全过程靶向多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的应用的制作方法

本发明属药学领域，涉及全过程靶向多肽及其用途，具体涉及具有跨血-脑屏障和跨血-肿瘤屏障，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的全过程靶向多肽分子，及其药物复合物和修饰的纳米递药系统。

背景技术：

现有技术公开了肿瘤死亡率高居所有疾病死亡率首位，已是严重威胁人类生命和健康的疾病。临床治疗中，传统的化疗作为肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷。因此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织靶向效率的重要策略。主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将药物或纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中。研究显示，配体修饰后的药物或纳米递药系统可通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现对肿瘤的主动靶向。据资料显示，目前的配体大多只是针对某一受体或某一细胞的靶向，然而肿瘤组织有肿瘤细胞，还有肿瘤干细胞、肿瘤拟态血管、肿瘤新生血管和血-肿瘤屏障(btb)等，脑部肿瘤还存在血-脑屏障(bbb)，使约98％小分子化疗药物和几乎100％蛋白类等大分子药物无法透过bbb进入脑内，导致药物治疗几乎无效，因此，开发对肿瘤尤其是脑部肿瘤生长发展全过程均具有靶向功能的配体具有重要现实意义。

vap(^lvap1(l型氨基酸序列为sntrvap)及其稳定优化多肽^dvap(d型氨基酸序列^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds)、^lvap2(l型氨基酸序列为pavrtns)及其稳定优化多肽^svap(d型氨基酸序列^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp))是本申请研究前期验证的与葡萄糖调节蛋白grp78具有高度结合活性的7肽，其能靶向肿瘤新生血管内皮细胞和跨越btb、靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞，在体内具有良好的寻靶能力，但不能跨越bbb。

wsw(^lwsw(l型氨基酸序列为sypgwsw)的及其稳定优化多肽^dwsw(d型氨基酸序列^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds))也是本申请前期验证的与群体感应受体具有高度结合活性的7肽，其能够靶向脑毛细血管内皮细胞和穿透bbb、靶向肿瘤新生血管内皮细胞和穿透btb，并靶向肿瘤细胞，但无肿瘤干细胞靶向功能。

基于现有技术现状及基础，本申请的发明人拟提供全过程靶向多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的应用，使更为有效地发挥对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊治作用，并将包载肿瘤治疗药物的递药系统联合用药，发挥协同增效抗肿瘤的作用

进一步将已有靶向多肽分子进行改造，利用融合蛋白原理，将vap与wsw通过合适的桥联结构(linker)拼接成wvap(^lwvap：pavrtns-linker-sypgwsw(^lwvap1)、sntrvap-linker-sypgwsw(^lwvap2)、sypgwsw-linker-pavrtns(^lwvap3)和sypgwsw-linker-sntrvap(^lwvap4)；^dwvap：^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^dwvap1)、^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^dwvap2)、^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp(^dwvap3)和^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds(^dwvap4)；^ldwvap：pavrtns-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^ldwvap1)、sntrvap-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^ldwvap2)、^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-pavrtns(^ldwvap3)、^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-sntrvap(^ldwvap4)、^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp-linker-sypgwsw(^ldwvap5)、^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds-linker-sypgwsw(^ldwvap6)、sypgwsw-linker-^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp(^ldwvap7)和sypgwsw-linker-^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds(^ldwvap8))，使其拥有对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤生长发展全过程靶向功能。同时，构建wvap修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的递药系统，从而更为有效地发挥对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊治作用，并将包载肿瘤治疗药物的wvap递药系统开展联合用药，发挥协同增效抗肿瘤的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是基于现有技术现状及基础，提供全过程靶向多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的应用，具体涉及具有跨血-脑屏障和跨血-肿瘤屏障，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的全过程靶向多肽分子，及其药物复合物和修饰的纳米递药系统。

本发明提供了全过程靶向多肽wvap及其修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统，及其在脑部肿瘤或具有脑转移特征的外周肿瘤诊断和靶向治疗中的应用；以及wvap修饰的递药系统包载肿瘤治疗药物在联合用药的协同增效抗肿瘤中的应用。

具体的，本发明的具有跨越血-脑屏障和血-肿瘤屏障，并靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的全过程靶向多肽分子wvap，其由桥联结构(linker)将wsw与vap共价连接形成(^lwvap：pavrtns-linker-sypgwsw(^lwvap1)、sntrvap-linker-sypgwsw(^lwvap2)、sypgwsw-linker-pavrtns(^lwvap3)和sypgwsw-linker-sntrvap(^lwvap4)；^dwvap：^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^dwvap1)、^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^dwvap2)、^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp(^dwvap3)和^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds(^dwvap4)；^ldwvap：pavrtns-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^ldwvap1)、sntrvap-linker-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds(^ldwvap2)、^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-pavrtns(^ldwvap3)、^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds-linker-sntrvap(^ldwvap4)、^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp-linker-sypgwsw(^ldwvap5)、^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds-linker-sypgwsw(^ldwvap6)、sypgwsw-linker-^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp(^ldwvap7)和sypgwsw-linker-^dp^da^dv^dr^dt^dn^ds(^ldwvap8))；

本发明中，用wvap修饰药物分子和高分子载体材料，构建wvap-药物复合物、wvap修饰的纳米递药系统，能提高药物对脑、脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊疗效果。进一步将包载肿瘤治疗药物的wvap递药系统进行联合用药，实现协同增效抗肿瘤的效果。

更具体的，本发明利用融合蛋白原理，设计并制备了多肽分子wvap，使其同时具有wsw和vap的靶向能力，可发挥跨血-脑屏障和血-肿瘤屏障，并靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的肿瘤尤其是脑部肿瘤生长发展全过程靶向作用。

本发明中，wsw与vap的拼接通过适合的桥联结构共价连接，使用的桥联结构为氨基脂肪酸及其衍生物，如半胱氨酸、氨基己酸等；氨基芳香酸及其衍生物，如对氨基苯甲酸等；或寡肽，如gg、gssg等。

本发明所设计的wvap可进一步在分子中引入活性官能团，构建其修饰的药物复合物、高分子载体材料，引入官能团的位点为wvap的氮端、碳端或桥联结构，优选桥联结构，使该分子形成y形结构，有利于靶向功能的发挥。

本发明所设计的wvap引入半胱氨酸后，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化影像物质(如fluorescein、近红外染料cy5.5、ir820、dir、磁共振影像剂gd-dtpa、放射影像剂^99mtc-dtpa等)反应而形成复合物。

本发明所设计的wvap修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成ph敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱和长春瑞滨等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成ph敏感硼酸脂(涉及硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及p53激活肽等多肽药物)的wvap-药物复合物。

本发明所设计的wvap引入半胱氨酸后，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)、聚乙二醇-聚乳酸(peg-pla)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(peg-plga)、聚乙二醇-聚己内酯(peg-pcl)等高分子载体材料上，可用于wvap修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。

本发明所设计的wvap修饰的纳米递药系统可包载阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和9-硝基喜树碱和伊立替康等喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨等长春碱类药物、硼替佐米和卡非佐米等蛋白酶体抑制剂、小白菊内酯等内酯类药物、p53激活肽、蜂毒肽和蝎毒肽等多肽毒素、抗菌肽等抗肿瘤药物；也可包载影像物质，如香豆素6、fam，近红外染料cy5.5、ir820、dir、did，磁共振影像剂gd-dtpa等。

本发明所设计的wvap可介导药物或纳米递药系统跨越血-脑屏障和血-肿瘤屏障，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞，用于脑、脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊断和治疗。

本发明所设计的wvap修饰的递药系统包载肿瘤治疗药物(如阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨、硼替佐米、卡非佐米、小白菊内酯、p53激活肽、蜂毒肽和蝎毒肽等多肽毒素、抗菌肽等)，与其他肿瘤治疗药物(如替莫唑胺、环磷酰胺、依托泊苷、巯嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、埃博霉素、放线菌素d、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、替尼类药物、铂类药物、贝伐单抗、曲妥单抗等)联合用药，以实现协同增效抗肿瘤的效果。

本发明所设计的wvap修饰的递药系统包载不同的肿瘤治疗药物联合用药，如包载抑制肿瘤细胞生长的阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨等肿瘤治疗药物的递药系统，与包载具有抗肿瘤干细胞效果的硼替佐米、卡非佐米、小白菊内酯等肿瘤治疗药物的递药系统联合用药，或与包载具有抗肿瘤作用的多肽p53激活肽、蜂毒肽和蝎毒肽等多肽毒素、抗菌肽等肿瘤治疗药物的递药系统联合用药，以实现协同增效抗肿瘤的效果。

本发明中，进行了如下实验：

1)wvap、wvap-cys及其荧光标记物(wvap-fluorescein、wvap-cy7)的合成，

采用固相合成方法制备wvap和wvap-cys；通过马来酰亚胺基团与巯基的michael加成反应合成了wvap-fluorescein或wvap-cy7；ms表征了结构。

2)wvap-dtpa-gd与wvap-dtpa-^99mtc的合成

通过马来酰亚胺基团与巯基的michael加成反应合成了wvap-dtpa，螯合gd或^99mtc得wvap-dtpa-gd或wvap-dtpa-^99mtc。

3)wvap与grp78的亲和性评价

采用表面等离子共振方法(spr)测定wvap肽与grp78受体蛋白的结合常数kd值，评价其亲和性。

4)wvap稳定性评价

考察wvap在血清中的稳定性；将wvap与小鼠血清在37℃进行孵育，在不同时间点检测多肽的浓度评价其稳定性。

5)wvap体外靶向能力评价

考察wvap-fluorescein对脑毛细血管内皮细胞(bcec)、脐静脉内皮细胞(huvec)和模型肿瘤细胞(如：脑胶质瘤细胞u87)的体外靶向性；考察体外3d肿瘤球模型对wvap-fluorescein的摄取能力。

6)制备wvap-药物复合物

引入半胱氨酸后的wvap与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含ph敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物；

引入半胱氨酸后的wvap与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨等含羟基或氨基的药物；

wvap通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含ph敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物；

wvap通过固相合成直接与多肽药物缩合，其中所涉及药物包括p53激活肽等多肽药物。

7)wvap修饰的纳米递药系统的构建与表征

首先合成wvap修饰的高分子材料wvap-peg-dspe、wvap-peg-pla、wvap-peg-plga、wvap-peg-pcl等。通过引入半胱氨酸的wvap上游离巯基与mal-peg-dspe、mal-peg-pla、mal-peg-plga、mal-peg-pcl等所含马来酰亚胺的反应实现材料的合成，即：将mal-peg-dspe、mal-peg-pla、mal-peg-plga、mal-peg-pcl等分别溶解在乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入含巯基wvap的pbs(ph8.0)反应制备得到^dwvap修饰的高分子材料；

然后制备wvap修饰的纳米递药系统。一定量的wvap-peg-dspe和mpeg-dspe和磷脂和胆固醇、或wvap-peg-dspe和mpeg-dspe、或wvap-peg-pla和mpeg-pla、或wvap-peg-plga和mpeg-plga、或wvap-peg-pcl和mpeg-pcl，以及一定量上述药物，采用成膜水化等方法分别制备相应的^dwvap修饰脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、聚合物纳米粒等纳米递要系统；激光散射粒度仪表征纳米递药系统粒径和粒径分布。

8)wvap修饰的纳米递药系统的体内外肿瘤靶向性评价

考察u87细胞、huvec细胞和u87肿瘤球体外模型对包载荧光物质的wvap修饰纳米递药系统的摄取情况；

通过荷u87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉注射包载荧光物质的wvap修饰纳米递药系统，考察其在各时间点的肿瘤内分布。

9)wvap修饰的纳米递药系统的体内外抗肿瘤效果评价

以mtt法考察包载肿瘤治疗药物的wvap修饰纳米递药系统对u87细胞和huvec细胞的体外生长抑制效果；通过荷u87原位瘤模型裸鼠尾静脉注射包载肿瘤治疗药物的wvap修饰纳米递药系统，以生存时间、肿瘤组织细胞凋亡、新生血管、拟态血管和干细胞数量为指标评价体内抗肿瘤效果。

10)联合用药实验

通过荷u87原位移植瘤模型裸鼠尾静脉注射包载肿瘤治疗药物的wvap修饰纳米递药系统与替莫唑胺等上述临床常用肿瘤治疗药物联合用药；包载肿瘤治疗药物的wvap修饰纳米递药系统与包载具有抗肿瘤干细胞效果的硼替佐米、小白菊内酯等肿瘤治疗药物的递药系统联合用药；包载肿瘤治疗药物的wvap修饰纳米递药系统与包载具有抗肿瘤作用的p53激活肽、蜂毒肽和蝎毒肽等多肽毒素、抗菌肽等多肽药物联合用药，以中位生存期为指标评价抗肿瘤效果。

本发明提供了wvap制备和性质考察以及上述所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊疗的物质基础，经试验，结果表明：wvap同时具备wsw和vap的靶向能力，在模型动物体内具有良好的脑和肿瘤组织靶向能力和影像效果，并表现出更优脑部肿瘤靶向能力；wvap修饰的纳米递药系统显示出了良好的肿瘤靶向性能和更强的抗脑部肿瘤效果；包载肿瘤治疗药物的wvap修饰的递药系统与其他肿瘤治疗药物联合用药，或递药系统包载不同的肿瘤治疗药物联合用药，具有明显的协同增效抗肿瘤效果。

附图说明

图1、^dwvap1-cys的esi-ms图谱，

其中显示，esi-ms：1822.4，与理论分子量相符合。

图2、^dwvap1-fluorescein的esi-ms图谱，

其中显示，esi-ms：2250.4，与理论分子量相符合。

图3、^dwvap1-cy7的esi-ms图谱，

其中显示，esi-ms：2517.8，与理论分子量相符合。

附图4、^dwvap1-peg-pla的¹h-nmr图谱，

其中，mal-peg-pla的核磁图谱7.0ppm显示出马来酰亚胺峰，而^dwvap1-peg-pla的核磁图谱中该峰消失，显示mal-peg-pla中的马来酰亚胺基团已反应完全。

图5、^dwvap1与grp78蛋白的结合活性，

其中显示了^dwvap1与grp78的结合活性高，与^dvap相似，而^dwsw与grp78蛋白不结合，^dwvap1的kd值为0.686μm，与^dvap相当(0.102μm)。

图6、^dwvap1的血清稳定性，

其中，图纵坐标为完整多肽的残留百分比，可见多肽在50％小鼠血清中具有很高的稳定性，孵育24h后几乎不降解。

图7、大鼠原代脑毛细血管内皮细胞bcec、人脑胶质瘤细胞u87及人脐静脉内皮细胞huvec对fluorescein标记多肽的摄取，

其中，图a为fluorescein标记的^dwvap1、^dwsw、^dvap和游离荧光素与bcec细胞作用12h、分别与u87细胞和huvec细胞作用4h后的激光共聚焦照片；图b、图c和图d分别为以上样品与bcec细胞、u87细胞和huvec细胞作用后流式细胞仪测定的细胞摄取结果，可见bcec细胞对^dwvap1和^dwsw的摄取明显高于游离荧光素和^dvap，对^dwvap1和^dwsw的摄取没有明显差异；u87细胞和huvec细胞对三条多肽均有较好摄取。

图8、^dwvap1-cy7和载dir的^dwvap修饰的聚合物胶束在原位瘤内分布和正常小鼠脑内分布，

其中，图a为荷u87原位瘤裸鼠尾静脉注射cy7标记多肽1h后的荧光分布图像，图b为给药后各个时间点脑部荧光半定量结果，表明：cy7标记的^dwvap1、^dwsw和^dvap在肿瘤内的蓄积均显著高于游离荧光素cy7(***p<0.001)，且肿瘤靶向效果^dwvap1-cy7>^dwsw-cy7>^dvap-cy7；图c为荷u87原位瘤裸鼠尾静脉注射载dir聚合物胶束24h后的荧光分布图像，图d为给药24h后离体脑部肿瘤的荧光半定量结果，图e为四种不同的聚合物胶束在正常小鼠脑部的分布情况，显示了^dwvap1修饰胶束具有不弱于^dwsw修饰的聚合物胶束的入脑效果；图f为给药2h和24h后脑部肿瘤的荧光定量结果，表明^dwvap1修饰的聚合物胶束能更好地靶向至肿瘤部位。

图9、^dwvap1修饰的聚合物胶束的体外血-脑屏障、血-肿瘤屏障转运及肿瘤球摄取，其中，

图a和图b分别为载香豆素6的^dwvap1修饰的聚合物胶束(^dwvap1-micelle/c6)与对照样品^dwsw修饰的聚合物胶束(^dwsw-micelle/c6)、^dvap修饰的聚合物胶束(^dvap-micelle/c6)和聚合物胶束(micelle/c6)于不同时间点转运跨越体外血-脑屏障(bbb)及血-肿瘤屏障(btb)模型的百分比，显示了：在30min，1、2和4h，^dwvap1-micelle/c6和^dwsw-micelle/c6转运通过体外bbb模型的量明显高于无靶micelle/c6和^dvap-micelle/c6，且两者的转运百分率无明显差别；在30min，1、2和4h，^dwvap1-micelle/c6、^dwsw-micelle/c6和^dvap-micelle/c6转运通过体外btb模型的量明显高于无靶micelle/c6，且三者的转运百分率无明显差别；图c为跨bbb或btb后三维肿瘤球摄取情况，显示了：^dwvap1-micelle/c6和^dwsw-micelle/c6能有效跨越bbb或btb并被下室u87三维肿瘤球摄取，^dvap-micelle/c6可跨越btb并被下室u87三维肿瘤球摄取，但缺乏跨越bbb的能力。

图10、载紫杉醇和小白菊内酯聚合物胶束的粒径，

其中，分别为载紫杉醇的^dwvap修饰的聚合物胶束(^dwvap1-micelle/ptx)和载小白菊内脂的^dwvap1修饰的聚合物胶束(^dwvap1-micelle/ptl)的粒径图片，显示了，^dwvap1-micelle/ptl和^dwvap1-micelle/ptx的粒径分别为45nm和30nm，且粒径分布窄。

图11、载紫杉醇和小白菊内酯聚合物胶束体外抑制u87细胞和huvec细胞生长曲线，其中，

图a和图b分别为taxol(泰素)、micelle/ptx、^dwvap1-micelle/ptx抑制u87细胞和huvec细胞生长曲线，图a表明，u87细胞给药4h、培养72h后，其ic50分别为2.87、1.09、和0.342μm，^dwvap1-micelle/ptx的体外活性为micelle/ptx的3.18倍；图b表明，huvec细胞给药4h、培养72h后，其ic50分别为1.173、0.749和0.267μm，^dwvap1-micelle/ptx的体外活性为micelle/ptx的2.81倍；图c和图d分别为ptl(游离小白菊内酯)、micelle/ptl、^dwvap1-micelle/ptl抑制u87细胞和huvec细胞生长曲线，图c表明，u87细胞给药4h、培养72h后，其ic50分别为19.13、15.08和7.59μm，^dwvap1-micelle/ptl的体外活性为micelle/ptl的1.99倍；图d表明，huvec细胞给药4h、培养72h后，其ic50分别为5.670、3.828和2.766μm，^dwvap1-micelle/ptl的体外活性为micelle/ptl的1.38倍。

图12、载紫杉醇和小白菊内酯聚合物胶束体外抑制新生血管和拟态血管形成，

其中，图为ptl、taxol、^dwvap1-micelle/ptx和^dwvap1-micelle/ptl对新生血管(a)和拟态血管(b)体外模型的抑制照片，相比于游离ptl和taxol，^dwvap1-micelle/ptx、^dwvap1-micelle/ptl抑制新生血管和拟态血管的形成更显著。图13、载紫杉醇聚合物胶束抗脑胶质瘤的模型裸鼠生存曲线，

其中显示，生理盐水组、taxol组、micelle/ptx组、^dvap-micelle/ptx组、^dwsw-micelle/ptx组、^dwvap1-micelle/ptx组平均生存时间分别为19、20、21、23.5、27.5和29.5天，结果表明，与其余各组相比，^dwvap1-micelle/ptx可显著延长脑胶质瘤模型裸鼠的生存时间(n＝8)。

图14、载小白菊内酯聚合物胶束抗脑胶质瘤的模型裸鼠生存曲线，

其中显示，生理盐水组、ptl组、micelle/ptl组、^dwvap1-micelle/ptl组平均生存时间分别为29.5、32、32和37天，结果表明，与其余各组相比，^dwvap1-micelle/ptl可显著延长脑胶质瘤模型裸鼠的生存时间(n＝8)。

图15、载小白菊内酯和紫杉醇聚合物胶束联合给药抗脑胶质瘤的模型裸鼠生存曲线，

其中显示，生理盐水组、^dwvap1-micelle/ptl组、^dwvap1-micelle/ptx组、^dwvap1-micelle/ptl与^dwvap1-micelle/ptx联合给药组的平均生存时间分别为33.5、47.5、51.5和74天，结果表明，与其余各组相比，^dwvap1-micelle/ptl与^dwvap1-micelle/ptx联合给药可显著延长脑胶质瘤模型裸鼠的生存时间(n＝8)。

图16、载小白菊内酯聚合物胶束与替莫唑胺联合给药抗脑胶质瘤的模型裸鼠生存曲线，

其中显示，生理盐水组、^dwvap1-micelle/ptl组、tmz(替莫唑胺)组、^dwvap1-micelle/ptl与tmz联合给药组的平均生存时间分别为29.5、37、39和59天，结果表明，与其余各组相比，联合给药可显著延长脑胶质瘤模型裸鼠的生存时间(n＝8)。

图17、tunel染色结果

其中，图a为生理盐水组、tmz组、^dwvap1-micelle/ptx组、^dwvap1-micelle/ptl组、^dwvap1-micelle/ptl与tmz联合给药组、^dwvap1-micelle/ptl与^dwvap1-micelle/ptx联合给药组导致脑胶质瘤凋亡的tunel染色照片(bar＝50μm)，其中凋亡的阳性细胞核呈棕黄色或棕褐色，图b为定量结果。

图18、cd31/pas双染色结果，

其中，图a为生理盐水组、tmz组、^dwvap1-micelle/ptx组、^dwvap1-micelle/ptl组、^dwvap1-micelle/ptl与tmz联合给药组、^dwvap1-micelle/ptl与^dwvap1-micelle/ptx联合给药组抑制新生血管形成的cd31/pas双染色照片(bar＝100μm)，其中新生血管细胞核呈棕黄色或棕褐色，图b为定量结果。

图19、cd133染色结果，

其中，图a为生理盐水组、tmz组、^dwvap1-micelle/ptx组、^dwvap1-micelle/ptl组、^dwvap1-micelle/ptl与tmz联合给药组、^dwvap1-micelle/ptl与^dwvap1-micelle/ptx联合给药组杀伤肿瘤干细胞的cd133染色照片(bar＝100μm)，其中肿瘤干细胞呈棕黄色或棕褐色，图b为定量结果。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

实施例1

^dwvap1-cys、^dwvap1-fluorescein、^dwvap1-cy7、^dwvap1-药物、^dwvap1-peg-pla的合成与表征

1)^dwvap1-cys的合成与表征

采用固相多肽合成法，合成^dwvap1-cys(序列为^ds^dn^dt^dr^dv^da^dp^dc-氨基己酸-^dw^ds^dw^dg^dp^dy^ds)，具体方法：在boc-cyspam树脂上按序列依次接入氨基酸，以hbtu/diea为缩合剂、tfa为脱保护剂进行反应。反应完成后，将树脂用含p-cresol的氟化氢进行切割，冰浴搅拌反应1h。反应结束后减压抽去管中氟化氢，冰乙醚沉淀并洗涤沉淀3次，沉淀以20％乙腈重新溶解，收集滤液后旋蒸，得到多肽粗品溶液，多肽粗品用乙腈/水(含0.1％tfa)体系分离纯化。esi-ms表征分子量(mw)，质谱图如图1所示；

2)^dwvap1-fluorescein与^dwvap1-cy7的合成与表征

将上述步骤得到的^dwvap1-cys溶于0.1m的pbs溶液中(ph7.2)，取fluorescein-5-maleimide或cy7-maleimide溶于dmf，两者混合后磁力搅拌反应，hplc监测，待^dwvap-cys反应完全后停止反应，制备液相纯化，用乙腈/水(含0.1％tfa)体系分离纯化，冷冻干燥得^dwvap-fluorescein或^dwvap1-cy7纯品，质谱图如图2、3所示；

3)制备^dwvap1-dtpa-gd与^dwvap1-dtpa-^99mtc

将^dwvap1-cys溶于0.1m的pbs溶液中(ph7.2)，maleimide-dtpa溶于dmf，两者混合后磁力搅拌反应，hplc监测，待反应完全后经制备液相，用乙腈/水(含0.1％tfa)体系分离纯化，冷冻干燥得^dwvap1-dtpa纯品，螯合gd或^99mtc即得^dwvap1-dtpa-gd或^dwvap1-dtpa-^99mtc；

4、制备^dwvap1-药物复合物

以^dwvap1-阿霉素复合物制备作为^dwvap1连接含酮或醛基药物的实施例，9.4mg^dwvap1-cys多肽溶于磷酸盐3ml缓冲液(0.1mm，ph7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(tcep)，于4℃搅拌20min，然后加入4倍摩尔量的阿霉素-6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h，反应液用制备液相纯化，冷冻干燥得^dwvap1-阿霉素复合物；

以^dwvap1-紫杉醇复合物作为^dwvap1通过二硫键连接含羟基或氨基药物的实施例。200mg紫杉醇溶于10ml氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入40mgdcc及60.4mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜。反应液过滤，经柱层析纯化(chcl3/meoh＝50:1-15:1，v/v洗脱)得紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物，紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在5mldmf中，1.5倍摩尔量的^dwvap1-cys溶解在pbs/dmf中，溶液ph值保持4～5，将紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至多肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相纯化冻干得^dwvap1-紫杉醇复合物；

以^dwvap1-硼替佐咪复合物作为^dwvap1多肽连接含硼酸基团药物的实施例，依照^dwvap1的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的boc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与diea的dmf溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以hbtu/diea为缩合剂，于室温反应1h，树脂用hf切割，并经制备型hplc纯化得^dwvap1-多巴胺衍生物，在ph7.4的缓冲液中，^dwvap1-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得^dwvap1-硼替佐咪复合物；

以^dwvap1-pmi(一种p53激活肽)作为^dwvap1连接多肽药物的实施例，直接通过固相多肽合成法制得，包括：确定^dwvap1-pmi多肽序列后，按与制备^dwvap1相同的方法依次接入氨基酸，经hf切割并纯化后得^dwvap1-pmi复合物；

5)^dwvap1-高分子材料复合物的合成与表征

通过^dwvap1上游离巯基与mal-peg-pla所含马来酰亚胺反应作为制备^dwvap1-高分子材料复合物的实施例，将40mgmal-peg-pla溶解在5ml乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入3mlpbs(ph8.0，0.2m)在37℃水化形成胶束，8h内加入9.6mg^dwvap1-cys，反应过夜，hplc检测反应，过量的^dwvap1-cys通过透析除去，冻干；¹h-nmr表征(如图4所示)。

实施例2^dwvap1与葡萄糖调节蛋白grp78的结合活性实验

通过biacore系统进行预结合分析，选取ph5.0为最佳grp78与cm5芯片结合ph，将重组人grp78偶联至cm5芯片上，ru值达到目标值，将^dwvap1配置成不同浓度的样品溶液，从低到高依次进样，用biacoret200evaluationsoftware软件分析^dwvap1与蛋白的结合活性，分别计算其kd值，并与^dvap及^dwsw比较(如图5所示)。

实施例3^dwvap1的血清稳定性考察实验

将^dwvap1配成1mg/ml水溶液，取0.1ml加入0.9ml的25％小鼠血清中，37℃孵育，分别于0和15min，0.5、1、2和4h取出100μl反应液，加入20μl三氯乙酸(tca)沉淀血清中蛋白，4℃静置20min，12000rpm离心10min，取上清液20μl进行hplc分析，血清稳定性结果(如图6所示)表明，^dwvap1具有良好的血清稳定性。

实施例4^dwvap1的体外细胞靶向性验证实验

1)^dwvap1对脑毛细血管内皮细胞的的体外靶向性

4周龄sd大鼠断头后取脑，于冰冷的d-hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和dna酶37℃消化90min后，1000转/分钟离心8min，弃去上清，转移至20％的bsa中，1000g/min、4℃离心20min，弃去中上层液体，将底部微血管转移至培液中，1000转/分钟离心5min，用含20％胎牛血清的dmem培养液配成微血管段悬液，接种于共聚焦皿或12孔板中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72h后，再换成含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72h，得原代脑毛细血管内皮细胞；用含10％胎牛血清的dmem培养液配制浓度为5μm的fam、^dwvap1-fluorescein、^dvap-fluorescein和^dwsw-fluorescein溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育12h，吸弃上清液；用pbs溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，dapi进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图7a所示，另用pbs洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图7b所示；

2)^dwvap1对人脑胶质瘤细胞u87的体外靶向性实验

取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(u87细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的dmem培养液配制浓度为5μm的fam、^dwvap1-fluorescein、^dvap-fluorescein和^dwsw-fluorescein溶液；将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用pbs溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，dapi进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图7a所示；另用pbs洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图7c所示；

3)^dwvap1对人脐静脉内皮细胞huvec的体外靶向性实验

取对数生长期的单层培养的人脐静脉内皮细胞(huvec细胞)，同上试验，细胞内化照片如图7a所示，流式细胞仪分析结果如图7d所示。

实施例5^dwvap1多肽体内肿瘤靶向性验证

建立原位脑胶质瘤模型鼠：取对数生长期的u87细胞，每只裸小鼠接种5×10⁵个细胞(分散于5μlpbs缓冲液中)，裸小鼠麻醉后，用脑立体定位仪固定，细胞接种于纹状体右部(前囟前0.6mm，侧1.8mm，深3mm)，定期观察裸小鼠状态，裸鼠接种肿瘤细胞后第5天进行试验，以0.15μmol/只的剂量将cy7、^dwvap1-cy7、^dwsw-cy7及^dvap-cy7溶液通过尾静脉注入荷瘤裸鼠动物模型体内，于注射后15、30、45及120min分别用活体成像仪记录荧光体内分布，2h后常规处理裸鼠，取脑部肿瘤，用活体成像仪检测肿瘤的荧光分布(如图8a所示)，并进行荧光半定量计算(如图8b所示)。

实施例6^dwvap1修饰的聚合物胶束体外靶向性验证

1)制备载香豆素-6聚合物胶束

称取1mg^dwvap1-peg-pla、9mgmpeg-pla和5μgc6，溶解在2ml乙腈中，于37℃水浴减压(～0.085mpa)旋蒸成膜，室温真空干燥过夜，加入2ml生理盐水水化，cl-4b柱层析除去游离c6，制得^dwvap1-micelle/c6，4℃避光保存，备用；

2)^dwvap1-micelle跨体外血-脑屏障能力考察

4周龄sd大鼠断头后取脑，于冰冷的d-hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和dna酶37℃消化90min后，1000转/分钟离心8min，弃去上清，转移至20％的bsa中，1000g/min4℃离心20min，弃去中上层液体，将底部微血管转移至培液中，1000转/分钟离心5min，用含20％胎牛血清的dmem培养液配成微血管段悬液，接种于预先铺有鼠尾胶原的24孔transwell中，将transwell移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72h，再换成含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72h，测得电阻超过200ω·cm²，即体外bbb模型成功建立；

用含10％fbs的dmem培养液配制c6浓度为50ng/ml的^dwvap1-micelle/c6、^dwsw-micelle/c6、^dvap-micelle/c6及micelle/c6溶液，将transwell上室中的培养液吸出，分别加入上述溶液，分别于30min，1、2和4h取下室培养液测其荧光浓度，各聚合物胶束bbb转运结果如图9a所示；

3)^dwvap1-micelle跨体外血-肿瘤屏障能力考察实验

将脐静脉内皮细胞huvec和u87按照1:5的比例分别铺于transwell的上、下室，培养72h，用含10％fbs的dmem培养液配制荧光浓度为50ng/ml的^dwvap1-micelle/c6、^dwsw-micelle/c6、^dvap-micelle/c6及micelle/c6溶液，将transwell上室中的培养液吸出，分别加入上述溶液，分别于30min，1、2和4h取下室培养液测其荧光浓度，各聚合物胶束btb转运结果如图9b所示；

4、^dwvap1-micelle体外跨血-脑屏障或血-肿瘤屏障靶向脑肿瘤验证

将2％的低分子琼脂糖溶液趁热加入48孔板中，每孔150μl，室温放置冷却凝固后，每孔接种400μlu87细胞悬液，细胞密度为2×10³个/孔，置于二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养7天即形成肿瘤球，将u87肿瘤球转移至bbb模型的transwell下室培养即得bbb/u87肿瘤球共培养模型，将u87肿瘤球转移至btb模型的transwell下室培养即得btb/u87肿瘤球共培养模型；

^dwvap1-micelle/c6、^dwsw-micelle/c6、^dvap-micelle/c6及micelle/c6溶液与50％的血清孵育4h后，将孵育前后的胶束用含10％fbs的dmem培养液配制荧光浓度为50ng/ml的^dwvap1-micelle/c6、^dwsw-micelle/c6、^dvap-micelle/c6及micelle/c6溶液，将transwell上室的培养液吸出，分别加入上述溶液，继续培养4h后取下室的肿瘤球置于荧光显微镜下观察，结果如图9c所示。

实施例7^dwvap1修饰的聚合物胶束体内靶向性验证

1)制备载micelle/dir及micelle/did

载micelle/dir及micelle/did的制备方法同载micelle/c6制备；

2)^dwvap1-micelle/dir体内靶向性验证定性实验

u87原位脑胶质瘤模型鼠分别尾静脉注射100μl的micelle/dir、^dwvap1-micelle/dir、^dwsw-micelle/dir及^dvap-micelle/dir，在注射24h后麻醉裸鼠，用活体成像仪记录dir荧光在裸鼠体内的分布情况并进行荧光半定量计算。随后剖出肿瘤拍照并进行荧光半定量(如图8c及8d所示)；

3)^dwvap1-micelle/did正常老鼠脑内分布

icr小鼠分别尾静脉注射100μl的micelle/did、^dwvap1-micelle/did、^dwsw-micelle/did及^dvap-micelle/did，分别在注射2h及24h后处死小鼠，随后剖出脑部组织匀浆并测定荧光(如图8e所示)；

4)^dwvap1-micelle/did荷瘤老鼠脑内分布定量实验

u87原位脑胶质瘤模型鼠分别尾静脉注射100μl的micelle/did、^dwvap1-micelle/did、^dwsw-micelle/did及^dvap-micelle/did，分别在注射2h及24h时处死裸鼠，随后剖出包含肿瘤的脑部组织匀浆并测定荧光(如图8f所示)。

实施例8载紫杉醇或小白菊内酯聚合物胶束的体外药效学试验

1)载紫杉醇或小白菊内酯聚合物胶束的制备及表征

称取1mg^dwvap1-peg-pla、9mgmpeg-pla和2mgptx(紫杉醇)，溶解在2ml乙腈中，37℃水浴，减压(～0.085mpa)蒸干，成膜，室温真空干燥过夜，加入2ml生理盐水水化，cl-4b柱层析除去游离药物，制得包载紫杉醇的^dwvap1修饰的聚合物胶束(^dwvap1-micelle/ptx)。载小白菊内酯(ptl)的^dwvap1修饰的聚合物胶束(^dwvap1-micelle/ptl)的制备方法同上；激光粒度仪测定粒径和pdi(如图10所示)；2、^dwvap1-micelle/ptx和^dwvap1-micelle/ptl体外药效试验

以4.0×10³个/孔将u87细胞接种于96孔板，24h后将培养液吸出，加200μl一系列浓度的^dwvap1-micelle/ptx、^dwsw-micelle/ptx、^dvap-micelle/ptx、micelle/ptx和taxol(泰素)，培养72h后，加入mtt溶液继续培养4h，弃去培养液，加入150μldmso，振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在590nm处测定吸光度值，采用mtt法测定细胞存活率，计算细胞存活率和半数致死剂量，^dwvap1-micelle/ptl体外药效试验同上，结果如图11所示；

3)新生血管形成的抑制试验

取24孔培养板每孔加入50μl基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化huvec细胞，用含^dwvap1-micelle/ptx、^dwvap1-micelle/ptl、ptl和taxol的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养12h，观察血管样结构形成(如图12a所示)；

4)拟态血管形成的抑制试验

取24孔培养板每孔加入50μl基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化u87细胞，用含^dwvap1-micelle/ptx、^dwvap1-micelle/ptl、ptl和taxol的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养12h，观察血管样结构形成(如图12b所示)。

实施例9载紫杉醇或小白菊内酯聚合物胶束的体内药效学试验

1)^dwvap1-micelle/ptx体内药效学试验

荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、taxol、micelle/ptx、^dwvap1-micelle/ptx、^dwsw-micelle/ptx和^dvap-micelle/ptx。ptx给药总剂量为24mg/kg，分别在肿瘤种植后第6、9、12和15天给药，记录裸鼠的生存时间，图13显示了裸鼠生存时间曲线，与其它各组相比，^dwvap1-micelle/ptx显著延长荷原位脑胶质瘤模型裸鼠生存时间；

2)^dwvap1-micelle/ptl体内药效学试验

荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、ptl、micelle/ptl和^dwvap1-micelle/ptl。ptl给药总剂量为25mg/kg，分别在肿瘤种植后第6、9、12、15和17天给药，记录裸鼠的生存时间，裸鼠生存时间曲线如图14所示，与其它各组相比，^dwvap1-micelle/ptl显著延长荷原位脑胶质瘤模型裸鼠生存时间。

实施例10载药聚合物胶束联合用药的体内药效学试验

1)^dwvap1-micelle/ptl与^dwvap1-micelle/ptx联合给药的体内药效学试验

荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、^dwvap1-micelle/ptx、^dwvap1-micelle/ptl、^dwvap1-micelle/ptx与^dwvap1-micelle/ptl联合给药，ptx的给药总剂量为30mg/kg，ptl的给药总剂量为25mg/kg，分别在肿瘤种植后第6、9、12、15和17天给药，记录裸鼠的生存时间，裸鼠生存时间曲线如图15所示，与其它各组相比，联合给药能够显著延长荷原位脑胶质瘤模型裸鼠生存时间；

2)^dwvap1-micelle/ptl与tmz联合给药的体内药效学试验

荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、^dwvap1-micelle/ptl，口服灌胃tmz以及tmz与^dwvap1-micelle/ptl联合给药，ptl的给药总剂量为25mg/kg，tmz的给药总剂量为50mg/kg，分别在肿瘤种植后第6、9、12、15和17天给药，记录裸鼠的生存时间，裸鼠生存时间曲线如图16所示，与其它各组相比，联合给药能够显著延长荷原位脑胶质瘤模型裸鼠生存时间。

实施例11检测给药后肿瘤组织切片

1)肿瘤血管抑制试验

荷瘤裸鼠在给药完成后，处死取出脑组织固定，石蜡包埋切片，进行cd31免疫组化染色与pas双染，在普通光学显微镜下连续观察3个高倍视野，计数cd31阳性血管数，结果如图17所示；

2)肿瘤凋亡试验

荷瘤裸鼠在给药完成后，处死取出脑组织进行固定，作冰冻切片，通过tunel法检测肿瘤凋亡情况，采用末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)介导的dutp缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddutpnickendlabeling，tunel)检测肿瘤细胞的凋亡程度，包括步骤：石蜡切片常规脱蜡至水；pbs漂洗3次，每次3min；0.3％h2o2溶液室温处理20min；20μg/ml蛋白酶k37℃消化20min；pbs漂洗3次，每次3min；每张切片滴加tunel混合液(tdt和biotin-dntp)30μl置于湿盒中37℃孵育60min；阳性结果为细胞核呈棕黄色或棕褐色，细胞核内棕色颗粒阳性即判定为凋亡细胞；在普通光学显微镜下连续观察5个高倍视野，计数阳性细胞数，视野内细胞中阳性细胞数所占的百分比为凋亡指数(如图18所示)；

3)肿瘤干细胞抑制实验

荷瘤裸鼠在给药完成后，常规处理取脑组织进行固定，作冰冻切片，通过cd133染色法检测脑肿瘤干细胞的数目，阳性结果为细胞核呈棕黄色或棕褐色，细胞核内棕色颗粒阳性即判定为肿瘤干细胞细胞，在普通光学显微镜下连续观察5个高倍视野，计数阳性细胞数，结果如图19所示。