟苯胺(2.0mmol)，252mg碳酸氢钠加入50ml梨型瓶内，室温反应3h，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，饱和氯化钠溶液洗涤，硅胶柱纯化，得到240mg黄色粉末状产物d21，产率54.6％。
d21化学信息：分子式:c15h13f2no3，分子量:293，纯度:98％，外观:黄色粉末。
光谱数据：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ3.84(s,3h),4.60(d,j＝5.5hz,2h),5.34(s,1h),6.70(m,1h),6.81(m,1h),6.87(d,j＝8.0hz,1h),7.08(m,1h),7.50(br.s.,1h),7.60(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),10.03(s,1h)；13cnmr(500mhz,dmso-d6)δ49.70,56.17,103.77,111.15,113.08,115.54,123.29,127.12,133.69,148.08,150.50,152.64,153.47,194.71
实施例4
本发明化合物d22的制备
化合物d11的制备参见实施例2
依次将370mg(1.5mmol)d11，5mln,n-二甲基甲酰胺，254mg(2mmol)4-氯苯胺，252mg碳酸氢钠加入50ml梨型瓶内，室温反应3h，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，饱和氯化钠溶液洗涤，硅胶柱纯化，得到160mg淡黄色粉末状产物d22，产率55.0％。
d22化学信息：分子式:c15h14clno3，分子量:291，纯度:98％，外观:白色粉末。
光谱数据：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ3.84(s,3h),4.57(s,2h),6.68(d,j＝8.0hz,1h),6.89(d,j＝8.0hz,1h),7.08(d,j＝8.0hz,1h),7.52(br.s.,1h),7.62(br.d.,1h),10.03(s,1h)；13cnmr(500mhz,dmso-d6)δ49.57,55.99,111.43,114.15,115.34,119.53,123.06,127.10,128.71,147.49,147.86,152.35,194.61
上文为了举例说明的目的，呈现了本发明的特定示例性实施例。上文的描述并不意图对本发明进行无遗漏的穷举，也不意图将本发明限制为所公开的确切形式。显然，根据上文的描述可以进行很多改变和变化。选择并描述这些示例性实施例是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使本领域技术人员能够制造并使用本发明的各个示例性实施例，及其各种替代和修改形式。事实上，本发明的范围由所附的权利要求及其等效形式限定。