一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法与流程

本发明属于生物基因工程
技术领域：
，具体涉及由犬白细胞介素2、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
：根据中国宠物行业现状分析，截止到2014年末我国宠物行业的市场规模已经达到1058亿人民币，而中国宠物医疗行业目前仅占约20％，相比较宠物行业相对成熟的美国市场，其宠物医疗的产值比达到50％，中国宠物医疗行业存在巨大的发展空间。犬是人类忠诚的朋友，随着国内宠物犬等犬类饲养数量的大幅度增加，犬类疾病发病率、死亡率的不断升高，给人类造成精神和经济上的双重损失。犬与人类亲密接触导致人类被犬病毒感染的几率极高，如狂犬病毒、犬细小病毒和犬瘟热病毒等，都会给人类健康带来极大的威胁。据相关科学研究报道干扰素作为一类重要的细胞因子，在对犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎和犬冠状病毒病等疾病的治疗中均具有一定的疗效。因此积极研究干扰素在犬病毒性疾病治疗中具有广阔的应用前景。ifn是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年issacs和lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒rna来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。现已知，α型ifn在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。ifn-α主要生物学活性为具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性。γ型ifn是由激活的t细胞和nk细胞产生，具有较强抗病毒和免疫调节功能。大量研究表明，干扰素γ除了具有广谱抗病毒功能外，对免疫系统也起着关键的调节作用，所以ifn-γ又称为免疫调节干扰素。虽然各种类型的干扰素均能够介导细胞对病毒感染的反应，但干扰素γ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用，因此干扰素γ具有极为重要的临床应用价值。细胞因子il-2即白细胞介素2，又名t细胞生长因子。主要由活化的t淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制t细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在兽医中，由于il-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。il-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，il-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于临床上应用。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法，并由此融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥制备得到一种重组犬长效干扰素，所述重组犬长效干扰素可显著提高犬干扰素的半衰期，较普通犬干扰素的半衰期提高15倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。本发明采取的技术方案为：一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如sequencelisting400〈1〉所示。本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示，记为基因组1；或如sequencelisting400〈3〉所示，记为基因组2。所述基因组1和所述基因组2均可编码所述融合蛋白。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数cai＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，cai值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中gc含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现犬白细胞介素2、犬ifn-γ、犬ifn-α原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(cai)分别为0.19、0.22、0.27，gc百分比为39.6％、39.8％、59.7％；而通过对犬白细胞介素2、犬ifn-γ、犬ifn-α基因优化后得到各基因在大肠杆菌中密码子适应指数(cai)为1.0、1.0、1.0，gc百分比48.8％、45.0％、55.6％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的gc含量，提高了转录翻译效率。本发明还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pet-32a大肠杆菌表达载体。本发明还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。进一步地，所述基因工程菌为pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα。含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本发明的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为bl21(de3)感受态细胞或带有pgro7质粒的bl21(de3)感受态细胞。本发明还提供了一种重组犬长效干扰素，所述重组犬长效干扰素由所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs为缓冲液，三者的终浓度为甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。本发明还公开了所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经iptg诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pet-32a大肠杆菌表达载体；所述基因工程菌为pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα，其制备方法为：(1)设计引物，通过反转录得到或人工合成带有柔性linker序列的犬白细胞介素2、犬干扰素γ、犬干扰素α的目的基因；通过柔性linker将犬白细胞介素2、犬干扰素γ、犬干扰素α的目的基因连接起来，连接后的目的基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示或如sequencelisting400〈3〉所示；(2)将连接后的目的基因连接到pet-32a质粒上获得表达载体；(3)将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα。所述大肠杆菌宿主细胞为bl21(de3)感受态细胞或带有pgro7质粒的bl21(de3)感受态细胞。所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。所述带有pgro7质粒的bl21(de3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号为v205。所述基因组1的获取方法为：a.引物设计犬白细胞介素2(il-2)的引物序列为：上游il-2-f1：cgggatccatgtacaaaatgcaactc，带有bamhi酶切位点；下游il-2-r1：accaccaccagaaccaccaccaccagtcagtgttgagaag，带有柔性linker；犬干扰素γ(ifn-γ)的引物序列为：上游ifn-γ-f1：ggtggttctggtggtggtggttctatgaattatacaagctatatc，带有柔性linker；下游ifn-γ-r1：accaccaccagaaccaccaccacctttcgatgctctgc，带有柔性linker；犬干扰素α(ifn-α)的引物序列为：上游ifn-α-f1：ggtggttctggtggtggtggttctatggccctgccc，带有柔性linker；下游ifn-α-r1：ccctcgagtttcctcctccttact，带有xhoi酶切位点；b.从犬肝脏中提取rna，通过反转录获得犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的目的基因，三者的基因序列分别如sequencelisting400〈4〉、sequencelisting400〈5〉所示和sequencelisting400〈6〉所示；分别以犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的目的基因为模板，并分别利用犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的上下游引物进行pcr扩增，分别得到连接有柔性linker的犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α基因。pcr反应体系及条件为：在25μl的总反应体系中，模板rna1.5μl，上下游引物各0.5μl，反转录酶2.5μl，dntpmix为10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反应的反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker连接犬il-2和犬ifn-γ目的基因得到ril2-ifnγ基因连接的pcr反应体系及反应条件为：在25μl的总反应体系中，连接有柔性linker的il-2基因模板dna1μl，连接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-γ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix为10μl，加rnasefree水至25μl；连接pcr反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。d.利用柔性linker连接ril2-ifnγ基因和犬ifn-α目的基因得到ril2-ifnγ-ifnα基因连接的pcr反应体系及反应条件为：在25μl的总反应体系中，ril2-ifnγ基因模板dna1μl，连接有柔性linker的ifn-α模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-α下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix为10μl，加rnasefree水至25μl；连接pcr反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。基因组2是对基因组1进行优化之后，人工合成的基因，所述基因组2的获取方法为：a.引物设计犬白细胞介素2(il-2)的引物序列为：上游il-2-f2：cgggatccatgtacaaaatgcagc，带有bamhi酶切位点；下游il-2-r2：accaccaccagaaccaccaccaccggtcagggtagagaa，带有柔性linker；犬干扰素γ(ifn-γ)的引物序列为：上游ifn-γ-f2：ggtggttctggtggtggtggttctatgaactacacctcttac，带有柔性linker；下游ifn-γ-r2：accaccaccagaaccaccaccacctttagaagcacgacg，带有柔性linker；犬干扰素α(ifn-α)：上游ifn-α-f2：ggtggttctggtggtggtggttctatggctctgccgt，带有柔性linker；下游ifn-α-r2：ccctcgagtttacgacgacgaac，带有xhoi酶切位点。b.所述犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的目的基因，三者的基因序列分别如sequencelisting400〈7〉、sequencelisting400〈8〉和sequencelisting400〈9〉所示；分别以犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的目的基因为模板，并分别利用犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的上下游引物进行pcr扩增，分别得到连接有柔性linker的犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α基因。pcr反应体系及条件为：在25μl的总反应体系中，基因组dna1.0μl，上下游引物各0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix为10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反应的反应条件为：95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker连接犬il-2和犬ifn-γ目的基因得到ril2-ifnγ基因连接的pcr反应体系及反应条件为：在25μl的总反应体系中，连接有柔性linker的il-2基因模板dna1μl，连接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-γ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix为10μl，加rnasefree水至25μl；连接pcr反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。d.利用柔性linker连接ril2-ifnγ基因和犬ifn-α目的基因得到ril2-ifnγ-ifnα基因连接的pcr反应体系及反应条件为：在25μl的总反应体系中，ril2-ifnγ基因模板dna1μl，连接有柔性linker的ifn-α模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-α下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix为10μl，加rnasefree水至25μl；连接pcr反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。本发明还提供了所述重组犬长效干扰素的应用，其半衰期长达63小时以上，具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.通过柔性linker将犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α基因实现融合表达，提高了干扰素半衰期，与普通干扰素相比，提高了15倍以上；2.通过对犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α基因进行优化，提高了犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α融合蛋白的表达量。3.以重组大肠杆菌pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα作为表达菌株，通过引入分子伴侣pgro7质粒，在蛋白表达时产生包涵体较少，形成大量可溶性蛋白，避免了包涵体变性和复性的过程，大大缩短了融合蛋白表达的时间；4.本发明公开的由犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α组成的融合蛋白不仅具有ifn-α的广谱抗病毒作用，同时显著提高了犬自身的免疫应答。附图说明图1为实施例1中的犬白细胞介素2基因、犬干扰素α基因与犬干扰素γ基因rt-pcr扩增的结果；泳道m：dnamarkerdl2000；泳道1：犬白介素2基因rt-pcr扩增产物；泳道2：犬干扰素γ基因rt-pcr扩增产物；泳道3：犬干扰素α基因rt-pcr扩增产物；图2为实施例1中的犬il-2、ifn-α和ifn-γ的目的基因连接之后的pcr扩增的结果；泳道m：dnamarkerdl2000；泳道1：犬白介素2基因、犬干扰素γ基因与犬干扰素α基因连接扩增产物；图3为实施例1中的阳性克隆质粒的pcr扩增及双酶切鉴定结果；泳道m：dnamarkerdl10000；泳道1：重组质粒双酶切结果；泳道2：质粒pcr结果；图4为实施例1中的重组蛋白的sds-page电泳检查结果；泳道m：蛋白marker；泳道1：重组菌诱导后的菌体破碎后沉淀；泳道2：重组菌诱导后的菌体破碎后上清；泳道3：空载对照；图5为实施例1得到的融合蛋白的westernblot鉴定结果；泳道m：蛋白marker；泳道1：重组菌诱导破碎后沉淀；泳道2：为重组菌诱导破碎后上清；图6为实施例5中由实施例1中的融合蛋白制得的重组犬长效干扰素α对vsv致细胞病变的抑制作用；1为vsv病毒对照孔；2为hep-2细胞对照孔；a3-12为梯度稀释(从右向左)的人干扰素标准品处理孔；b3-12为梯度稀释(从右向左)的重组犬长效干扰素α处理孔；图7为实施例8中由实施例1中的融合蛋白制得的重组犬长效干扰素α肌肉注射血药浓度-时间变化曲线。具体实施方式实施例1一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ与犬干扰素α组成的融合蛋白，其制备方法如下：1.犬白细胞介素2(il-2)、犬干扰素γ(ifn-γ)与犬干扰素α(ifn-α)目的基因的获取与扩增引物设计：根据genebank中已报道的目的基因序列设计合成引物见表1，在犬白细胞介素2的上游引物和下游引物中分别引入bamhi酶切位点和linker序列，在犬干扰素γ的上游引物和下游引物中分别引入linker序列，在犬干扰素α的上游引物和下游引物中分别引入linker序列和xhoi酶切位点。表1pcr扩增引物rt-pcr获取目的基因：从犬肝脏组织中提取rna，通过反转录获得犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的目的基因，三者的基因序列分别如sequencelisting400〈4〉、sequencelisting400〈5〉和sequencelisting400〈6〉所示；rt-pcr反应体系(25μl)见表2表2rt-pcr反应体系rnasefree水10μldntpmix10μl反转录酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因组rna1.5μl反应参数为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。rt-pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在490bp、560bp和590bp左右出现特异条带，其结果如图1所示，说明分别制备得到了分别连接有柔性linker序列的犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的目的基因。2.目的基因的连接将目的基因均稀释到10ug/ml，利用重叠pcr连接各段目的基因，25μl反应体系如表3、表4所示：表3ril2-ifnγpcr反应体系表4ril2-ifnγ-ifnαpcr反应体系反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1580bp左右出现特异条带，其结果如图2所示，图2中出现了ril2-ifnγ和ifn-α扩增产物条带，这是因为在ril2-ifnγ和ifn-α基因连接的过程中，出现了非特异反应。得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈2〉所示。3.表达载体构建选择连接后的目的基因经测序无误后，pcr胶回收产物与pet-32a质粒均使用bamhi和xhoi限制性内切酶进行双酶切和回收，按表5中的20μl体系做双酶切：表5双酶切体系将连接后的目的基因与pet-32a质粒的酶切回收产物按表6中的体系进行连接，4℃过夜连接：表6酶连体系目的片段dna10μl表达载体3μlbuffer2μl连接酶1μlrnasefree水4μl转化连接产物至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含氨苄青霉素的lb培养基平板过夜培养；挑取lb平板上的单菌落进行目的基因pcr鉴定，阳性克隆菌质粒经bamhi和xhoi双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示工程菌构建成功，pcr扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在1580bp左右处检测出单一条带，其结果如图3所示，说明成功得到了pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα工程菌。4.重组蛋白的表达挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中37℃摇床复苏1h，在lb培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(od＝1.0)，加入终浓度为100μg/ml的iptg，32℃诱导表达5h；收集菌体，经sds-page电泳检测，其结果如图4所示，从图中可以看出，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在76.4kd左右处可见优势表达条带，说明在沉淀和上清中均成功表达了融合蛋白。加入质量体积比1:1的pbs重悬沉淀；-20℃于室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作10s，间隔3s，超声6min，整个过程重复3～4次；4℃，12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白纯化5.1his亲和层析粗制融合蛋白用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在aktaexplorer100蛋白纯化系统上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his亲和层析柱，用pbs缓冲液洗去未结合的蛋白，直到a280nm稳定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羟甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脱，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.2deae阴离子交换层析将经过his亲和层析纯化后收集的蛋白置换到bindingbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上样通过用bindingbufferⅱ平衡好的deae阴离子交换层析柱，再用bindingbufferⅱ过柱至a280nm值稳定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)线性梯度洗脱，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.3分子筛层析将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子筛层析柱，用bindingbufferⅲ洗脱，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.4样品鉴定测定ril2-ifnγ-ifnα效价及比活性，比活性≥105iu/mg，蛋白合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由犬白细胞介素2、犬干扰素γ与犬干扰素α组成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。实施例2一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ与犬干扰素α组成的融合蛋白，其他同实施例1，只是将其中的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞替换为了带有pgro7质粒的bl21(de3)感受态细胞。其融合蛋白的sds-page电泳结果同实施例1对照，上清液中76.4kd左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pgro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。所述带有pgro7质粒的bl21(de3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号v205。实施例3一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ与犬干扰素α组成的融合蛋白，其制备方法如下：1.犬白细胞介素2(il-2)、犬干扰素γ(ifn-γ)与犬干扰素α(ifn-α)目的基因的获取与扩增对实施例1中的犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α进行优化，人工合成犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α目的基因，优化后，三者的核苷酸序列分别如sequencelisting400〈7〉、sequencelisting400〈8〉和sequencelisting400〈9〉所示。1.1密码子优化遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimalcodons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rareorlow-usagecodons)。实际上，常用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的基因的表达效率。因此，在异源表达系统中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的表达。利用偏爱密码子(preferredcodons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因的重新设计叫密码子优化。因此，本实施例中对的犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α基因密码子进行优化。1.2密码子优化后结果分析通常密码子适应指数(cai)＝1.0时被认为该基因在该表达系统中的最优的高效表达状态，cai值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中gc含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(cai)分别为0.19、0.22、0.27，gc百分比为39.6％、39.8％、59.7％；而通过对犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α基因优化后得到重组基因在大肠杆菌中密码子适应指数(cai)分别为1.0、1.0、1.0，gc百分比48.8％、45.0％、55.6％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的gc含量，提高了转录翻译效率。1.3引物设计：表7pcr扩增引物将优化后的犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的基因组dna分别稀释至0.05mg/ml。利用pcr扩增获得目的基因，25μl反应体系如表8所示：表8pcr反应体系rnasefree水10.5μldntpmix10.0μltaqdna聚合酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因组dna1.0μl反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。犬il-2、犬ifn-γ与犬ifn-α的pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分别在490bp、560bp和590bp左右出现特异条带，说明制备得到了优化后的分别连接有柔性linker的犬il-2、犬ifn-γ和犬ifn-α的目的基因。2.目的基因的连接将目的基因均稀释到10ug/ml，利用重叠pcr连接各段目的基因，25μl反应体系如表9、表10所示：表9ril2-ifnγpcr反应体系表10ril2-ifnγ-ifn-αpcr反应体系反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1580bp左右出现特异条带，说明成功得到了连接后的ril2-ifnγ-ifn-α基因。得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈3〉所示。3.表达载体构建选择连接后的目的基因经测序后无误的pcr的胶回收产物与pet-32a质粒均使用bamhi、xhoi限制性内切酶进行双酶切和回收，按表11中的20μl体系做双酶切：表11双酶切体系通用buffer2μl限制性内切酶(一对)1μl+1μl载体或回收片段2ulrnasefree水14μl将连接后的目的基因与pet-32a质粒的酶切回收产物按表12中的体系进行连接，4℃过夜连接：表12目的片段dna10μl表达载体3μlbuffer2μl连接酶1μlrnasefree水4μl转化连接产物至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，将感受态涂布于含氨苄青霉素的lb平板中过夜培养；取lb平板上生长的菌落经pcr鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒经bamhi、xhoi双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，pcr扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在1580bp左右处出现单一条带，说明含有ril2-ifnγ-ifnα融合基因工程菌pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα构建成功。4.重组蛋白的表达挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中37℃摇床复苏1h，在lb培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(od＝1.0)，加入终浓度为100μg/ml的iptg，32℃诱导表达5h；收集菌体，经sds-page电泳检测，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在76.4kd左右处可见优势表达条带，说明在上清和沉淀中均得到了重组蛋白。加入质量体积比1:1的pbs重悬沉淀；-20℃于室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作10s，间隔3s，超声6min，整个过程重复3～4次；4℃，12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白纯化5.1his亲和层析粗制融合蛋白用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在aktaexplorer100蛋白纯化系统上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his亲和层析柱，用pbs缓冲液洗去未结合的蛋白，直到a280nm稳定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羟甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脱，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.2deae阴离子交换层析将经过his亲和层析纯化后收集的蛋白置换到bindingbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上样通过用bindingbufferⅱ平衡好的deae阴离子交换层析柱，再用bindingbufferⅱ过柱至a280nm值稳定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)线性梯度洗脱，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.3分子筛层析将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子筛层析柱，用bindingbufferⅲ洗脱，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.4样品鉴定测定ril2-ifnγ-ifnα效价及比活性，比活性≥105iu/mg，蛋白为合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由犬白细胞介素2、犬干扰素γ与犬干扰素α组成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。实施例4一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白，其他同实施例3，只是将其中的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞替换为了带有pgro7质粒的bl21(de3)感受态细胞。其融合蛋白的sds-page电泳结果同实施例3对照，上清液中76.4kd左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pgro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。所述带有pgro7质粒的bl21(de3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号v205。实施例5一种重组犬长效干扰素α，由实施例1、2、3、4中的融合蛋白分别与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs为缓冲液，三者的终浓度为甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。实施例6实施例1～4得到由犬白细胞介素2、犬干扰素γ与犬干扰素α组成的融合蛋白的鉴定6.1蛋白含量的定量检测用lowry法，以中国食品药品生物制品检定院的标准蛋白作标准测定，测定实施例1～4得到的融合蛋白浓度均大于1.1mg/ml。6.2sds-page电泳检测与空菌相比，融合蛋白在76.4kd左右有一条浓染的新增蛋白条带，如图4所示。6.3westernblot结果分别检测实施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗犬α干扰素(1:5000稀释)为一抗，以山羊抗小鼠igg-hrp为二抗(1:10000稀释)。重组犬长效干扰素样品能与抗犬干扰素α单克隆抗体发生特异性反应，76.4kd左右处出现特异性条带，如图5所示。实施例7实施例5中的四份重组犬长效干扰素α冻干剂的效价检测按照微量细胞病变抑制法，用培养基将hep-2细胞配成5×105细胞/ml细胞悬浮液，每孔接种0.1ml移入96孔细胞培养板。37℃、5％co2培养24h，加入不同剂量的重组犬长效干扰素α，24h后吸弃，再分别接种100tcid50vsv病毒。试验结果结果表明获得的重组犬长效干扰素α对vsv引起hep-2细胞的病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组犬长效干扰素α处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价≥105iu/ml，如图6所示。实施例8实施例5中的分别由实施例1～4的融合蛋白得到的四份重组犬长效干扰素α冻干剂(分别记为a、b、c、d)在犬体内的半衰期的测定细胞病变抑制法测定ril2-ifnγ-ifnα的血药浓度与时间关系取六只体重大致相同的犬(雌雄各半)，颈部皮下注射2mg/ml重组犬长效干扰素α冻干剂2ml，分别在1h、2h、4h、8h、16h、32h、64h、96h静脉采血，血样4℃凝固，3500rpm低温离心10min分离血清，各时点每只犬血样于-20℃保存待测。采用细胞病变抑制法测定血清样品中ril2-ifnγ-ifnα的浓度，用das药动学软件进行曲线拟合并计算参数。参数计算结果见表13。表13重组犬长效干扰素α肌肉注射后血清中主要动力学参数结果表明重组犬长效干扰素α有较长的半衰期。经测定半衰期能达到63h左右，较普通干扰素提高15倍以上。实施例9实施例5中的四份重组犬长效干扰素α冻干剂对犬细胞免疫应答影响的测定取六只体重大致相同的犬分为两组，记为实验组和对照组；实验组颈部皮下注射2mg/ml重组犬长效干扰素α冻干剂2ml，对照组颈部皮下注射2ml的pbs，取注射4周后犬外周血，之后每周取一次血，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，淋巴细胞经过无血清rpmi1640培养基洗2次后，用完全培养基重悬、调整细胞浓度为2×106个/ml，24孔细胞培养板每孔加入1ml淋巴细胞，37℃，5％co2培养72h，收集淋巴细胞培养时上清。elisa检测培养上清中il-4含量，按试剂盒说明书进行，检测结果如表14所示：表14elisa检测各组犬细胞免疫应答水平结果表明注射重组犬长效干扰素α后，能够显著提高犬外周血中细胞因子il-4的含量，增强了细胞免疫应答水平，显著提高免疫力水平。上述参照实施例对一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司<120>一种由犬白细胞介素2、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法<130>1<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>528<212>prt<213>犬il2-ifnγ-ifnα融合蛋白<400>1mettyrlysmetglnleuleusercysilealaleuthrleuvalleu151015valalaasnseralaproilethrserserserthrlysgluthrglu202530glnglnmetgluglnleuleuleuaspleuglnleuleuleuasngly354045valasnasntyrgluasnproglnleuserargmetleuthrphelys505560phetyrthrprolyslysalathrgluphethrhisleuglncysleu65707580alaglugluleulysasnleuglugluvalleuglyleuproglnser859095lysasnvalhisleuthraspthrlysgluleuileserasnmetasn100105110valthrleuleulysleulysglysergluthrsertyrasncysglu115120125tyraspaspgluthralathrilethrglupheleuasnlystrpile130135140thrphecysglnserilepheserthrleuthrglyglyglyglyser145150155160glyglyglyglysermetasntyrthrsertyrileleualaphegln165170175leucysvalileleucysserserglycysasncysglnalametphe180185190phelysgluilegluasnleulysglutyrpheasnalaserasnpro195200205aspvalseraspglyglyserleuphevalaspileleulyslystrp210215220argglugluserasplysthrileileglnserglnilevalserphe225230235240tyrleulysleupheaspasnphelysaspasnglnileileglnarg245250255sermetaspthrilelysgluaspmetleuglylyspheleuasnser260265270serthrserlysarggluasppheleulysleuileglnileproval275280285asnaspleuglnvalglnarglysalaileasngluleuilelysval290295300metasnaspleuserproargserasnleuarglysarglysargser305310315320glnasnleupheargglyargargalaserlysglyglyglyglyser325330335glyglyglyglysermetalaleuprocysserpheservalalaleu340345350valleuleusercyshisserleucyscysleualacysaspleupro355360365aspthrhisserleuargasntrpargvalleuthrleuleuglygln370375380metargargleuseralasersercysasphistyrthrthraspphe385390395400alapheprolysgluleupheaspglyglnargleuglnglualagln405410415alaleuservalvalhisvalmetthrglnlysvalphehisleuphe420425430cysthrasnmetserseralaprotrpasnmetthrleuleuglyglu435440445leucysserglyleusergluglnleuaspaspleuaspalacyspro450455460leuglnglualaglyleualagluthrproleumethisgluaspser465470475480thrleuargthrtyrpheglnargileserleutyrleuglnasparg485490495asnhisserprocysalatrpglumetvalargalagluileglyarg500505510serphepheserleuthrileleuglngluargvalargargarglys515520525<210>2<211>1584<212>dna<213>基因组1<400>2atgtacaaaatgcaactcttgtcttgcatcgcactgacgcttgtacttgtcgcaaacagt60gcacctattacttcaagctctacaaaggaaacagagcaacagatggagcaattactgctg120gatttacagttgcttttgaatggagttaataattatgagaacccccaactctccaggatg180ctcacatttaagttttacacgcccaagaaggccacagaatttacacaccttcaatgtcta240gcagaagaactcaaaaacctggaggaagtgctaggtttacctcaaagcaaaaacgttcac300ttgacagacaccaaggaattaatcagcaatatgaatgtaacacttctgaaactaaaggga360tctgaaacaagttacaactgtgaatatgatgacgagacagcaaccattacagaatttctg420aacaaatggattaccttttgtcaaagcatcttctcaacactgactggtggtggtggttct480ggtggtggtggttctatgaattatacaagctatatcttagcttttcagctttgcgtgatt540ttgtgttcttctggctgtaactgtcaggccatgttttttaaagaaatagaaaacctaaag600gaatattttaatgcaagtaatccagatgtatcggacggtgggtctcttttcgtagatatt660ttgaagaaatggagagaggagagtgacaaaacaatcattcagagccaaattgtctctttc720tacttgaaactgtttgacaactttaaagataaccagatcattcaaaggagcatggatacc780atcaaggaagacatgcttggcaagttcttaaatagcagcaccagtaagagggaggacttc840cttaagctgattcaaattcctgtgaacgatctgcaggtccagcgcaaggcgataaatgaa900ctcatcaaagtgatgaatgatctctcaccaagatccaacctaaggaagcggaaaaggagt960cagaatctgtttcgaggccgcagagcatcgaaaggtggtggtggttctggtggtggtggt1020tctatggccctgccctgctccttctcggtggccctggtgctgctcagctgccactccctg1080tgctgtctggcttgcgacctgcccgacacccacagcctgcgcaactggagggtcctgacg1140ctcctgggacagatgaggagactctccgccagctcttgtgaccactacaccactgacttt1200gccttccccaaggaactgtttgatggccagcggctccaggaggcgcaagccctctctgtg1260gtccacgtgatgacccagaaggtcttccacctcttctgcacgaacatgtcctctgctcct1320tggaacatgaccctcctgggggaattgtgctcggggctctctgagcagctggatgacctg1380gatgcctgtcccctgcaggaggcagggctggccgagacccccctcatgcatgaagactcc1440accctgaggacctacttccaaaggatctccctctacctgcaagacaggaaccacagcccg1500tgtgcctgggagatggtccgagcagaaatcgggagatccttcttctccttgaccatcttg1560caagaaagagtaaggaggaggaaa1584<210>3<211>1584<212>dna<213>基因组2<400>3atgtacaaaatgcagctgctgtcttgcatcgctctgaccctggttctggttgctaactct60gctccgatcacctcttcttctaccaaagaaaccgaacagcagatggaacagctgctgctg120gacctgcagctgctgctgaacggtgttaacaactacgaaaacccgcagctgtctcgtatg180ctgaccttcaaattctacaccccgaaaaaagctaccgaattcacccacctgcagtgcctg240gctgaagaactgaaaaacctggaagaagttctgggtctgccgcagtctaaaaacgttcac300ctgaccgacaccaaagaactgatctctaacatgaacgttaccctgctgaaactgaaaggt360tctgaaacctcttacaactgcgaatacgacgacgaaaccgctaccatcaccgaattcctg420aacaaatggatcaccttctgccagtctatcttctctaccctgaccggtggtggtggttct480ggtggtggtggttctatgaactacacctcttacatcctggctttccagctgtgcgttatc540ctgtgctcttctggttgcaactgccaggctatgttcttcaaagaaatcgaaaacctgaaa600gaatacttcaacgcttctaacccggacgtttctgacggtggttctctgttcgttgacatc660ctgaaaaaatggcgtgaagaatctgacaaaaccatcatccagtctcagatcgtttctttc720tacctgaaactgttcgacaacttcaaagacaaccagatcatccagcgttctatggacacc780atcaaagaagacatgctgggtaaattcctgaactcttctacctctaaacgtgaagacttc840ctgaaactgatccagatcccggttaacgacctgcaggttcagcgtaaagctatcaacgaa900ctgatcaaagttatgaacgacctgtctccgcgttctaacctgcgtaaacgtaaacgttct960cagaacctgttccgtggtcgtcgtgcttctaaaggtggtggtggttctggtggtggtggt1020tctatggctctgccgtgctctttctctgttgctctggttctgctgtcttgccactctctg1080tgctgcctggcttgcgacctgccggacacccactctctgcgtaactggcgtgttctgacc1140ctgctgggtcagatgcgtcgtctgtctgcttcttcttgcgaccactacaccaccgacttc1200gctttcccgaaagaactgttcgacggtcagcgtctgcaggaagctcaggctctgtctgtt1260gttcacgttatgacccagaaagttttccacctgttctgcaccaacatgtcttctgctccg1320tggaacatgaccctgctgggtgaactgtgctctggtctgtctgaacagctggacgacctg1380gacgcttgcccgctgcaggaagctggtctggctgaaaccccgctgatgcacgaagactct1440accctgcgtacctacttccagcgtatctctctgtacctgcaggaccgtaaccactctccg1500tgcgcttgggaaatggttcgtgctgaaatcggtcgttctttcttctctctgaccatcctg1560caggaacgtgttcgtcgtcgtaaa1584<210>4<211>465<212>dna<213>犬il-2<400>4atgtacaaaatgcaactcttgtcttgcatcgcactgacgcttgtacttgtcgcaaacagt60gcacctattacttcaagctctacaaaggaaacagagcaacagatggagcaattactgctg120gatttacagttgcttttgaatggagttaataattatgagaacccccaa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