用于检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒以及他们的应用和检测沙门氏菌的方法与流程

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒以及他们在检测沙门氏菌中应用和一种检测沙门氏菌的方法。

背景技术：

食源性致病菌，指在食品的加工和流通过程中引入的病原菌，这些病原菌在食品中存活、生长代谢引起食物的变质和破坏，同时有些病原菌分泌有毒物质，直接或间接导致人患病。常见细菌性食物中毒的病原微生物为沙门氏菌属(salmonella)，其是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。沙门氏菌不产生外毒素，但菌体裂解时。可产生毒性很强的内毒素，此种毒素为致病的主要因素，可引起人体发冷、发热及白细胞减少等病症。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。

目前，国内对食源性病原菌导致的疾病快速诊断技术的研究还处于初级阶段，常用的鉴定方法主要有pcr法或是利用免疫学的方法，但这些方法均费时费力，有的还不准确，甚至需要专业技术人员或专业技术设备，难以对病原生物早期监控、定期检测、现场快速诊断，因此往往是爆发了大规模流行性疾病后才引起关注和重视。国内外尚无针对沙门氏菌的快速有效的易于现场操作的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的如上问题，提供一种检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒，使用本发明提供的引物系统和试剂盒能够对沙门氏菌进行现场检测，且快速有效，灵敏度和精准度也较高。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种用于检测沙门氏菌的引物系统，其中，该引物系统包括如seqidno：1所示的正向外引物、如seqidno：2所示的反向外引物、如seqidno：3所示的正向内引物和如seqidno：4所示的反向内引物。

优选地，所述引物系统还包括环引物，所述环引物为如seqidno：5所示的引物序列和/或如seqidno：6所示的引物序列。

本发明第二方面提供一种用于检测沙门氏菌的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物系统、dntp、甜菜碱、硫酸镁、氯化锰、钙黄绿素、反应缓冲液以及dna聚合酶。

优选的，所述dna聚合酶为bstdna聚合酶。

优选的，所述反应缓冲液为10×thermpol缓冲液。

本发明第二方面提供一种检测沙门氏菌的方法，其中，该方法包括：将如上所述的引物系统、甜菜碱、硫酸镁、氯化锰、钙黄绿素、dntp、dna聚合酶以及反应缓冲液与dna模板在60-65℃的条件下接触反应，并通过反应体系的颜色变化判断dna模板中沙门氏菌基因的存在。

通过本发明的技术方案，可以取得如下效果：

1)本发明通过4条引物与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增反应，因此可以获得比常规pcr更高的特异性；

2)反应结果检测方便、快捷，可直接观察反应体系的颜色变化来判定，反应体系由浅褐色变为荧光绿即为阳性结果；

3)设备要求简单，易操作，、只需要一个普通的水浴锅或者恒温装置，操作简单、携带方便，技术门槛低；

4)反应速度更快，本发明采用恒温扩增反应，没有pcr反应中温度变化的耗时，一般在30min-60min内即可完成，比荧光定量pcr反应速度更快，能更好的满足生产现场的快速检测的要求；

5)一般情况下，以分子水平为基础的检测方法例如pcr和荧光定量pcr都会受临床标本中抑制物的影响，本发明优选使用的bstdna聚合酶，其对样品中抑制物的耐受能力比荧光定量pcr中的taq酶要强，因此，具有更广阔的应用前景。

附图说明

图1显示了使用本发明提供的引物系统对沙门氏菌的特异性检测结果。

附图标记说明

1—大肠埃希氏菌o157；2—单核细胞增生李斯特氏菌；3—金黄色葡萄球菌；4—空肠弯曲菌；5—粪肠球菌；6—鲍曼不动杆菌；7—铜绿假单胞菌；8—沙门氏菌；9—沙门氏菌；10—沙门氏菌；11—阴性对照。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种用于检测沙门氏菌的引物系统，其中，该引物系统包括如seqidno：1(5’-ggcgatattggtgtttatgggg-3’)所示的正向外引物、如seqidno：2(5’-aacgataaactggaccacgg-3’)所示的反向外引物、如seqidno：3(5’-gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3’)所示的正向内引物、如seqidno：4(5’-ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3’)所示的反向内引物。

根据本发明，采用本发明提供的如上4条引物对沙门氏菌基因进行特异性扩增，其能够结合沙门氏菌sal-1基因(如seqidno：7所示)的6个特定区域，从而能够以较高的特异性对沙门氏菌进行检测。

根据本发明，如上提供的4条引物可以分装独立保存，也可以按照预定的比例混合在一起进行保存。优选的，将如上4条引物独立保存，一般置于冷冻设备中进行冷冻保存。

根据本发明，在所述引物系统中如上的4条引物的量可以在较宽的范围内进行选择，但本发明的发明人在研究的过程中发现，当外引物与内引物的摩尔比为1:4-12，优选为1:6-10，更优选为1:7-9，最优选为1:8时，能够有效提高对沙门氏菌的特异性检测，并有效缩短检测结果。

此处需要说明的是，如上所述的“外引物”是指如seqidno：1所示的正向外引物和如seqidno：2所示的反向外引物的总称，如上的量也是指它们的总量；如上所述的“内引物”是指如seqidno：3所示的正向内引物和如seqidno：4所示的反向内引物的总称，如上的量也是指它们的总量。

根据本发明，如一般pcr情况，正向引物与反向引物的量基本相同，例如，如seqidno：1所示的正向外引物和如seqidno：2所示的反向外引物的摩尔量基本相同，如seqidno：3所示的正向内引物和如seqidno：4所示的反向内引物的摩尔量基本相同。

本发明的发明人在研究的过程中发现，在使用如上的4条引物对沙门氏菌进行特异性检测时，引入环引物，如seqidno：5(5’-gacgaaagagcgtggtaattaac-3’)所示的引物序列和/或如seqidno：6(5’-gggcaattcgttattggcgatag-3’)所示的引物序列时能够明显加快反应的速率，从而大大提高了检测效率，同时还可以提升检测灵敏度与检测特异性。因此，本发明的引物系统包括如seqidno：5所示的引物序列和/或如seqidno：6所示的引物序列。其中，在所述引物系统中，所述环引物的量没有特别的限制，优选的，所述外引物与所述环引物的摩尔比为1：1-5，例如可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。

基于如上的引物系统，本发明的第二方面，还提供了一种用于检测沙门氏菌的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物系统、dntp、甜菜碱、硫酸镁、氯化锰、钙黄绿素、反应缓冲液以及dna聚合酶。

根据本发明，在所述试剂盒的储存中，如上的各物质可分开独立保存，其中的一些物质，例如，如上所述的引物系统、dntp、反应缓冲液以及dna聚合酶可以冷冻保存，而甜菜碱、硫酸锰、钙黄绿素则可在较宽的条件下保存。

根据本发明，所述dna聚合酶可以在较宽的范围内进行选择，例如，可以为本领域用于常规pcr反应或荧光定量pcr反应的dna聚合酶，例如，taqdna聚合酶。根据本发明一种优选的实施方式，所述dna聚合酶为bstdna聚合酶，其可通过商购获得，例如，可以购自南京诺唯赞生物科技有限公司公司，其货号为p701-01。在该酶的作用下，检测效率能够得到进一步提升。

根据本发明，所述反应缓冲液可以在较宽的范围内进行选择，例如，可以为本领域用于常规pcr反应或荧光定量pcr反应的缓冲液。根据本发明一种优选的实施方式，所述反应缓冲液为thermpol缓冲液，例如，可以为10×thermpol缓冲液，其可通过商购获得，例如，可以通过商购南京诺唯赞生物科技有限公司，货号为p701-01的bstdna聚合酶来获得其附带的10×thermpol缓冲液。

本发明的第三方面提供了如上所述的引物系统以及如上所述的试剂盒在检测沙门氏菌中的应用。

此处需要说明的是，本发明中对沙门氏菌的检测并不以动物或人体为对象，并且也不旨在通过检测样品来获得动物或人体的健康状态，本发明的目的旨在获知体外样品中沙门氏菌的污染状况。其所应用的对象可以非来源于动物或人体的样品，例如，可以为食品、粮食、水体、土壤、有机肥料等。其中，所述有机肥料包括来自动物或人体的排泄物，但并不以获得动物或人体的健康状态为目的，而是确定这些排泄物是否对环境造成污染等。

本发明的第四方面提供一种检测沙门氏菌的方法，其中，该方法包括：将如上所述的引物系统、甜菜碱、硫酸镁、氯化锰、钙黄绿素、dntp、dna聚合酶以及反应缓冲液与dna模板在60-65℃的条件下接触反应，并通过反应体系的颜色变化判断dna模板中沙门氏菌基因的存在。

本发明检测沙门氏菌的方法所述针对的对象以及目的与本发明的第三方面相同，本发明在此不再重复赘述。

根据本发明，在检测过程中，如上各物质的用量可以在较宽的范围内选择。为了进一步提高检测效率以及检测精准度，优选情况下，基于100微升的反应体系，所述引物系统的用量为4×10^-4-6×10^-4微摩尔，优选为4.3×10^-4-5.3×10^-4微摩尔，最优选为5.0×10^-4微摩尔；甜菜碱的用量为60-100微摩尔，优选为70-90微摩尔，最优选为80微摩尔；硫酸镁的用量为0.3-0.9微摩尔，优选为0.5-0.7微摩尔，最优选为0.6微摩尔；氯化锰的用量为0.01-0.1微摩尔，优选为0.03-0.08微摩尔，最优选为0.05微摩尔；钙黄绿素的用量为5×10^-4-5×10^-3微摩尔，优选为1×10^-3-4×10^-3微摩尔，最优选为2.5×10^-3微摩尔；dntp的用量为0.1-0.2微摩尔，优选为0.13-0.16微摩尔，最优选为0.14微摩尔；dna聚合酶的用量为2-6u，优选为3-5微升，最优选为4微升；反应缓冲液的用量为8-12微升，优选为9-11微升，最优选为10微升；dna模板的用量为60-100纳克，优选为70-90纳克，最优选为80纳克。

其中，本发明的发明人在研究中发现，进一步通过控制钙黄绿素与氯化锰的用量比能够进一步提升检测效果。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述钙黄绿素与氯化锰的用量摩尔比为1:5-30，优选为1:15-25，最优选为1:20。

根据本发明，所述dna聚合酶以及反应缓冲液的选择在如上已经进行了介绍，本发明在此不再重复赘述。

根据本发明，所述dna模板的获得可以采用本领域常规的方法进行获得，例如，可以将待测样品通过酚仿抽提的方法获得，也可以通过购买dna提取试剂盒对待测样品中的dna进行提取，此外，本发明的方法甚至还可以直接以菌落为模板进行检测。

根据本发明，所述反应的温度优选为62-64℃，最优选为63℃。

使用本发明的方法对沙门氏菌进行检测时，如果待测dna模板中存在沙门氏菌基因，则通过反应，反应体系的颜色会由褐色(一般为浅褐色)变为荧光绿，如果dna模板中不存在沙门氏菌基因，则样品体系无颜色变化或不变为荧光绿。反推亦然，也即，当反应体系的颜色由褐色(一般为浅褐色)变为荧光绿时则指示待测dna模板中存在沙门氏菌基因，当样品体系无颜色变化或不变为荧光绿时，则指示待测dna模板中不存在沙门氏菌基因。

其中，褐色，是处于红色和黄色之间的任何一种颜色。其特征含有适中的暗淡和适度的浅灰。褐色亦称棕色、赭色、咖啡色、啡色、茶色等，是由混合小量红色及绿色，橙色及蓝色，或黄色及紫色颜料构成的颜色。

荧光绿为艳绿色，绿色是自然界中常见的颜色，是一种比刚长的嫩草的颜色深些的颜色或呈艳绿，和在光谱中介青与黄之间的那种颜色。绿色是电磁波的可视光部分中的中波长部分，波长为492～577纳米。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例和对比例中，

bstdna聚合酶可以购自南京诺唯赞生物科技有限公司公司，其货号为p701-01，其附带有10×thermpolbuffer。

实施例1-6

用于说明本发明提供的引物体系对沙门氏菌的检测

使用天根生化科技有限公司的细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)并按照其说明书对培养好的沙门氏菌基因组进行提取，提取的基因组浓度为10纳克/微升。

按照下表1的用量进行反应，其中，反应体系为25微升，反应温度为63℃，记录反应体系由浅褐色变为荧光绿所用的时间，结果见表2。

表1

注：环引物1为seqidno：5所示的引物序列；环引物2为seqidno：6所示的引物序列；反应体系初始为浅褐色

实施例7-10

用于说明本发明提供的引物体系对沙门氏菌的检测

按照实施例1的方法进行沙门氏菌的检测，不同的是，实施例8-10的反应温度分别为61℃、62℃、64℃和65℃。记录反应体系由浅褐色变为荧光绿所用的时间，结果见表2。

表2

由表2可以看出，各组分在本发明优选的用量以及反应条件下对沙门氏菌的检测最为快速，另外，在添加本发明的环引物优选为2种环引物的情况下，检测更加快速。

实施例11

本实施例用于说明本发明提供的引物系统的检测特异性

使用天根生化科技有限公司的细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)并按照其说明书对培养好的常见食源性病原菌沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌和常见病原菌粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌的基因组进行提取。

按照实施例1的方法以如上提取的各基因组为模板进行反应，反应时间为40min。结果如图1所示，由图1可以看出，本发明提供的引物系统对其他菌体的基因组反应为阴性，也即反应体系颜色均维持在浅褐色，而对沙门氏菌基因组反应为阳性，也即反应体系颜色由浅褐色变为荧光绿。

实施例12

本实施例用于说明本发明提供的引物系统的检测灵敏度

将沙门氏菌培养液(培养至菌体的od600值为1.2)10倍系列梯度稀释后，选取连续7个稀释度用血球计数板计数，每个稀释度分别取3个样品计数，求出每个稀释度的平均值。以上述10倍梯度稀释的菌悬液65℃灭火10min得到的菌体为模板，按照实施例1的方法对各稀释度样品进行处理。结果显示，本发明提供的检测体系的灵敏度相当于40cfu/反应。由此可以看出，本申请具有较高的灵敏度。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

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<110>中国科学院微生物研究所

<120>用于检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒以及他们的应用和检测沙门氏菌的方法

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