本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及smsip1蛋白及其相关生物材料在调控鲨烯合酶含量中的应用，特别涉及smsip1蛋白及其相关生物材料在促进鲨烯合酶降解进而调控丹参中甾醇合成途径的鲨烯合酶含量中的应用。
背景技术：
：：随着生命科学研究的快速发展，人们发现基因组的序列信息并不能够完整解释各种生命过程及现象，蛋白质作为细胞活性及功能的体现者，在生命过程中具有不可替代的作用。然而蛋白质作为生命活动的直接执行者，还需要经过不同程度的加工和修饰才能发挥功能。蛋白质的翻译后修饰(post-translationalmodifications，ptm)可以改变自身的空间构象、活性、稳定性及其与其他分子相互作用等方面的性能，从而参与调节机体多样化的生命活动。目前已经确定的翻译后修饰方式超过400种，常见修饰过程有磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化、糖基化、sumo化、亚硝基化和氧化等等。据估计，人体内50-90％的蛋白质发生了翻译后修饰，正是这种蛋白质翻译后修饰的作用，使得一个基因并不只对应一个蛋白质，从而赋予生命过程更多的复杂性。在各种形式的蛋白质翻译后修饰中，泛素化过程引起了越来越广泛的关注，2004年诺贝尔化学奖授予了在“泛素介导的蛋白质降解过程研究”中做出开创性贡献的三位科学家。泛素化与蛋白质磷酸化信号转导作用相似，主要作用于调节那些受环境剌激和受组成型调节的蛋白质的水平。因此蛋白质的泛素化修饰参与许多生命活动的生理进程，比如：细胞增生和分化调节、细胞周期进程、蛋白转运、dna修复、细胞器的发生、内质网蛋白质的质控、细胞调亡和细胞对逆境的反应等等。泛素化是真核生物细胞中重要的蛋白质翻译后修饰的过程，对生物体生长发育和生物体对周围环境适应性起调控作用，其中泛素分子是由76个高度保守的氨基酸组成的多肽。该过程首先是靶蛋白被泛素分子标记，然后被蛋白酶体识别后降解。标记靶蛋白的过程由e1泛素活化酶、e2泛素结合酶和e3泛素连接酶共同介导催化完成。el泛素活化酶依靠atp提供能量催化泛素分子与底物蛋白结合，同时激活泛素分子转移至e2泛素结合酶，最后通过e3泛素连接酶与赖氨酸残基结合标记靶蛋白。e3泛素连接酶在靶蛋白特异性识别中起关键作用，根据其亚基成分和作用机制，泛素连接酶e3可分为单亚基类型如hect、ring/u-box和多亚基类型如scf复合物、后期促进复合物(apc)、cul3-btb、cul4-ddb等类型。研究表明，拟南芥蛋白组中，多于5％的被预测蛋白(超过1400个基因)参与泛素化/26s蛋白酶体途径。在这些蛋白中，仅很少的部分编码e1酶(有两个同等型)，37个被预测的e2，26s蛋白酶体组分，以及其他的因子(诸如去泛素化酶)。而多于1400个基因编码的e3泛素连接酶参与泛素化依赖的蛋白酶体降解途径。种类多样的e3泛素连接酶使其参与特定的蛋白酶体降解途径。通过不同的e2和e3的结合，也能够增加e3识别目标蛋白的特异性。因此，e3的多样性，以及e3与e2结合的多样性，不仅能够调节不同类型的泛素化修饰，也可以特异的调节目标蛋白。鲨烯合酶(squalenesynthase，ss或sqs)是生物合成三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类物质中的一个关键酶，其含量和活性决定了后续产物的产量。关于鲨烯合酶是否存在翻译后修饰，目前报道较少。timothyp.等用真菌诱导子处理烟草的悬浮细胞之后，发现在45-50h之间，tss蛋白出现了快速的降解，而且在tss蛋白的第75-89位氨基酸之间存在与调控蛋白质降解相关的pest序列，因此推测tss蛋白可能存在翻译后修饰。丹参是我国传统中药，为唇形科鼠尾草属植物，具有祛瘀止痛、活血通经、凉血消痈和清心除烦之功，常用于心血管系统和血液系统等疾病的治疗。由于其分布区广、生命力强、世代周期短、组织培养和转基因技术体系成熟、基因组小、染色体数目少等特点，被认为是中药研究的理想模式生物。技术实现要素：本发明的一个目的是提供smsip1蛋白的新用途。本发明提供了smsip1蛋白在作为e3泛素连接酶中的应用。本发明还提供了smsip1蛋白在调控鲨烯合酶含量中的应用。本发明还提供了smsip1蛋白在制备调控鲨烯合酶含量的产品中的应用。上述应用中，所述调控鲨烯合酶含量为促进鲨烯合酶降解。上述应用中，所述smsip1蛋白为如下a1)或a2)或a3)或a4)的蛋白质：a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；a2)在序列2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；a4)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。其中，序列2由274个氨基酸残基组成。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl在本发明的具体实施例中，a2)中所述的融合蛋白质是在序列2所示的smsip1蛋白质的n端连接mbp标签得到的蛋白质。上述a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签或mbp标签的编码序列得到。上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a4)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供与smsip1蛋白相关的生物材料的新用途。本发明提供了与smsip1蛋白相关的生物材料在制备e3泛素连接酶中的应用。所述与smsip1蛋白相关的生物材料为下述b1)至b16)中的任一种：b1)编码smsip1蛋白的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；b9)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；b13)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；b14)含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；b15)含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；b16)含有b4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述应用中，b1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1所示的cdna分子或基因组dna分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码smsip1蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码smsip1蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列1由825个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码smsip1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码smsip1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码smsip1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述应用中，所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。本发明还提供了上述生物材料在调控鲨烯合酶含量中的应用。本发明还提供了上述生物材料在制备调控鲨烯合酶含量的产品中的应用。上述应用中，所述调控鲨烯合酶含量为促进鲨烯合酶降解。本发明选择丹参鲨烯合酶smsqs1为研究目标，通过酵母双杂交系统构建cdna文库，筛选到一个与smsqs1存在相互作用的候选蛋白smsip1，其长度为274个氨基酸。通过酵母回转验证及体内luc实验发现，smsqs1与smsip1确实存在相互作用。本发明还通过原核表达的方法制备得到smsip1蛋白质，并进一步证明smsip1蛋白质具有体外泛素连接酶的活性，而且能够促进smsqs1降解。本发明为深入研究smsqs1在甾醇和三萜类代谢途径中的作用机制奠定基础，并为甾醇和三萜类生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。附图说明图1为smsip1生物信息学分析。图2为基于smsip1和其他43个蛋白序列构建的系统进化树。图3为smsip1蛋白的原核表达检测结果。图4为smsip1促进smsqs1降解研究。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的大肠杆菌e.colibl21、大肠杆菌dh5α、pgadt7载体和pgbkt7载体均购自宝生物工程(大连)有限公司；gateway表达载体购自invitrogen公司；rna提取试剂trizol(规格为200ml)购自invitrogen公司；revertaidhminusreversetranscriptase逆转录酶(#ep0451)、ribolockrnaseinhibitor(#e00381)、oligod(t)18primer(#s0131)和taqdna聚合酶均购自fermentas公司；胶回收试剂盒购自百泰克公司；t4dna连接酶、限制性内切酶kpni、ecori、ndei、bamhi和sali均购自纽英伦生物技术北京有限公司(neb)。下述实施例中的pmal-c2载体记载于文献“zhang,y.,c.yang,y.li,n.zheng,h.chen,q.zhao,t.gao,h.guoandq.xie(2007).sdir1isaringfingere3ligasethatpositivelyregulatesstress-responsiveabscisicacidsignalinginarabidopsis.plantcell19(6):1912-1929.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的pcambia1307-6myc载体记载于文献“lin,h.,y.yang,r.quan,i.mendoza,y.wu,w.du,s.zhao,k.s.schumaker,j.m.pardoandy.guo(2009).phosphorylationofsos3-likecalciumbindingprotein8bysos2proteinkinasestabilizestheirproteincomplexandregulatessalttoleranceinarabidopsis.plantcell21(5):1607-1619.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的pentr载体记载于文献“guo,j.,x.ma,y.cai,y.ma,z.zhan,y.j.zhou,w.liu,m.guan,j.yang,g.cui,l.kang,l.yang,y.shen,j.tang,h.lin,x.ma,b.jin,z.liu,r.j.peters,z.k.zhaoandl.huang(2016).cytochromep450promiscuityleadstoabifurcatingbiosyntheticpathwayfortanshinones.newphytol210(2):525-534.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的pk7fwg2.0载体记载于文献“yu,l.,x.tan,b.jiang,x.sun,s.gu,t.hanandw.hou(2014).aperoxisomallong-chainacyl-coasynthetasefromglycinemaxinvolvedinlipiddegradation.plosone9(7):e100144.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的pcambia-nluc载体和pcambia-cluc载体均记载于文献“chen,h.,y.zou,y.shang,h.lin,y.wang,r.cai,x.tangandj.m.zhou(2008).fireflyluciferasecomplementationimagingassayforprotein-proteininteractionsinplants.plantphysiol146(2):368-376.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的eha105根癌农杆菌记载于文献“cui,g.,l.duan,b.jin,j.qian,z.xue,g.shen,j.h.snyder,j.song,s.chen,l.huang,r.j.petersandx.qi(2015).functionaldivergenceofditerpenesynthesesinthemedicinalplantsalviamiltiorrhiza.plantphysiol169(3):1607-1618.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的ah109酵母菌记载于文献“moeini-naghani,i.,andnavaratnam,d.s.(2016).yeasttwo-hybridscreeningtotestforprotein–proteininteractionsintheauditorysystem.auditoryandvestibularresearch:methodsandprotocols,95-107.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的拟南芥e2ubc32蛋白表达粗提物记载于文献“cui,f.,liu,l.,zhao,q.,zhang,z.,li,q.,lin,b.,wu,y.,tang,s.andxie,q.(2012).arabidopsisubiquitinconjugaseubc32isaneradcomponentthatfunctionsinbrassinosteroid-mediatedsaltstresstolerance.theplantcell,24(1),233-244.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的35s::myc-gfp和p19菌记载于文献“liu,l.,y.zhang,s.tang,q.zhao,z.zhang,h.zhang,l.dong,h.guoandq.xie(2010).anefficientsystemtodetectproteinubiquitinationbyagroinfiltrationinnicotianabenthamiana.plantj61(5):893-903.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的mbp蛋白、小麦el蛋白表达粗提物和泛素蛋白(his-ub蛋白)均记载于文献“zhao,q.,m.tian,q.li,f.cui,l.liu,b.yinandq.xie(2013).aplant-specificinvitroubiquitinationanalysissystem.plantj74(3):524-533.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、丹参鲨烯合酶相互作用的smsip1蛋白的获得及验证一、丹参酵母双杂交cdna文库的构建及评价1、实验材料的选择本发明选择2年生的丹参植株作为研究材料，从2008年4月份开始收集样品，并于每月10日、20日和30日左右定期采集，直到7月底结束，存于-80℃备用，样品经中国中医科学院黄璐琦研究员鉴定为唇形科丹参salviamiltrorrhiza。2、cdna文库的构建及评价利用trizol试剂盒分别提取每个月份收集的丹参材料的rna，等量混合后分离mrna，然后以丹参总rna为模板，oligo(dt)为引物，反转录合成单链cdna，再合成双链cdna，连接aadptor、去除短片短cdna，并与pgadt7载体连接，转化大肠杆菌，得到丹参酵母双杂交的cdna文库。通过计算文库的库容量、重组率以及插入片段的大小评价文库的质量。计算转化后平板的菌落数，得到原始文库的库容量为1.50×106cfu，重组率为95.3％，插入片段的长度范围在0.5～5.0kpb之间，且片段的平均长度大于1.0kpb，表明构建的cdna文库质量较高。二、“诱饵”载体的构建及smsqs1的自激活性检测1、“诱饵”载体的构建(1)以质粒smsqs1(genebank，登录号：fj768961.1)为模板，采用smsqs1-f和smsqs1-r引物进行pcr扩增，得到smsqs1目的片段；用genejetpcrpurificationkit试剂盒将smsqs1目的片段进行纯化，得到纯化后的smsqs1。引物序列如下：smsqs1-f：5'-ttttttcatatgatggggagtttacgtgcgattttgag-3'，含ndei酶切位点；smsqs1-r：5'-ttttggatccgttagacggctctctttggtgcaaag-3'，含bamhi酶切位点。(2)用限制性内切酶ndei和bamhi分别对纯化后的smsqs1和pgbkt7载体进行双酶切，连接，得到重组载体pgbkt7-smsqs1，并对其进行测序验证。测序结果表明：重组载体pgbkt7-smsqs1为将smsqs1编码区dna片段(genebank，登录号：fj768961.1)插入到pgbkt7载体的ndei和bamhi酶切位点间，且保持pgbkt7载体的其他序列不变后得到的载体。3、smsqs1的自激活性检测(1)将重组载体pgbkt7-smsqs1转入ah109酵母菌感受态细胞中，得到含有pgbkt7-smsqs1的酵母菌；将pgbkt7载体转入ah109酵母菌感受态细胞中，得到含有pgbkt7的酵母菌；(2)将pgadt7载体分别转化含有pgbkt7-smsqs1的酵母菌和含有pgbkt7的酵母菌中，然后分别接种在sd/-trp/-leu和sd-trp/-leu/-his/-ade平板上，30℃倒置培养5-7天。结果表明：smsqs1不能激活报告基因的表达，自身没有自激活性，可以用做诱饵蛋白进行酵母双杂交文库的筛选。三、与smsqs1相互作用的smsip1蛋白的筛选1、与smsqs1相互作用蛋白的筛选将重组载体pgbkt7-smsqs1作为诱饵蛋白，采用酵母顺序转化法筛选丹参酵母双杂交的cdna文库，得到阳性克隆。具体步骤如下：(1)在sd/-trp平板上挑取含有pgbkt7-smsqs1的酵母菌落(直径为2～3mm)并接种于50mlsd/-trp液体培养基中，30℃，200rpm/min培养18-24h，至酵母od600为1.5左右；(2)将步骤(1)中的od600为1.5的含有pgbkt7-smsqs1的酵母菌按1:40转到300mlsd/-trp液体培养基中，30℃，250rpm继续摇12-16h，至od600为0.6左右；(3)将步骤(2)中的od600为0.6的含有pgbkt7-smsqs1的酵母菌至于50ml的离心管中，室温、1000g离心5min，收集细胞；(4)向步骤(3)收集到的细胞中加入50ml的无菌ddh2o，用vortex悬起沉淀；(5)室温、1000g离心5min，去掉上清，收集沉淀；(6)重复(4)和(5)；(7)每管用3ml无菌100mmol/lliac悬起步骤(6)中的沉淀，30℃水浴15min，收集酵母细胞；(8)准备peg/liac溶液，配方见表1；表1、酵母转化反应体系(360μl)(9)将步骤(7)中的酵母细胞每管100μl平均分入8个1.5ml的离心管中，室温下13,000rpm离心30s；(10)去上清液，收集细胞沉淀；将已预冷的peg/liac溶液加于细胞沉淀中(每管360μl)，vortex悬起沉淀混合均匀；(11)30℃水浴30min，每隔5min将细胞混合一次；(12)42℃水浴热激30min，每隔5min将细胞混合一次；(13)13,000rpm离心30s；(14)去上清液，收集沉淀，向沉淀中加入600μlddh2o悬起细胞，涂于50个直径为150mm的sd/-trp/-leu/-his/-ade平板；置于30℃培养箱培养7-10天，观察结果；(15)涂板前任选1管混合均匀，用移液器吸出1μl溶于199μl的ddh2o中，混合均匀；(16)再从管中吸出10μl溶于190μl的ddh2o中，混合均匀，依次类推，再重复稀释2次；(17)稀释后共有3个不同的浓度，分别为：1：200、1：2000、1：20，000；(18)将3管不同浓度的细胞悬液，分别涂于3个直径为90mm的sd/-trp/-leu平板，置于30℃培养箱培养3-4天，观察结果，计数菌落，用于计算转化效率。最终以smsqs1为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统从丹参cdna文库中筛选与pgbkt7-smsqs1相互作用的蛋白，共得到529个阳性克隆。2、与smsqs1相互作用的smsip1蛋白的获得及序列分析挑取所有的单菌落克隆，在sd/-trp-leu-his-ade四缺培养基中250rpm培养5-7天，提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，转化大肠杆菌扩增后提取质粒并进行测序，将获得的序列与genbank数据库进行blast分析。经过测序分析，初步获得26个可能与smsqs1相互作用的蛋白。选择具有完整编码区的序列的蛋白，并将该蛋白命名为smsip1，其氨基酸序列如序列2所示，smsip1蛋白的编码基因序列如序列1所示。3、smsip1蛋白的序列分析(1)smsip1蛋白的生物信息学分析将序列2所示的smsip1蛋白序列(genbank，注册号：ky270500)利用美国国家生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行同源性分析。跨膜结构域用tmhmmserverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)进行预测；功能域用smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行预测。通过smart蛋白序列分析程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测，发现smsip1蛋白c端有一个可能的跨膜区(序列2第244-266位氨基酸)，n端有一个保守的ringfinger结构域(c3hc4，序列2第41-89位氨基酸)，在序列2第108-170位氨基酸之间含有一个ibr结构域，如图1所示。(2)smsip1序列的系统进化分析使用mega7.0软件基于smsip1序列和其他43个蛋白序列构建系统进化树。构建得到的系统进化树如图2所示。结果显示，smsip1属于plantⅱsubfamily分支。四、smsip1与smsqs1互作的验证分析(一)回转酵母验证smsip1与smsqs1的相互作用将smsip1与smsqs1回转酵母验证smsip1与smsqs1的相互作用。具体步骤如下：将步骤三筛选得到的pgadt7-smsip1质粒转化含有pgbkt7-smsqs1的ah109酵母菌，转化ah109酵母菌后，将重组酵母菌分别涂布于sd/-trp/-leu和sd-trp/-leu/-his/-ade平板上，然后将平板置30℃培养箱中，培养5～7天。同时将空载体pgadt7转化含有pgbkt7-smsqs1的ah109酵母菌作为对照组。结果表明：在sd-trp-leu平板上所有的酵母共转化组合都能正常生长，说明所有组合都成功转化。但是在sd-trp-leu-his-ade筛选平板上含有pgbkt7-smsqs和pgadt7-smsip1的重组酵母菌能够正常生长，而仅含有pgbkt7-smsqs的重组酵母菌(对照组)无法正常生长。说明smsip1蛋白与smsqs1蛋白能够特异性的相互结合，激活报告基因的表达。(二)荧光素酶互补成像技术验证smsip1与smsqs1的相互作用荧光素酶互补成像技术是快速分析蛋白与蛋白，蛋白与小分子化合物相互作用的方法，该方法将荧光素酶(luc)分成n端部分(nluc)和c端部分(cluc)两个部分，n端部分和c端部分并不能通过自发重组来发挥作用，但是当它们分别与能够相互作用的两个蛋白融合时，则能引发重组的荧光素酶活性。本发明利用该技术验证smsip1蛋白与smsqs1蛋白的相互作用。具体步骤如下：1、基因克隆及载体构建(1)基因克隆1)引物的设计根据载体pcambia-cluc和pcambia-nluc的酶切位点信息，以及smsqs1和smsip1的序列设计相应引物。引物序列如下：pcambia-cluc-sip1-kpni-f：5’-ttttttggtaccatgggaaacactctgcaaaagc-3’，含kpni酶切位点；pcambia-cluc-sip1-sali-r：5’-ttttttgtcgacttatgtaggagtattattcctaa-3’，含sali酶切位点；pcambia-nluc-sqs1-kpni-f：5’-ttttttggtaccatggggagtttacgtgcgat-3’，含kpni酶切位点；pcambia-nluc-sqs1-sali-r：5’-ttttttgtcgacgacggctctctttggtgcaa-3’，含sali酶切位点。2)基因克隆以质粒smsip1为模板，采用引物pcambia-cluc-sip1-kpni-f和pcambia-cluc-sip1-sali-r进行pcr扩增，得到smsip1目的片段；以质粒smsqs1为模板，采用引物pcambia-nluc-sqs1-kpni-f和pcambia-nluc-sqs1-sali-r进行pcr扩增，得到smsqs1目的片段。(2)重组载体的构建用限制性内切酶kpni和sali分别对smsip1目的片段和载体pcambia-cluc进行双酶切，连接，得到重组载体pcambia-cluc-smsip1；用限制性内切酶kpni和sali分别对smsqs1目的片段和载体pcambia-nluc进行双酶切，连接，得到重组载体pcambia-nluc-smsqs1；分别对重组载体pcambia-cluc-smsip1和重组载体pcambia-nluc-smsqs1进行测序。测序结果表明：重组载体pcambia-cluc-smsip1为将序列1所示的smsip1编码区dna片段插入到pcambia-cluc载体的kpni和sali酶切位点间，且保持载体pcambia-cluc的其他序列不变后得到的载体。重组载体pcambia-nluc-smsqs1为将smsqs1编码区dna片段(genebank，登录号：fj768961.1)插入到载体pcambia-nluc的kpni和sali酶切位点间，且保持载体pcambia-nluc的其他序列不变后得到的载体。2、菌液的制备(1)重组菌的制备分别将重组载体pcambia-nluc-smsqs1和pcambia-cluc-smsip1转入eha105根癌农杆菌感受态细胞中，得到重组菌pcambia-nluc-smsqs1/eha105和pcambia-cluc-smsip1/eha105。分别将空载体pcambia-nluc和pcambia-cluc转入eha105根癌农杆菌感受态细胞中，得到重组菌pcambia-nluc/eha105和pcambia-cluc/eha105。(2)重组菌的培养将重组菌pcambia-nluc-smsqs1/eha105和pcambia-cluc-smsip1/eha105、重组菌pcambia-nluc/eha105和pcambia-cluc/eha105以及p19菌在含有卡那霉素(kana)和利福平(rif)的液体lb培养基中28℃振荡培养过夜，至od600值为0.6-1.0左右。通过紫外分光光度计检测每种菌的od600。(3)混悬液的制备1)计算所需各种菌的体积数：0.5od600unit/ml×0.5ml＝0.25od600unit＝od600吸光值×菌液的体积数(ml)。2)取计算得到相应体积的各种菌进行如下混合：对照组1：pcambia-nluc菌液+pcambia-cluc-smsip1菌液+p19菌液；对照组2：pcambia-cluc菌液+pcambia-nluc-smsqs1菌液+p19菌液；实验组：pcambia-cluc-smsip1菌液+pcambia-nluc-smsqs1菌液+p19菌液。3)将上述各组混匀后的菌液13000rpm离心1分钟，然后重悬在500ul侵染悬浮液(10mmmgcl2，10mmmes和200μm乙酰丁香酮)中，28℃孵育3-5小时，静止后，分别得到对照组1混悬液、对照组2混悬液和实验组混悬液。3、烟草遗传转化(1)将本生烟草的种子撒在花盆中，温室培育发芽，长出两片幼叶时移栽，在温度25℃，相对湿度54％，光照16h/黑暗8小时条件下培养，培养6周后，得到待侵染烟草，备用。(2)用1ml注射器分别将步骤2制备的对照组1混悬液、对照组2混悬液和实验组混悬液注射待侵染烟草的背面，尽量注射完整不留空隙，注射完的烟草叶片用线挂标签做好标识，培养2-3天。在烟草叶片表面喷洒浓度为100mm荧光素(luciferin)，黑暗放置5-10min。使用光线冷却ccd成像设备拍照，获得luc图像和计算发光强度。实验结果表明：只有实验组(同时转化了重组载体pcambia-cluc-smsip1和重组载体pcambia-nluc-smsqs1)可以检测到较强的荧光信号，而对照组(仅转化了重组载体pcambia-cluc-smsip1或pcambia-nluc-smsqs1)检测不到荧光信号。说明smsqs1蛋白与smsip1蛋白在植物体内也是具有相互作用的。实施例2、smsip1蛋白的原核表达一、引物的设计根据pmal-c2载体的酶切位点信息以及smsip1序列设计相应引物。引物序列如下：pmal-c2-smsip1-bamhi-f：5’-ttttttggatccatgggaaacactctgcaaaagct-3’，含bamhi酶切位点；pmal-c2-smsip1-psti-r：5’-ttttttctgcagtcatctgaagcaccattcggaac-3’，含psti酶切位点。二、表达载体的构建将序列1第1-729位所示的去掉跨膜区的smsip1序列插入pmal-c2载体的bamhi和psti酶切位点间，且保持pmal-c2载体的其他序列不变，得到重组载体pmal-c2-smsip1dt。三、mbp-smsip1dt融合蛋白的表达将重组载体pmal-c2-smsip1dt通过热激法转入大肠杆菌e.colibl21中在37℃培养箱中培养12-16h(过夜)后挑取单克隆菌落，在2mllb液体培养基(amp200μg/ml)中过夜培养；培养后进行pcr鉴定，并取阳性菌液20μl转移至2mllb液体培养基(amp200μg/ml)中，于37℃，220rpm摇床上振荡培养至od600约为0.6～1.0；取1mlod600约为0.6～1.0的菌液，4℃，5000g离心3min，收集菌体；然后用无菌水重悬菌体，再次离心收集菌体，并将菌体转接至5omllb液体培养基(amp400μg/ml)中；37℃，220rpm摇床震荡培养至bl21菌体细胞密度od600值达到0.6～1.0时加入终浓度为0.4mm的iptg诱导剂进行诱导培养；然后在4℃，3000g离心5min，收集菌体，用预冷的pbs缓冲液洗涤2次，收集bl21菌体；用pbs缓冲液重悬bl21菌体，然后置于冰浴中超声破菌(超声l0s，间隔10s，共6次)至菌液变澄清透明，得到大肠杆菌bl21破碎液(含有mbp-smsip1dt融合蛋白)；大肠杆菌bl21破碎液在4℃，15000g离心30min，收集上清液(含有mbp-smsip1dt融合蛋白)进行sds-page(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺)凝胶电泳检测。电泳检测结果如图3所示，图3中，泳道1和5为未诱导pmal-c2；泳道2和6为诱导pmal-c2；泳道3和7为未诱导pmal-c2-smsip1dt；泳道4和8为诱导pmal-c2-smsip1dt。结果表明：mbp-smsip1dt融合蛋白主要存在于菌体裂解上清液中，分子量大小约为68.73kda，mbp-smsip1dt融合蛋白为n端带有mbp标签的smsip1蛋白。四、mbp-smsip1dt融合蛋白的纯化对步骤三获得的上清液(含有mbp-smsip1dt融合蛋白)进行纯化，得到纯化后的mbp-smsip1融合蛋白。1、取20-40ulmbp琼脂糖球(gehealthcare)到1.5mleppendorf管中，用column缓冲液洗涤琼脂糖球，2000rpm离心2min，弃上清液，重复洗涤两次；2、加入步骤三中的上清液(含有mbp-smsip1dt融合蛋白)，用column缓冲液补充总体积为1ml，室温缓慢旋转结合1h；3、加入1ml50mmtris(ph8.0)洗涤琼脂球，室温2000rpm离心2min，用枪头小心除去上清液；4、重复步骤3五次，洗去非特异结合的蛋白，即得到纯化后的mbp-smsip1融合蛋白。实施例3、smsip1蛋白的泛素化活性分析在atp提供能量，小麦e1(具有e1泛素活化酶活性)、拟南芥e2(具有e2泛素结合酶活性)和泛素蛋白(his-ub纯化蛋白)存在条件下进行体外泛素化反应，分析smsip1蛋白的泛素化活性。具体步骤如下：1、泛素体系的配制配制泛素体系，按照泛素体系中的组分不同，分为对照组、-e1组、-e2组、-ub组、-e3组和实验组。各组组分如下(表2)：(1)对照组：1ulmbp蛋白，1.5ul20×reactionbuffer(1mtrisph7.5，40mmatp(sigma)，100mmmgcl2，40mmdtt)，3ul小麦el(小麦el蛋白表达粗提物，大约50ng)，3ul拟南芥e2(拟南芥e2ubc32蛋白表达粗提物，约l00ng)，2ul泛素蛋白(约4ug)，加灭菌水至总体积为30ul；(2)-e1组：4ul实施例2中的纯化后的mbp-smsip1融合蛋白，1.5ul20×reactionbuffer(1mtrisph7.5，40mmatp(sigma)，100mmmgcl2，40mmdtt)，3ul拟南芥e2(拟南芥e2ubc32蛋白表达粗提物，约l00ng)，2ul泛素蛋白(his-ub纯化蛋白，约4ug)，加灭菌水至总体积为30ul；(3)-e2组：4ul实施例2中的纯化后的mbp-smsip1融合蛋白，1.5ul20×reactionbuffer(1mtrisph7.5，40mmatp(sigma)，100mmmgcl2，40mmdtt)，3ul小麦el(小麦el蛋白表达粗提物，大约50ng)，2ul泛素蛋白(his-ub纯化蛋白，约4ug)，加灭菌水至总体积为30ul；(4)-ub组：4ul实施例2中的纯化后的mbp-smsip1融合蛋白，1.5ul20×reactionbuffer(1mtrisph7.5，40mmatp(sigma)，100mmmgcl2，40mmdtt)，3ul小麦el(小麦el蛋白表达粗提物，大约50ng)，3ul拟南芥e2(拟南芥e2ubc32蛋白表达粗提物，约l00ng)，加灭菌水至总体积为30ul；(5)-e3组：4ul实施例2中的纯化后的mbp-smsip1融合蛋白，3ul小麦el(小麦el蛋白表达粗提物，大约50ng)，3ul拟南芥e2(拟南芥e2ubc32蛋白表达粗提物，约l00ng)，2ul泛素蛋白(his-ub纯化蛋白，约4ug)，加灭菌水至总体积为30ul；(6)实验组：4ul实施例2中的纯化后的mbp-smsip1融合蛋白，1.5ul20×reactionbuffer(1mtrisph7.5，40mmatp(sigma)，100mmmgcl2，40mmdtt)，3ul小麦el(小麦el蛋白表达粗提物，大约50ng)，3ul拟南芥e2(拟南芥e2ubc32蛋白表达粗提物，约l00ng)，2ul泛素蛋白(his-ub纯化蛋白，约4ug)，加灭菌水至总体积为30ul。表2、泛素体系的配制2、将步骤1中配制的泛素体系分别置于eppendorfthermomixercomfort仪器上，30℃，900rpm反应90min；3、向管中加入10ul4×sds-page蛋白上样缓冲液终止反应，沸水加热5min；4、室温13,000rpm离心3min，取15ul样品进行sds-page电泳；5、电泳结束后转膜，用nickel-hrp进行western杂交检测。结果表明：smsip1可以给自身加上越来越多的泛素蛋白，形成大分子mbp-smsip1-ubn复合体，与此同时，对照组(mbp)以及缺少小麦e1(-e1组)或缺少拟南芥e2(-e2组)的反应组在反应90min后，未检测到任何多聚泛素化修饰信号。说明原核表达的smsip1具有特异的e3泛素连接酶活性。实施例4、smsip1蛋白促进smsqs1降解一、重组载体的构建1、引物的设计根据载体pcambia1307-6myc和pentr的酶切位点信息，以及smsqs1和smsip1序列设计相应引物。引物序列如下：pcambia1307-6myc-smsqs1-salⅰ-f：5’-ttttttgtcgacatggggagtttacgtgcgat-3’；pcambia1307-6myc-smsqs1-kpnⅰ-r：5’-ttttttggtaccgacggctctctttggtgcaa-3’；pentr-smsip1-f：5’-caccatgggaaacactctgcaaaagctcc-3’；pentr-smsip1-r：5’-gtcgacttatgtaggagtattattcctaa-3’。2、目的基因的克隆(1)以smsqs1为模板，采用pcm1307-smsqs1-f和pcm1307-smsqs1-r引物进行pcr扩增，得到smsqs1目的片段；(2)以smsip1为模板，采用pentr-smsip1-f和pentr-smsip1-r引物进行pcr扩增，得到smsip1完整编码区片段。3、重组载体的构建(1)使用directionaltopo克隆试剂盒(invitrogen)将smsip1完整编码区片段克隆到pentr载体中，然后使用gatewaylrenzymemix(invitrogen)将smsip1完整编码区片段亚克隆到pk7fwg2.0载体上，得到重组载体smsip1-pk7fwg2.0；(2)用限制性内切酶salⅰ和kpnⅰ分别对smsqs1目的片段和载体pcambia1307-6myc进行双酶切，连接，得到重组载体35s::myc-smsqs1。二、重组菌的构建1、农杆菌感受态的制备按照如下方法制备农杆菌eha105感受态细胞：1)取保存的农杆菌eha105，在含相应抗生素抗性的yeb固体培养基上划线活化，于28℃恒温培养箱中，24～36h至长出单菌落；2)挑取农杆菌单菌落，接种于5ml含有相应抗生素的yeb液体培养基内。于28℃、250rpm震荡培养24～36h，至农杆菌菌液od600约0.5～0.6；3)将菌液按2％比例加入含相应抗生素的yeb液体培养基中稀释，于28℃、250rpm震荡培养至od600为0.5～0.6；4)4℃，5000rpm低温离心10min，收集菌体；5)加入和扩大培养时培养液相同体积的无抗性的yeb溶液，重悬；6)4℃，5000rpm低温离心10min，收集菌体；7)加入为扩大培养时培养液1/10体积的灭菌的70mmol/lcacl2溶液(已预冷)，重悬；8)将重悬菌液分装为100μl的小份，至于冰上备用；9)如需保存，则可加入终浓度为15～20％的甘油,-80℃冻存。2、转化农杆菌将重组载体35s::myc-smsqs1转化eha105根癌农杆菌感受态细中，在yeb培养基平板上培养，于28℃培养箱中培养48h，得到含有35s::myc-smsqs1的重组农杆菌；将重组载体smsip1-pk7fwg2,0转化eha105根癌农杆菌感受态细胞中，在yeb培养基平板上培养，于28℃培养箱中培养48h,得到含有smsip1-pk7fwg2,0的重组农杆菌；将35s::myc-gfp转化eha105根癌农杆菌感受态细胞中，在yeb培养基平板上培养，于28℃培养箱中培养48h，得到含有35s::myc-gfp的重组农杆菌。三、烟草遗传转化1、农杆菌注射用于遗传转化的烟草nb种植在温室(16h光照/8h黑暗、70％相对湿度、温度为22℃)中，将5-7周大的烟草叶子用于农杆菌注射。具体步骤如下：将含有35s::myc-smsqs1的重组农杆菌注射烟草叶片，注射3天后取样，得到myc-smsqs1样品；将含有smsip1-pk7fwg2,0的重组农杆菌注射烟草叶片，注射3天后取样，得到smsip1-gfp样品；将含有35s::myc-gfp的重组农杆菌注射烟草叶片，注射3天后取样，得到gfp样品。2、蛋白提取分别提取myc-smsqs1样品、smsip1-gfp样品和gfp样品中的蛋白质，分别得到myc-smsqs1蛋白质提取液、smsip1-gfp蛋白质提取液和gfp蛋白质提取液。具体步骤如下：分别取各组烟草叶的渗透部分，然后将叶组织在液氮中研磨，得到研磨后组织，在冰上将研磨后组织置于提取缓冲液nb1(50mmtris-mes(ph8.0)，0.5msucrose，1mmmgcl2，10mmedta，5mmdtt，proteaseinhibitorcocktailcompleteminitablets(roche，http://www.roche.com/)中，得到蛋白提取液。四、smsip1促进smsqs1降解1、分别向步骤三中的myc-smsqs1蛋白质提取液、smsip1-gfp蛋白质提取液和gfp蛋白质提取液中加入终浓度为50μm蛋白合成抑制剂chx(sigma公司)，然后悬浮叶组织，再在4℃，16000g条件下离心30min，分别得到myc-smsqs1蛋白提取物、smsip1-gfp蛋白提取物和gfp蛋白提取物。2、将myc-smsqs1蛋白提取物与smsip1-gfp蛋白提取物按照1:2的比例混合，作为实验组样品(smsip1-gfp)；同时将myc-smsqs1蛋白提取物与gfp蛋白提取物按照1:2的比例混合，作为对照组样品(gfp)。3、分别将实验组样品和对照组样品置于eppendorfthermomixer中30℃轻轻振荡培养，然后分别在培养0h、1h、2h和4h时取出样品。再向样品中加入sds缓冲液，煮沸10分钟后终止反应进行western检测，用anti-myc抗体(购于sigma公司)检测myc-smsqs1蛋白，anti-gfp抗体(购于sigma公司)检测smsip1-gfp和gfp蛋白。结果如图4所示(ponceaus是指loadingcontrol)。从图中可以看出：随着时间的延长两组样品中smsqs1蛋白的量都逐渐减少，在实验组样品(smsip1-gfp)中smsqs1蛋白的降解速率明显高于对照组样品(gfp)。反应2h时实验组样品(smsip1-gfp)中smsqs1蛋白的量开始降低，反应4h时已明显减少，smsqs1蛋白的量随时间增加而减少，证明smsip1蛋白可以促进smsqs1蛋白的降解，用于调控smsqs1蛋白的含量。序列表<110>中国中医科学院中药研究所<120>smsip1蛋白及其相关生物材料在调控鲨烯合酶含量中的应用<160>2<210>1<211>825bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgggaaacactctgcaaaagctcccccaattttcacaacaccgagaattacaactccga60ggtcaaactaatcatcaacaatcgtcggagtttgaagacgacggcaatcgagaattcacc120tgcgaaatctgcatcgagccggcctccaagaggttcaggaacgccggcagatgctcccac180cctttctgcaccgactgcgtggtcaagtacatccgcgctaagctcgacgacggcgccggg240gacatcatgtgcccggggttggggtgcgggcactcgctggacccggcggcgtgcacggag300gtggtggggacggacctgttcgtgcggtggtgtgacgcgctgtgcgaggcggcgattctc360ggggcggagaggtgctactgcccctacaggaactgcaacgtgctgatcgtcaacgagtgc420ggcggaattgtgcggaaatccaagtgccctagctgtaagagacccttgtgcttccagtgt480aaaagggtttggcacgcggggtttgggtgcgacgagagcggggaggccagggatcgcaat540gacgtcgcatttgggaggctggccgagcagaacaagtggaagaggtgccctcgctgtagg600cattttgtcgaactgcttgaaggctgccggatcgtcaaatgcagatgtgggattagtttc660tgctacaagtgtggaaagcaggttgagcagcactggtgtcgttgtgaccgaacctctctc720tgttgcgaatggtgcttcagagtttccatacttgttatcttcctcaccttcgccttcttt780ttctttacttggggccaaagccttaggaataatactcctacataa825<210>2<211>274<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2metglyasnthrleuglnlysleuproglnpheserglnhisargglu151015leuglnleuargglyglnthrasnhisglnglnserserglupheglu202530aspaspglyasnarggluphethrcysgluilecysilegluproala354045serlysargpheargasnalaglyargcysserhisprophecysthr505560aspcysvalvallystyrileargalalysleuaspaspglyalagly65707580aspilemetcysproglyleuglycysglyhisserleuaspproala859095alacysthrgluvalvalglythraspleuphevalargtrpcysasp100105110alaleucysglualaalaileleuglyalagluargcystyrcyspro115120125tyrargasncysasnvalleuilevalasnglucysglyglyileval130135140arglysserlyscysprosercyslysargproleucyspheglncys145150155160lysargvaltrphisalaglypheglycysaspgluserglygluala165170175argaspargasnaspvalalapheglyargleualagluglnasnlys180185190trplysargcysproargcysarghisphevalgluleuleuglugly195200205cysargilevallyscysargcysglyileserphecystyrlyscys210215220glylysglnvalgluglnhistrpcysargcysaspargthrserleu225230235240cyscysglutrpcyspheargvalserileleuvalilepheleuthr245250255phealaphephephephethrtrpglyglnserleuargasnasnthr260265270prothr当前第1页12当前第1页12