用于产前诊断和监测的新的胎儿标志物的制作方法

相关申请本申请要求享有2006年5月3日提交的美国临时专利申请序列号60/797,456的优先权，其内容通过引用整体并入本文。发明背景妊娠相关状态(包括妊娠或者分娩期间的潜在并发症以及胎儿的遗传缺陷)的早期检测非常重要，因为它允许母体和胎儿安全所需的早期医疗介入。通常采用例如绒毛膜绒毛取样(cvs)或者羊膜穿刺术的方法利用从胎儿分离的细胞来进行产前诊断。尽管操作非常仔细，但这些常规方法均是侵入性的，并对母体和胎儿有一定的风险(taboretal.,lancet1:1287-1293,1986)。在发现母体循环中存在数种类型的胎儿细胞(johansenetal.,prenat.diagn.15:921-931,1995)之后，更重要的是在发现母体血浆和血清中能够检测到循环的无细胞的胎儿dna(loetal.,lancet350:485-487,1997)之后，已经开发了替代这些侵入性方法的产前筛查方法，例如检测胎儿异常的方法。已证明，母体血液中的胎儿dna的含量足够用于遗传学分析，与需要分离和富集胎儿细胞步骤的替代方法相比，并不需要对所述血浆或血清进行复杂的处理。利用基于聚合酶链式反应(pcr)的技术，通过检测母体血浆或者血清中的胎儿dna来实现恒河猴胎儿d(rhd)基因型的检测(loetal.,n.engl.j.med.339:1734-1738,1998)、胎儿性别的确定(costaetal.,n.engl.j.med.346:1502,1998)以及数种胎儿病症的诊断(amicuccietal.,clin.chem.46:301-302,2000；saitoetal.,lancet356:1170,2000；及chiuetal.,lancet360:998-1000,2002)。此外，已报道在先兆子痫(loetal.,clin.chem.45:184-188,1999和zhongetal.,am.j.obstet.gynecol.184:414-419,2001)、胎儿21三体(loetal.,clin.chem.45:1747-1751,1999和zhongetal.prenat.diagn.20:795-798,2000)和妊娠剧吐症(hyperemesisgravidarum)(sekizawaetal.,clin.chem.47:2164-2165,2001)中的母体血浆/血清的胎儿dna定量性异常。美国专利第6,258,540号也公开了用于产前遗传分析的母体血液中胎儿核酸的检测。母体血液中的胎儿rna已经被确定作为妊娠相关状态的诊断工具。例如，美国专利申请号09/876,005公开了基于检测母体血液中胎儿rna的非侵入性技术；美国专利申请号10/759,783还公开了母体血液中存在的某些mrna种类(例如，hcg-β、hcrh、hpl、kiss1、tpfi2和plac1)的数量可以用作诊断、监测或者预测妊娠相关病症的标志物，所述妊娠相关状态例如先兆子痫、胎儿染色体的非整倍性和早产。尽管dna的稳定性为基于胎儿dna的诊断提供了优势，但是这种方法存在较大的限制：胎儿和母体dna均存在于孕妇血液的无细胞部分，例如，血清或者血浆。因此，需要区分胎儿dna和母体dna以保证确切的诊断。公开号为20030044388的美国专利申请号09/944,951首次公开了胎儿和母体dna可以根据它们不同的甲基化模式进行区分。landes等在美国专利申请公开号20030211522中还提出了不同的甲基化标志物可以用于产前诊断。在本文中，许多位于染色体21上的人类基因组dna序列第一次被鉴定为包含基因组dna差别甲基化区域的位点，所述基因组dna来自胎儿或者成人(例如，孕妇)。因此，这些差别甲基化的基因组位点能够正确鉴定或者定量胎儿和母体dna，从而能够可靠的诊断产前状态。发明简述在本发明的第一个方面，提供检测或者监测在怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括下列步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)确定样品中包含cpg的基因组序列的甲基化状态，其中所述胎儿的基因组序列和所述妇女的基因组序列是差别甲基化的，从而区别所述样品中所述妇女的基因组序列和所述胎儿的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫(caenorhabditiselegans))、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；(c)确定胎儿基因组序列的水平；和(d)将所述胎儿基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，所述妇女的基因组序列是甲基化的，而胎儿的基因组序列是非甲基化的。在其他实施方式中，所述妇女的基因组序列是非甲基化的，而胎儿的基因组序列是甲基化的。在一些实施方式中，通过用差别修饰甲基化和非甲基化dna的试剂处理样品来实施步骤(b)。例如，所述试剂可以包括亚硫酸氢盐；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割甲基化dna的酶；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割非甲基化dna的酶。在一些实施方式中，通过甲基化特异性pcr来实施步骤(b)。在本发明的第二个方面，提供检测或者监测在怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女的生物样品获得dna，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)用亚硫酸氢盐处理步骤(a)的dna；和(c)利用步骤(b)的dna和两条引物进行扩增反应来扩增包含cpg的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自：cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫)、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和其中两条引物中的至少一条与胎儿基因组序列差别结合；和(d)将从步骤(c)扩增的基因组序列的部分的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，扩增反应是聚合酶链式反应(pcr)，例如甲基化特异性pcr。在其他实施方式中，扩增反应是基于核酸序列的扩增、链置换反应或者分枝dna扩增反应。该方法以及本发明第一个方面描述的方法，适合于检测或者监测状态，所述状态诸如先兆子痫、早产、妊娠剧吐症、异位妊娠、染色体非整倍性(例如，21三体)和宫内发育迟缓。在本发明的第三个方面，提供检测和监测妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女的生物样品获得dna，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化dna的试剂处理步骤(a)的dna；(c)确定来自步骤(b)的包含cpg的基因组序列的核苷酸序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自：cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫)、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和(d)将来自步骤(c)的核苷酸序列的模式与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的模式变化提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，所述试剂包括亚硫酸氢盐；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割甲基化dna的酶；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割非甲基化dna的酶。在一些实施方式中，所述方法还可以包括利用步骤(b)的dna和两条引物扩增基因组序列的扩增步骤。例如，所述扩增步骤可以通过pcr进行，所述pcr例如甲基化特异性pcr。在一些实施方式中，通过质谱分析法进行步骤(c)。在其他实施方式中，通过引物延伸进行步骤(c)。其他可以进行步骤(c)的方法包括多核苷酸杂交、实时pcr和电泳。在本发明的第四个方面，提供检测孕妇所怀胎儿21三体的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化dna的试剂处理步骤(a)的样品；(c)分析包含cpg的基因组序列的等位基因，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自：cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫)、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和(d)确定所述等位基因的比例，其中与怀有无21三体的胎儿的妇女的等位基因比例的偏差提示胎儿具有21三体。在一些实施方式中，所述试剂包括亚硫酸氢盐。在其他实施方式中，所述试剂包括一种或者多种优选切割甲基化dna的酶。可选择地，所述试剂可以包括一种或者多种优选切割非甲基化dna的酶。在一些实施方式中，所述方法在步骤(b)后还包括扩增甲基化或者非甲基化基因组序列的扩增步骤。所述扩增步骤可以通过pcr进行，例如甲基化特异性pcr。存在多种可能来进行所要求方法的步骤(c)。例如，步骤可以通过质谱分析、引物延伸分析、实时pcr、多核苷酸杂交或者电泳来进行。在该方法的一些实施方式中，胎儿染色体21上基因组序列的两个不同等位基因包括单核苷酸多态性、插入-缺失多态性或者简单串联重复多态性。在本发明的第五个方面，提供检测或者监测怀有胎儿的妇女中妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)确定样品中包含cpg的基因组序列的水平，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个非甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)和类fem1a(秀丽线虫)；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，步骤(b)包括用差别修饰甲基化和非甲基化胞嘧啶的试剂处理血液样品中存在的dna。该试剂可以包括亚硫酸氢盐，或者可以包括一种或者多种优选切割包括甲基化胞嘧啶的dna的酶，或者可以包括一种或者多种优选切割包括非甲基化胞嘧啶的dna的酶。在一些实施方式中，步骤(b)包括扩增反应，例如聚合酶链式反应(pcr)，尤其是甲基化特异性pcr。扩增反应还可以是基于核酸序列的扩增、链置换反应、分枝dna扩增反应。在一些实施方式中，通过电泳或者多核苷酸杂交确定基因组dna序列的水平。所述方法适合于检测或者监测许多妊娠相关病症，包括先兆子痫、早产、妊娠剧吐症、异位妊娠、21三体和宫内发育迟缓。在本发明的第六个方面，提供检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)确定样品中包含cpg的基因组序列的水平，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，步骤(b)包括用差别修饰甲基化和非甲基化胞嘧啶的试剂处理血液样品中存在的dna。该试剂可以包括亚硫酸氢盐，或者可以包括一种或者多种优选切割包括甲基化胞嘧啶的dna的酶，或者可以包括一种或者多种优选切割包括非甲基化胞嘧啶的dna的酶。在一些实施方式中，步骤(b)包括扩增反应，例如聚合酶链式反应(pcr)，尤其是甲基化特异性pcr。扩增反应还可以是基于核酸序列的扩增、链置换反应、分枝dna扩增反应。在一些实施方式中，通过电泳或者多核苷酸杂交确定基因组dna序列的水平。所述方法适合于检测或者监测许多妊娠相关病症，包括先兆子痫、早产、妊娠剧吐症、异位妊娠、21三体和宫内发育迟缓。在如上所述的全部方面内实施本发明时，在一些情况下cpg岛可以用作包含cpg的基因组序列，而在其它情况下包含cpg的基因组序列可以不是cpg岛。在所有的方面，本发明的方法可以被进行而无需任何实施于妇女的步骤。在这些实施方式中，本发明的方法省略从妇女获得生物样品的步骤，并且从对样品进行的第一所述步骤开始。本申请所有其他公开的内容都同等地应用于这些实施方式，除了上下文另外明确要求的。因此，该实施方式第一个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)确定来自妇女的生物样品中包含cpg的基因组序列的甲基化状态，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液，并且其中胎儿的基因组序列与妇女的基因组序列是差别甲基化的，从而区别样品中妇女的基因组序列和胎儿的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫)、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)和染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；(c)确定胎儿的基因组序列的水平；和(d)将所述胎儿基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第二个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)用亚硫酸氢盐处理来自妇女的生物样品的dna，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(c)利用步骤(b)的dna和两条引物进行扩增反应以扩增包含cpg的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫)、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和其中两条引物中的至少一条与胎儿基因组序列差别结合；和(d)将步骤(c)扩增的基因组序列的部分的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第三个方面的方法变为：检测和监测妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化dna的试剂处理来自妇女的生物样品的dna，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(c)确定步骤(b)的包含cpg的基因组序列的核苷酸序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫)、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和(d)将步骤(c)的核苷酸序列的模式与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的模式变化提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第四个方面的方法变为：检测孕妇怀有的胎儿中21三体的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化dna的试剂处理来自妇女的生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(c)分析包含cpg的基因组序列的等位基因，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自：cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)、类fem1a(秀丽线虫)、cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和(d)确定所述等位基因的比例，其中与怀有无21三体的胎儿的妇女的等位基因比例的偏差提示胎儿具有21三体。类似地，该实施方式第五个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)确定来自妇女的生物样品中包含cpg的基因组序列的水平，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个非甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自cgi137、磷酸二酯酶9a(pde9a)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)和类fem1a(秀丽线虫)；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第六个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)确定来自妇女的生物样品中包含cpg的基因组序列的水平，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的dna序列组成，所述基因组位点选自：cgi009、羰基还原酶1(cbr1)、唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)、染色体21开放阅读框29(c21orf29)、羧化全酶合成酶(hlcs)和cgi132；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。附图简述图1.配对胎盘组织和母体血细胞中cgi137(a).a区和(b).b区的克隆和亚硫酸氢盐测序。在第一排对各个cpg位点编号，相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编(humanmay2004(hg17)assemblyoftheucscgenomebrowser)的chr21:46,249,636(+1)定义其核苷酸位置。后面每排显示通过克隆分离的单个dna分子中cpg位点的甲基化状态。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的cpg位点。来自胎盘组织样品的克隆用前缀“pln”标记，而来自母体血细胞的克隆用前缀“mbn”标记。通过“pln”或者“mbn”后相同的样品编号表示来自相同怀孕个体的胎盘和母体血细胞。图2.针对cgi137(a).a区和(b).b区内被研究的各个cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:46,249,636(+1)的核苷酸位置命名。图3.针对妊娠末三个月和妊娠头三个月a区(a和b)、b区(c和d)和c区(e)的pde9a内各个被研究cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。对于图3a和图3b的x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:42,978,424(+1)反链的核苷酸位置命名；以及图3c和图3d，相对于chr21:42,978,718(+1)的正链；图3e，相对于chr21:42,978,005(+1)的正链。图4.针对(a).妊娠末三个月和(b).妊娠头三个月的ppp1r2p2a区内，以及(c).妊娠末三个月的ppp1r2p2b区内各个被研究cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,180,493(+1)的核苷酸位置命名。图5.针对类fem1a(秀丽线虫)(a).a区和(b).b区内各个被研究的cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:14,056,070(+1)的核苷酸位置命名。图6.针对cgi009内各个被研究的cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:25,855,701(+1)的核苷酸位置命名。图7.针对羰基还原酶1内各个被研究的cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,363,538(+1)的核苷酸位置命名。图8.针对唐氏综合症细胞粘附分子内各个被研究的cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:41,139,872(+1)的核苷酸位置命名。图9.针对c21orf29内各个被研究的cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:44,953,288(+1)的核苷酸位置命名。图10.配对胎盘组织和母体血细胞中cgi111的克隆和亚硫酸氢盐测序。在第一排对各个cpg位点编号，相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:44,699,072(+1)定义其核苷酸位置。后面每排显示通过克隆分离的单个dna分子中cpg位点的甲基化状态。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的cpg位点。来自胎盘组织样品的克隆用前缀“pln”标记，而来自母体血细胞的克隆用前缀“mbn”标记。通过“pln”或者“mbn”后相同的样品编号表示来自相同怀孕个体的胎盘和母体血细胞。图11.针对cgi121内各个被研究的cpg位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在x轴，各个cpg位点用它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:45,262,112(+1)的核苷酸位置命名。图12.针对cgi137非甲基化形式的同质massextend(homogeneousmassextend)分析的图示。显示跨越扩增区的核苷酸序列。在亚硫酸氢盐转变的序列(seqidno:2)上比对原始dna序列(seqidno:1)。cpg位点用“++”符号表示。另外对cpg位点进行了编号，该编号对应于图1a和图2a和表2a中的编号。不是cpg二核苷酸部分的胞嘧啶残基用“:”符号表示。显示的亚硫酸氢盐转变的序列基于全部cpg位点都是甲基化的这个假设。在亚硫酸氢盐转变的序列下面显示正向、延伸和反向引物(seqidnos:3-5)的比对。图13.针对cgi137非甲基化形式的同质massextend分析的质谱仪描记。纯胎盘dna、母体血沉棕黄层dna、95:5(母体血沉棕黄层dna:胎盘dna)混合物、分娩前和分娩后的母体血浆以及无模板对照(ntc)的结果被显示。对于所有的质谱，x轴显示被检测延伸产物(显示为锐峰)的分子量，而y轴显示任意单位(arbitraryunits)的强度。非甲基化分子的预期位置如标记所示。图14.(a).羧化全酶合成酶a区、(b).b1区和(c).b2区的组合亚硫酸氢盐限制性分析(combinedbisulfiterestrictionanalysis,cobra)分析。分析了两个21三体胎盘，两个妊娠头三个月正常胎盘，两个妊娠末三个月正常胎盘和两个妊娠头三个月母体血细胞(血沉棕黄层)。pcr产物经过(+)或者不经过(-)bstui酶消化。通过更小的消化产物的出现来检测dna甲基化。在凝胶电泳中使用1kbladder(invitrogencarlsbad,ca)(m)。图15.cgi009的cobra分析。分析了两个21三体胎盘，两个妊娠头三个月正常胎盘，两个妊娠末三个月正常胎盘和两个妊娠头三个月母体血细胞(血沉棕黄层)。pcr产物经过(+)或者不经过(-)bstui酶消化。通过更小的消化产物的出现来检测dna甲基化。在凝胶电泳中使用1kbladder(invitrogencarlsbad,ca)(m)。图16.cgi132的cobra分析。分析了两个21三体胎盘，两个妊娠头三个月正常胎盘，两个妊娠末三个月正常胎盘和两个妊娠头三个月母体血细胞(血沉棕黄层)。pcr产物经过(+)或者不经过(-)bstui酶消化。通过更小的消化产物的出现来检测dna甲基化。在凝胶电泳中使用1kbladder(invitrogencarlsbad,ca)(m)。图17.胎盘组织和母体血细胞中hlcsb2区的克隆和亚硫酸氢盐测序。在第一排对各个cpg位点编号，相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:37,274,682-37,275,036的反链定义其核苷酸位置。后面每排显示通过克隆分离的单个dna分子中cpg位点的甲基化状态。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的cpg位点。来自21三体、正常妊娠头三个月和正常妊娠末三个月胎盘组织样品的克隆分别用前缀“t21pln”、“正常pln妊娠头三个月”和“正常pln妊娠末三个月”标记，而来自母体血细胞的克隆用前缀“血沉棕黄层”标记。通过前缀后的样品编号表示来自不同怀孕个体的胎盘和母体血细胞。图18.胎盘组织和母体血沉棕黄层中hlcsdna的定量。甲基化指数被定义为限制性酶切后的hlcsdna浓度与相同样品的模拟消化对照中测定的总浓度的比值。来自胎盘组织的dna被标记为“正常pln”，而来自母体血沉棕黄层的dna被标记为“mbc”。图19.妊娠末三个月母体血浆中的胎儿特异性hlcs检测。在经过(图19a)或者不经过(图19b)甲基化敏感的限制性酶处理的母体血浆样品中检测到hlcs信号。分娩前血浆样品被标记为“前”，而分娩后血浆样品被标记为“后”。在消化反应中使用限制性酶hpaii和bstui，在图中标记为“(+)”。不经过酶处理的模拟消化被标记为“(-)”。定义本申请使用的术语“妊娠相关病症”是指可能影响孕妇、该孕妇所怀的胎儿或者孕妇和胎儿两者的任何状态或者疾病。这种状态或者疾病可能在有限的时间段显示其症状，例如在妊娠或者分娩期间，或者可能在胎儿出生后持续其一生。妊娠相关病症的一些实例包括异位妊娠、先兆子痫、早产和胎儿染色体异常例如21三体。本文使用的“包含cpg的基因组序列”是指位于个体(例如人类胎儿或者孕妇)基因组确定位置的dna序列的片段。通常，“包含cpg的基因组序列”至少长15个核苷酸，并且包含至少一个胞嘧啶。优选地，它的长度可以至少为30、50、80、100、150、200、250或者300个核苷酸，并且包含至少2、5、10、15、20、25或者30个胞嘧啶。对于给定位置的任一“包含cpg的基因组序列”，例如，在围绕染色体21上给定遗传位点(例如cpg岛cgi137，pde9a，cgi009，等等)的区域内，个体与个体之间，甚至是相同个体的等位基因与等位基因之间可能存在核苷酸序列变化。通常，这种围绕确定遗传位点(例如，cpg岛)的区域包含所述位点以及上游和/或下游序列。每个上游或者下游序列(分别从遗传位点的5'或者3'边界开始计算)的长度可以达到10kb，在其它情况下可以达到5kb、2kb、1kb、500bp、200bp或者100bp。此外，“包含cpg的基因组序列”可以包括转录为蛋白产物或并不转录为蛋白产物的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列可以是蛋白-编码序列、非蛋白-编码序列(例如转录启动子)或者其组合。本申请的“cpg岛”描述了在基因组中发现的dna序列的片段，其具有最短的长度、最低的gc含量以及观察到的cpg频率/预期cpg频率(ocf/ecf)的最低比例。yamada等(genomeresearch14:247-266,2004)描述了确定cpg岛的一组标准：其长度必须至少是400个核苷酸，gc含量必须大于50％，并且ocf/ecf比例必须大于0.6。其他人(takaietal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:3740-3745,2002)对cpg岛的定义没有这么严格：序列长度至少为200个核苷酸，gc含量大于50％，并且ocf/ecf比例大于0.6。本申请使用的染色体21上“cpg岛”的概念符合任意现有计算程序提供的cpg岛模式，所述程序设计用于根据上文描述的标准扫描染色体，其包括在筛选过程中当利用100、200或者300个核苷酸的窗口大小或者1、2或者3个核苷酸的迁移或者步进大小(stepsizes)时获得的结果。如本说明书的表1所示，本公开中命名的各个cpg岛还通过它们在genbank中对应的基因组重叠群(contig)登录号、版本和区域，相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编(genome.ucsc.edu)的染色体21序列的染色体位置，以及它们在给定条件下被pcr引物扩增的能力进行限定。本文使用的术语“表观遗传状态”是指除了一级核苷酸序列以外的核酸(例如，dna或者rna)分子水平的任何结构特征。例如，基因组dna的表观遗传状态可以包括其二级或者三级结构，所述结构由例如其甲基化模式或者其与细胞蛋白的结合来决定或者受到它们的影响。当本申请使用术语“甲基化模式”或者“甲基化状态”来描述基因组序列的甲基化状态时，是指位于与甲基化相关的特定基因组位点的dna片段的特征。这种特征包括，但不限于，该dna序列内的任意胞嘧啶(c)残基是否是甲基化的，甲基化c残基的位置，任意特定残基序列中的甲基化c百分比，以及甲基化的等位基因差异，所述差异归因于诸如等位基因来源的差异。术语“甲基化模式”或者“甲基化状态”还指生物样品中任何特定残基序列的甲基化c或者非甲基化c的相对或者绝对浓度。本文使用的术语“单核苷酸多态性”或者“snp”是指在相同基因组序列的不同等位基因内，存在于单核苷酸残基的多核苷酸序列变化。如果基因组序列在蛋白生成期间被转录，则该变化可以发生在基因组序列的编码区域或者非编码区域(即，启动子区域)内。检测一个或者多个snp可以区别单个基因组序列的不同等位基因。本文使用的术语“血液”是指从孕妇或者检测妊娠可能性的妇女获得的血液样品或者制品。该术语包括全血或者血液的任何组分，例如常规定义的血清和血浆。本文使用的术语“亚硫酸氢盐”包括所有类型的亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠，其能够将胞嘧啶(c)化学转化成尿嘧啶(u)而不化学修饰甲基化胞嘧啶，因此可基于dna的甲基化状态差别修饰dna序列。本文使用的“差别修饰”甲基化或者非甲基化dna的试剂包括，修饰甲基化和/或非甲基化dna，且通过该过程从甲基化和非甲基化的dna产生可区别产物，从而允许鉴定dna甲基化状态的任何试剂。这类过程可以包括，但不限于，化学反应(例如通过亚硫酸氢盐的c→u转变)和酶处理(例如甲基化依赖的核酸内切酶切割)。因此，优选切割或者消化甲基化dna的酶是当dna是甲基化的时候以高很多的效率切割或者消化dna分子的酶，但是当dna不是甲基化的时候，优选切割或者消化非甲基化dna的酶显示显著更高的效率。术语“核酸”或者“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(dna)或者核糖核酸(rna)以及其单链或者双链形成的聚合物。除非具体限定，该术语包括了包含天然核苷酸已知类似物的核酸，所述类似物与参照核酸具有类似的结合性质，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另外指出，特定核酸序列还提示性地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，同源基因，单核苷酸多态性(snps)，和互补序列，以及明确指出的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生序列实现，该序列中一个或者多个挑选的(或者全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(batzeretal.,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsukaetal.,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolinietal.,mol.cellprobes8:91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cdna和基因编码的mrna互换使用。术语“基因”表示参与产生多肽链的dna片段；它包括编码区前后参与基因产物的转录/翻译和转录/翻译调节的区域(前导区(leader)和尾区(trailer))，以及各个编码片段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。在本申请中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可以互换使用以指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或者多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，所述术语还适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即，抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其功能类似于天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及之后被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。本文的氨基酸可以用公知的3字母符号或者1字母符号表示，其由iupac-iub生化命名委员会推荐。同样地，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码表示。当在本申请中使用时，“增加”或者“减少”是指数量相对于建立的标准对照的可检测的阳性或者阴性变化。增加是阳性变化，优选是对照值的至少10％，更优选50％，仍然更优选2倍，甚至更优选至少5倍，和最优选至少10倍。类似地，减少是阴性变化，优选是对照的至少10％，更优选50％，仍然更优选至少80％，和最优选至少90％。在本申请中按照如上所述的相同方式使用表示数量相对于比较基准的变化或者差异的其他术语，例如“更多”或者“更少”。本文使用的“多核苷酸杂交方法”指依据多核苷酸形成watson-crick碱基配对的能力，在合适的杂交条件下，利用已知序列的多核苷酸探针来检测多核苷酸存在和/或数量的方法。这种杂交方法的实例包括southern印记和northern印记。本文使用的“引物”是指可在扩增方法(例如聚合酶链式反应(pcr))中使用的寡核苷酸，基于对应于特定基因组序列的多核苷酸序列来扩增核苷酸序列，例如，位于染色体21上的cpg岛cgi137、pde9a或者cgi009内的所述特定基因组序列，其处于各种甲基化状态。用于扩增多核苷酸序列的pcr引物中的至少一个对于所述序列是序列特异性的。本文使用的“标准对照”是指样品，它包括适用于本发明方法的预定数量或者甲基化模式(其可以包括与甲基化有关的多个不同和可分辨特征)的基因组序列，以便比较特定基因组序列的数量或者甲基化状态，例如位于染色体21上的cpg岛cgi137、pde9a或者cgi009内的所述特定基因组序列，其存在于测试样品中。作为标准对照的样品提供目的基因的平均数量或者甲基化模式，其在怀有正常胎儿的平均且健康孕妇的血液中对于妊娠期间确定时间(例如，妊娠头三个月)来说是典型的，所述两者均没有患任何妊娠相关病症或者并发症的风险。在描述孕妇的情况下，术语“平均”是指所述妇女没有患至少一种相关状态，例如怀有染色体异常的胎儿，或者患有妊娠相关状态(例如，异位妊娠、先兆子痫或者早产)。当用于其他情况时，术语“平均”是指某些特征，例如在所述妇女血液中发现的母体和胎儿来源的特定基因组序列(例如，位于染色体21上cpg岛cgi137、pde9a或者cgi009内)的甲基化模式，其代表怀有染色体正常胎儿并且对任何妊娠相关疾病或者状态不易感的健康妇女的随机挑选组。该挑选组应该包括足够数量的妇女，这样的话这些妇女中目的基因组序列的平均数量或者甲基化模式合理地准确反映了怀有健康胎儿的一般健康孕妇人群中的相应模式。此外，挑选组的妇女通常与被检验血液以指示潜在妊娠相关病症的妇女具有类似的孕龄。实施本发明的优选孕龄可以根据被筛查的病症而改变。例如，优选在妊娠中三个月筛查孕妇先兆子痫风险，而优选尽早筛查和诊断胎儿的染色体非整倍性。此外，用于测试的优选孕龄还可以取决于被测的目的基因。本文使用的术语“先兆子痫”指在妊娠过程中发生的疾病状态，其主要症状为多种形式的高血压并常伴有尿蛋白和水肿(肿胀)。先兆子痫有时称为妊娠毒血症，它与称为“惊厥”的更严重的病症有关，其为先兆子痫结合痉挛。尽管这些状态在出生后可立即发展或在妊娠20周之前发展，但是这些状态通常在妊娠的后半程(20周后)发展。本文使用的术语“早产”或“提前分娩”指在约40周的完全妊娠期届满前3周以上发生分娩的状态，如果不治疗常导致早产。术语“妊娠剧吐症”是指妊娠期间，尤其在妊娠头三个月强烈、持久的恶心和呕吐。恶心和呕吐可以导致脱水，并妨碍了妊娠必需的体重增加。“异位妊娠”是指异常妊娠，其中受精卵被植入到子宫的外面。尽管在异位妊娠的大多数情况下卵子迁入输卵管，但该术语还包括受精卵被植入妇女卵巢、腹部或者子宫颈的异常妊娠。发明详述i.引言1997年首次报道了胎儿dna在母体血浆中的存在，这提供了仅通过分析母体血液样品而进行非侵入性产前诊断的可能(loetal.,lancet350:485-487,1997)。迄今为止，已经发展出许多潜在的临床应用。尤其是，已经发现母体血浆中胎儿dna浓度的数量异常与许多妊娠相关病症有关，包括先兆子痫、早产、产前出血、侵入性胎盘形成(invasiveplacentation)、胎儿唐氏综合症和其他胎儿染色体非整倍性。因此，母体血浆的胎儿dna分析可以作为监测胎儿母体健康的潜在标志物。但是，胎儿dna与背景母体dna在母体血浆中共存。因此，大部分报道的应用都依赖于y染色体序列的检测，因为这些y染色体序列可以方便地与母体dna区分。这种方法使现有分析的适用范围局限于全部妊娠的仅50％，即怀有男性胎儿的那些。因此，非常需要开发用于母体血浆检测的不依赖于性别的胎儿dna标志物。先前已经证明了可以根据甲基化状态的差异区别胎儿和母体dna(美国专利申请公开号20030044388)。甲基化是表观遗传现象，是指改变表型但不涉及dna序列改变的过程。通过利用展示基因组印记的位点h19的父系和母系遗传等位基因的dna甲基化状态差异(差别甲基化，因此造成单基因两个等位基因的差别表达，其与特定等位基因的亲本来源有关)，本发明人之一(y.m.d.lo)和他的团队第一次证明了利用表观遗传标志物从母体血浆检测胎儿来源的母系遗传dna序列的可行性(poonetal.,clin.chem.48:35-41,2002)。landes等还提出了表观遗传标志物用于非侵入性产前诊断的用途(美国专利申请公开号20030211522)。本发明人最近证明了在母体血浆中可以检测到胎盘来源的rna(ngetal.,proc.natl.acad.sci.usa100:4748-4753,2003)。另一方面，已经表明正常个体的血浆dna主要来自造血细胞(luietal.,clin.chem.48:421-427,2002)。因此，有如下假设：母体dna的主要来源是外周血细胞，而胎盘是释放入母体血浆的胎儿dna的可能来源。因此，开发用于母体血浆检测的通用胎儿特异性dna标志物的一个策略是鉴定在胎盘和母体外周血细胞之间差别甲基化的基因。本发明人第一次证明，位于染色体21上特定基因组位点的许多基因组序列在来自胎儿(例如，来自胎盘)的胎儿dna和来自母体外周血细胞的母体dna之间是差别甲基化的。因此该发现提供区别胎儿和母体基因组dna的新方法，以及用于非侵入性产前诊断的新方法。ii.一般方法利用分子生物学领域的常规技术进行本发明。公开本发明所用一般方法的基础性文章包括sambrook和russell,molecularcloning,alaboratorymanual(分子克隆：实验室手册)(3rded.2001)；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual(分子转移与表达：实验室手册)(1990)和currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物学实验方法)(ausubeletal.,eds.,1994)。对于核酸，大小单位是千碱基(kb)或者碱基对(bp)。这根据琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶电泳、被测序的核酸或者公开的dna序列来估算。对于蛋白，大小单位是千道尔顿(kda)或者氨基酸残基数目。蛋白大小根据凝胶电泳、被测序的蛋白、衍生的氨基酸序列或者公开的蛋白序列来估算。可以化学合成没有商品化的寡核苷酸，例如，根据beaucage&caruthers,tetrahedronlett.22:1859-1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法，利用自动合成仪，如vandevanteretal.,nucleicacidsres.12:6159-6168(1984)中所述。利用本领域公认的任何策略进行寡核苷酸的纯化，例如，非变性丙烯酰胺凝胶电泳或者阴离子交换高效液相色谱法(hplc)，如在pearson&reanier,j.chrom.255:137-149(1983)中的描述。本发明的基因组序列，例如，位于染色体21上cpg岛内的序列，诸如cgi137、pde9a和cgi009，以及合成寡核苷酸的多核苷酸序列，其可以利用例如wallaceetal.,gene16:21-26(1981)描述的测序双链模板的链终止方法进行验证。iii.血液样品的获得和dna的提取本发明涉及分析母体血液中发现的胎儿dna的表观遗传状态，将其作为非侵入性方法以检测妊娠相关状态或者病症的存在和/或监测它们的进展。因此，实施本发明的第一步是获得来自孕妇的血液样品并从样品中提取dna。a.血液样品的获得从处于适合检验的孕龄的孕妇获得血液样品，所述检验采用本发明的方法。如下文所述，根据所检测的病症，所述合适的孕龄可以不同。根据医院或者诊所通常采用的标准步骤进行妇女血液的采集。采集适量的外周血，例如通常5-50ml，并可以在进一步制备前按照标准步骤保存。b.血液样品的制备根据本发明，对母体血液中发现的胎儿dna的分析可以使用诸如全血、血清或者血浆。从母体血液制备血清或者血浆的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以将孕妇的血液置于包含edta的管或者专门商品例如vacutainersst(bectondickinson,franklinlakes,nj)中防止血液凝固，然后可以通过离心从全血获取血浆。另一方面，在血液凝固后可以经过或者不经过离心获得血清。如果使用离心，则通常但不是唯一的，在合适的速度进行，例如，1,500-3,000×g。血浆或者血清在被转移到新管进行dna提取前可以经历另外的离心步骤。除了全血的非细胞部分外，也可以从血沉棕黄层(buffycoat)部分富集的细胞部分回收dna，所述血沉棕黄层部分是在离心妇女的全血样品并去除血浆后获取的。c.dna的提取存在许多已知的从生物样品(包括血液)提取dna的方法。可以遵循dna制备的一般方法(例如，sambrook和russell描述，molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：实验室手册)3ded.,2001)；各种商品化供应的试剂或者试剂盒，例如qiaampdnaminikitorqiaampdnabloodminikit(qiagen,hilden,germany)，genomicpreptmblooddnaisolationkit(promega,madison,wi)和gfxtmgenomicblooddnapurificationkit(amersham,piscataway,nj)，也可用于从孕妇的血液样品中获取dna。也可以使用这些方法中的不止一种的组合。iv.dna的甲基化特异性化学修饰在从孕妇的血液样品提取dna后，使用能够以甲基化差别方式化学修饰dna的试剂处理dna，即，处理后甲基化胞嘧啶(c)残基和非甲基化c残基将产生不同的并且是可区别的化学结构。通常，这种试剂与dna分子中非甲基化的c残基反应，并将每个非甲基化的c残基转变为尿嘧啶(u)残基，而甲基化的c残基保持不变。这种c→u转变允许根据核酸一级序列的改变来检测和比较甲基化状态。适合于该目的的示例性试剂是亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠。使用亚硫酸氢盐化学修饰dna的方法是本领域公知的(参见，例如，hermanetal.,proc.natl.acad.sciusa93:9821-9826,1996)，在此不做赘述。本领域技术人员会认识到，未在本文中指定但具有相同的差别化学(或者通过任何其他机制)修饰甲基化和非甲基化dna性质的任何其他试剂均可用于实施本发明。例如，dna的甲基化特异性修饰也可以通过甲基化敏感的限制性酶来实现，其中一些限制性酶通常切割非甲基化的dna片段而不切割甲基化的dna片段，而其他限制性酶(例如，甲基化依赖的核酸内切酶mcrbc)切割包含甲基化胞嘧啶的dna而不切割非甲基化的dna。此外，化学修饰和限制性酶处理的组合，例如组合的亚硫酸氢盐限制性分析(cobra)，可用于实施本发明。v.多核苷酸序列扩增和确定在以甲基化差别方式化学修饰dna后，所述被处理的dna接受基于序列的分析，以致一个或者多个来自胎儿dna的本发明基因组序列(例如，位于染色体21上cpg岛内的序列，诸如cgi137、pde9a和cgi009)可以与其来自母体dna的对应物进行区分，而且可以确定胎儿基因组序列的甲基化模式，并与标准对照进行比较。此外，一旦确定胎儿来源的一个特定基因组序列与母体对应物相比是高甲基化或者低甲基化的，则可以根据其特异性的甲基化状态确定该胎儿基因组序列的数量。随后，可以将该数量与标准对照值进行比较，并将其作为某些妊娠相关病症潜能的指示。a.核苷酸序列的扩增在对甲基化特异性修饰后的基因组序列进行序列分析前，可选地进行扩增反应。在本发明的一些实施方式中，进行扩增以优选扩增染色体21上包含cpg的基因组序列，所述序列具有特定的甲基化模式，以至于只检测和分析一个特定来源的基因组序列，所述来源例如来自胎盘或者胎儿其他组织。各种多核苷酸扩增方法是成熟的，并且在研究中经常被使用。例如，用于多核苷酸序列扩增的聚合酶链式反应(pcr)的一般方法是本领域公知的，因此在本文中不做赘述。关于pcr方法、实验步骤和设计引物的原则的综述，参见，例如，innis,etal.,pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(pcr实验步骤：方法与应用导论),academicpress,inc.n.y.,1990。从例如rochemolecularsystems的商品供应商处也可获得pcr试剂和实验步骤。通常利用耐热酶通过自动化过程进行pcr。在该过程中，反应混合物的温度通过变性区、引物退火区和延伸反应区自动循环。特别适合该目的的设备是商品化供应的。虽然在实施本发明时通常使用靶多核苷酸序列(例如，染色体21上包含cpg的基因组序列，其中胎儿和母体序列是差别甲基化的)的pcr扩增，但是本领域技术人员将认识到，也可通过任何已知的方法扩增母体血液样品中发现的基因组序列，所述已知的方法例如连接酶链式反应(lcr)、转录介导的扩增以及自我持续序列复制或者基于核酸序列的扩增(nasba)，这些方法中的每一种都提供了充分的扩增。最近开发的分枝dna技术也可用于定性证明本发明特定基因组序列的存在(这代表了特定的甲基化模式)，或者定量测定母体血液中该特定基因组序列的数量。用于临床样品中核酸序列直接定量的分枝dna信号扩增的综述参见nolte,adv.clin.chem.33:201-235,1998。b.多核苷酸序列的确定多核苷酸序列确定的技术也是成熟的，并且在相关研究领域被广泛实施。例如，多核苷酸测序的基本原则和一般技术在分子生物学和重组遗传学相关的各种研究报告以及论文中均有描述，例如wallaceetal.，见上文；sambrook和russell，见上文，以及ausubeletal.，见上文。不论是手工还是自动化的，研究实验室常规实施的dna测序方法均可用于实施本发明。为了实施本发明的方法而适于检测多核苷酸序列变化(例如，c→u)的其他方法包括但不限于质谱分析、引物延伸、多核苷酸杂交、实时pcr和电泳。vi.建立标准对照为了建立标准对照以实施本发明的方法，首先选择怀有健康胎儿的一组健康孕妇。这些妇女具有相似的孕龄，处于适合利用本发明方法筛查状态的妊娠时间段，所述状态诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产。类似地，利用来自一组未怀孕健康妇女的样品建立标准对照。通过成熟的、常规使用的方法来确认所选孕妇及其所怀胎儿的健康状况，所述方法包括但不限于监测所述妇女的血压、记录分娩的发生和利用cvs和羊膜穿刺术进行胎儿遗传分析。此外，所选择的这组怀有健康胎儿的健康孕妇必须有合理的规模，以致从该组获得的母体血液中来源于胎儿的本发明基因组序列的平均数量或者母体血液中胎儿基因组序列的甲基化模式能够合理地代表怀有健康胎儿的健康妇女总群体的正常或者平均数量或者甲基化模式。优选地，所选择的组包括至少10名妇女。胎儿基因组序列甲基化模式的标准对照可以反映该特定基因组序列甲基化状态的多种不同的并且可以区分的方面。例如，甲基化模式的一个方面是任何给定c残基是甲基化还是非甲基化的；另一个方面是特定基因组序列内甲基化c碱基的数目；该模式的还有一个方面是任何指定位置的甲基化c的百分比。甲基化模式的其他方面还可以包括，但不限于，甲基化的等位基因差异、差别甲基化等位基因的比例，等等。胎儿基因组序列的甲基化模式也可以根据组织类型(例如，胎盘或者其他胎儿组织)而变化。因此，对于用于检验的不同胎儿组织可以建立单独的标准对照。一旦依据所选健康对照组中每位妇女的个体值建立母体血液中特定胎儿基因组序列的平均水平或者甲基化模式，则该平均值或者中值或者代表值或者模式被认为是标准对照。因此，任何包含相似数量的胎儿基因组序列或者相似甲基化模式的胎儿基因组序列的血液样品都可以被用作标准对照。此外，也可以人工配置包含平均量或者中间量或者代表量的基因组dna序列的溶液，或者配置包含平均或者中间或者代表性甲基化模式的基因组dna序列的溶液，将其作为标准对照。此外，对于胎儿来源基因组序列的甲基化模式的不同方面还可以建立单独的标准对照。实施例以下仅以说明方式而非限定性的方式提供了下列实施例。本领域技术人员会容易地认识到，通过改变或者修改各种非关键参数也能产生基本相同或者相似的结果。实施例1我们的目的在于鉴定母体血液中胎儿特异性的表观遗传标志物。先前的数据表明母体血浆中的胎儿dna分子主要来自胎盘(chimetal.,procnatlacadsciusa.,102,14753-14758；masuzakietal.,jmedgenet41,289-292,2004；florietal.,humreprod19,723-724,2004)，而母体血浆中的背景dna可以来自母体血细胞(luietal.,clinchem48,421-427,2002)。因此，为了鉴定胎儿表观遗传标志物，评估了胎盘组织和母体血细胞中遗传位点的甲基化模式，其目的在于鉴定证明两种组织类型中差别甲基化的位点。这类标志物可以用于妊娠相关状态的产前诊断和监测。材料和方法包含cpg的基因组序列的鉴定dna甲基化是指在cpg二核苷酸中胞嘧啶残基的第5个碳位置添加甲基。通过ucsc基因组生物信息学站点的基因组浏览器(genomebrowseroftheucscgenomebioinformaticssite)(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggatewav)(yamadaetal.,genomeres14,247-266,2004)计算鉴定染色体21q上这类cpg二核苷酸簇。还根据下列标准亚选择(subselected)cpg位点：长度至少为400bp的一段dna序列，其鸟嘌呤和胞嘧啶最低含量为50％，以及观察到的cpg频率/预期cpg频率的最低比例至少为0.6。在鉴定了包含cpg的基因组序列后，我们还将cpg位点进一步向上游和下游扩展到先前鉴定的基因组区域，例如pde9a的a区和c区。个体招募和样品采集在妊娠头三个月和妊娠末三个月从妇女采集胎盘组织和对应的血液样品。从剖宫产后的妊娠末三个月个体和妊娠终止后的妊娠头三个月个体采集胎盘组织。在分娩开始或者进行任何产科操作前将母体血液(10ml)采集到edta采血管。4℃以1600×g离心血液样品10分钟。在小心去除血浆后获得血沉棕黄层部分，并将其保存于-20℃。用磷酸盐缓冲液清洗胎盘组织，并将其保存于-80℃的普通聚丙烯管中。亚硫酸氢盐测序按照制造商的说明书，分别利用qiaampdnaminikit和qiaampdnabloodminikit(qiagen,hilden,germany)从胎盘组织和母体血沉棕黄层提取dna。对于每种样品，将1μgdna进行亚硫酸氢盐转变，按照制造商的说明书，通过cpgenomednamodificationkit(intergen,burlington,ma)将非甲基化胞嘧啶残基转变成尿嘧啶，但保持甲基化胞嘧啶残基不改变。然后利用cpg位点两侧的引物对(表1)对亚硫酸氢盐转变的dna进行pcr扩增。通过两到三次pcr(即a、b和c区)对一些包含cpg的基因组序列进行研究。将引物设计为不结合任何潜在的甲基化胞嘧啶残基。这些引物仅是用于说明，而不应被理解为限制可用于该目的的引物范围。使用taqmanpcrcorereagentkit(appliedbiosystems,fostercity,ca)提供的试剂。表1详细列出了每个pcr的试剂组合物。通常，进行pcr的终反应体积为25μl，含有mgcl2，引物，taqgold，1×bufferii，200μm各种dntp，含有或者不含有二甲亚砜(dmso)或者甜菜碱。加热模式由以下组成：95℃初始变性步骤10分钟，然后是40个循环：95℃1分钟，55℃-65℃的退火温度范围1分钟(表1)，72℃1分钟；以及72℃最后延伸10分钟。为了在单分子解析度分析甲基化状态，利用pgem-teasyvectorsystem(promega,madison,wi)将pcr产物ta-克隆入质粒载体。按照制造商的说明书，利用bigdyeterminatorcyclesequencingv1.1kit(appliedbiosystems)通过循环测序分析阳性重组克隆的插入物。通过genclean柱(genetix)纯化后，将8μl样品添加到12μlhi-di甲酰胺，并在3100dnaanalyzer(appliedbiosystems)上进行分析。表1.染色体21上所研究基因组序列的一致性、定位、引物序列和pcr反应条件。第二和第三栏分别显示美国生物技术信息中心genbank保存的基因组重叠群的各个区域(登录号、版本、起始和终止核苷酸编号)和ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编(genome.ucsc.edu网站提供)的染色体定位(染色体、起始和终止核苷酸编号)。数据比较和统计分析如果序列是胞嘧啶，则cpg位点被记为甲基化的；如果所述序列被胸腺嘧啶残基(尿嘧啶的脱氧对应物)占据，则cpg位点被记为非甲基化的。确定胎盘组织以及母体血液样品中各个cpg位点甲基化胞嘧啶残基的比例。通过χ方分析比较胎盘组织和母体血沉棕黄层之间各个cpg位点的甲基化和非甲基化胞嘧啶的分布。p值<0.05被认为是统计意义上显著不同的。利用sigmastat3.0软件(spss)进行统计分析。结果和讨论在从计算搜索鉴定的包含cpg的基因组序列中，13个位点是本研究的焦点。表1列出了这些位点的名称、染色体位置和genbank登录号。对于所研究的每一位点，分别对胎盘组织和母体血细胞进行亚硫酸氢盐测序。cgi137研究了从5名妊娠末三个月妇女采集的胎盘组织和相应母体血细胞中cgi137的甲基化模式。图1a和图1b分别显示了所有5名受试者的a和b区的亚硫酸氢盐测序数据。各个组的每一排代表一个克隆的亚硫酸氢盐测序结果，而每一栏代表基因组序列内的个体cpg二核苷酸。对于所有5个胎盘组织和母体血细胞样品，均确定全部序列克隆中甲基化克隆的比例，即每个cpg位点的甲基化指数。数据概述于图2a和图2b。可以看出，和母体血细胞相比，胎盘是低甲基化的。进行χ方分析以比较每个cpg位点在胎盘组织和母体血细胞之间的甲基化和非甲基化克隆的分布。对于全部21个cpg位点来说，胎盘和母体血细胞之间的甲基化指数差异是统计意义上显著的(χ方，p<0.0001，表2a和表2b)。表2a.亚硫酸氢盐测序数据和χ方分析的概述，其比较了胎盘组织和母体血细胞在cgi137a区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:46,249,636(+1)的核苷酸位置命名。表2b.亚硫酸氢盐测序数据和χ方分析的概述，其比较了胎盘组织和母体血细胞在cgi137b区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:46,249,636(+1)的核苷酸位置命名。磷酸二酯酶9a(pde9a)研究了从5名妊娠末三个月妇女和5名妊娠头三个月妇女采集的胎盘组织和相应母体血细胞中pde9a的甲基化模式。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，对于a区扩增子，胎盘组织和母体血细胞中被研究的cpg位点的甲基化指数概述于图3a和图3b。b区的相应数据概述于图3c和图3d。对于c区，妊娠末三个月胎盘组织和母体血细胞的比较显示于图3e。通常，与母体血细胞相比，胎盘是低甲基化的。按照上文的描述进行χ方分析以评估两种组织间统计意义上的显著差异。除了妊娠末三个月的cpg2250比较外，其他所有在妊娠头三个月和妊娠末三个月都是统计意义上显著不同的(χ方分析，表3a至表e)。表3a.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠末三个月胎盘组织和母体血细胞在pde9aa区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:42,978,424(+1)反链的核苷酸位置命名。表3b.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠头三个月胎盘组织和母体血细胞在pde9aa区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:42,978,424(+1)反链的核苷酸位置命名。表3c.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠末三个月胎盘组织和母体血细胞在pde9ab区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:42,978,718(+1)的核苷酸位置命名。表3d.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠头三个月胎盘组织和母体血细胞在pde9ab区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:42,978,718(+1)的核苷酸位置命名。表3e.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠末三个月胎盘组织和母体血细胞在pde9ac区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:42,978,005(+1)的核苷酸位置命名。智人蛋白磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基2假基因2(ppp1r2p2)研究了从5名妊娠末三个月妇女和5名妊娠头三个月妇女采集的胎盘组织和相应母体血细胞中ppp1r2p2a区甲基化模式。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，对于a区，胎盘组织和母体血细胞中被研究的cpg位点的甲基化指数概述于图4a和图4b。通常，与母体血细胞相比，胎盘是低甲基化的。按照上文的描述进行χ方分析，以评价两种组织间统计意义上的显著差异。在被研究的cpg位点中，23个在妊娠末三个月是统计上显著不同的，23个在妊娠头三个月是统计上显著不同的(χ方分析，表4a和表4b)。此外，通过克隆和亚硫酸氢盐测序还分析了从5名妊娠末三个月妇女采集的胎盘组织和相应母体血细胞中ppp1r2p2b区cpg位点的甲基化模式。与母体血细胞相比，对于b区的大部分cpg位点，胎盘组织是低甲基化的。b区的甲基化指数概述于图4c。按照上文的描述进行χ方分析，以评价两种组织间统计意义上的显著差异。在12个被研究的cpg位点中，5个是统计上显著不同的(χ方分析，表4c)。表4a.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠末三个月胎盘组织和母体血细胞在ppp1r2p2a区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,180,493(+1)的核苷酸位置命名。表4b.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠头三个月胎盘组织和母体血细胞在ppp1r2p2a区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,180,493(+1)的核苷酸位置命名。表4c.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠头三个月胎盘组织和母体血细胞在ppp1r2p2b区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,180,493(+1)的核苷酸位置命名。类femla(秀丽线虫(c.elegans))研究了从5名妊娠末三个月妇女采集的胎盘组织和相应母体血细胞中类fem1a(秀丽线虫)的甲基化模式。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，对于a区和b区，胎盘组织和母体血细胞中被研究的cpg位点的甲基化指数分别概述于图5a和图5b。通常，与母体血细胞相比，胎盘是低甲基化的。按照上文的描述进行χ方分析，以评价两种组织间统计意义上的显著差异。在被研究的cpg位点中，a区有8个是统计上显著不同的，b区有7个是统计上显著不同的(χ方分析，表5a和表5b)。表5a.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠末三个月胎盘组织和母体血细胞在类fem1a(秀丽线虫)a区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:14,056,070(+1)的核苷酸位置命名。表5b.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠末三个月胎盘组织和母体血细胞在类fem1a(秀丽线虫)b区内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:14,056,070(+1)的核苷酸位置命名。cgi009将来自2例母体血细胞样品的cgi009甲基化模式与2例妊娠头三个月和2例妊娠末三个月胎盘组织样品(从正常妊娠采集)以及2例妊娠头三个月胎盘组织样品(来自怀有21三体胎儿的妊娠)的cgi009甲基化模式进行比较。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，胎盘组织和母体血细胞中被研究的cpg位点的甲基化指数概述于图6。通常，与母体血细胞相比，胎盘是高甲基化的。羰基还原酶1(cbr1)将来自2例母体血细胞样品的cbr1的模式与2例妊娠头三个月胎盘组织样品(从正常妊娠采集)以及2例妊娠头三个月胎盘组织样品(来自怀有21三体胎儿的妊娠)的cbr1的模式进行比较。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，胎盘组织和母体血细胞中被研究的cpg位点的甲基化指数概述于图7。通常，与母体血细胞相比，胎盘是高甲基化的。在20个被研究的cpg位点中，在正常和21三体妊娠的母体血细胞和妊娠头三个月胎盘组织之间全部cpg位点都是统计上显著不同的(χ方分析，表6)。表6.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了正常和21三体的妊娠头三个月胎盘组织与母体血细胞在cbr1内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,363,538(+1)的核苷酸位置命名。唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)将来自2例母体血细胞样品的dscam的甲基化模式与2例妊娠头三个月和2例妊娠末三个月胎盘组织样品(从正常妊娠采集)以及2例妊娠头三个月胎盘组织样品(来自怀有21三体胎儿的妊娠)的dscam的甲基化模式进行比较。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，胎盘组织和母体血细胞中被研究的cpg位点的甲基化指数概述于图8。通常，与母体血细胞相比，胎盘是高甲基化的。在27个被研究的cpg位点中，在正常和21三体妊娠妇女的母体血细胞和妊娠头三个月胎盘组织之间，全部cpg位点都是统计上显著不同的(χ方分析，表7)。表7.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了正常和21三体的妊娠头三个月胎盘组织与母体血细胞在dscam内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:41,139,872(+1)的核苷酸位置命名。染色体21开放阅读框29(c21orf29)将来自2例母体血细胞样品的c21orf29的甲基化模式与1例妊娠头三个月和2例妊娠末三个月胎盘组织样品(从正常妊娠妇女采集)以及2例妊娠头三个月胎盘组织样品(来自怀有21三体胎儿的妊娠妇女)的c21orf29的甲基化模式进行比较。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，胎盘组织和母体血细胞中所研究的cpg位点的甲基化指数概述于图9。通常，与母体血细胞相比，胎盘是高甲基化的。在16个被研究的cpg位点中，母体血细胞和21三体妊娠妇女的妊娠头三个月胎盘组织之间在所有位点是统计上显著差异的，母体血细胞和正常妊娠妇女的妊娠头三个月胎盘组织之间在9个位点是统计上显著差异的，母体血细胞和正常妊娠妇女的妊娠末三个月胎盘组织之间在10个位点是统计上显著差异的(χ方分析，表8)。表8.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了正常和21三体的妊娠头三个月胎盘组织与母体血细胞在c21orf29内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:44,953,288(+1)的核苷酸位置命名。在胎盘组织和母体血细胞之间没有显示差别甲基化模式的遗传位点对于所有被研究的位点来说，没有普遍观察到胎盘组织和母体血细胞之间的差别甲基化。研究了从4名妊娠末三个月妇女采集的胎盘组织和相应母体血细胞的cgi111的甲基化模式。进行克隆和亚硫酸氢盐测序，结果显示于图10。来自母体血细胞和胎盘组织的克隆大部分都是非甲基化的。类似地，对于cgi121来说，除了在cpg位点1603外，来自5名妊娠末三个月妇女的母体血细胞和胎盘组织之间的甲基化模式不是显著不同的(图11和表9)。表9.亚硫酸氢盐测序数据、甲基化指数和χ方分析的概述，其比较了妊娠头三个月胎盘组织和母体血细胞在cgi121内各个cpg位点的甲基化模式。各个cpg位点通过它们相对于ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:45,262,112(+1)的核苷酸位置命名。另一方面，对于kiaa0656、热休克转录因子2结合蛋白(hsf2bp)和col6a1来说，被研究的胎盘组织和母体血细胞均主要是甲基化的，其甲基化指数之间没有显著差异。实施例2在胎盘组织和母体血细胞之间具有差别甲基化模式的包含cg的基因组序列可以用作母体血液检测的胎儿表观遗传标志物。为了将母体血液中胎儿来源的dna分子与母体来源的dna分子进行区分，分析应该针对每个差别甲基化位点的胎盘特异性表观遗传形式的检测。已经开发出针对cgi137胎盘特异性形式(图1)(即非甲基化分子)的分析方法，并评估了其特异性。材料和方法样品处理和dna提取从经历选择性剖宫产分娩的个体采集妊娠末三个月胎盘组织样品和相应的母体血液样品。在分娩前以及分娩后采集母体血液(10ml)到edta管。在4℃以1600×g离心血液样品10分钟。在小心去除血浆后获得血沉棕黄层部分，并将其分开保存于-20℃。以16,000×g将血浆进一步离心10分钟，然后小心地将1.6ml血浆转移清洁的聚丙烯管，注意不要扰动下面的细胞沉淀。用磷酸盐缓冲液清洗胎盘活检组织，并将其保存于-80℃的普通聚丙烯管中。利用qiaampdnaminikit(qiagen,hilden,germany)从胎盘组织提取dna。按照制造商的说明书，通过qiaampdnabloodminikit(qiagen，hilden，germany)从母体血浆和血沉棕黄层提取dna。对于每一胎盘和血沉棕黄层dna样品来说，将1μgdna进行亚硫酸氢盐转变，按照制造商的说明书，通过methylamptmdnamodificationkit(epigentekinc.，newyork，ny)，将非甲基化的胞嘧啶残基转变为尿嘧啶，但保持甲基化的胞嘧啶残基不变。从1.6ml血浆提取的dna也进行亚硫酸氢盐转变。还制备另外等份试样的混合的亚硫酸氢盐转变的dna，其包括由血沉棕黄层和胎盘dna制品按95∶5比例的混合物。同质massextend分析因为在cgi137处胎盘组织相对于母体血细胞是低甲基化的(图1和图2)，因此设计针对检测cgi137非甲基化形式的分析。该分析基于massarray(sequenom，sandiego，ca)平台。为了特异性扩增cgi137的非甲基化形式，设计甲基化特异性引物。图12显示引物定位的说明，而表10列出了引物序列。正向引物跨越cpg位点472、477、481和486。反向引物跨越cpg位点553和561。扩增子跨越genbank登录：nt_011515的坐标：2742998-2743130。将基于同质massextend(hme)实验步骤的引物延伸分析(图12)设计成能够检测cpg位点541的甲基化状态。基本上，引物延伸引物跨越多至cpg位点541的3′核苷酸(表10)。非甲基化分子将通过dd(2′，3′-双脱氧核苷)atp掺入延伸一个核苷酸，而甲基化分子将通过dgtp继之以ddatp的掺入延伸两个核苷酸。然后靠massarraytmanalyzercompact(sequenom)质谱分析的质量差异检测并解析非甲基化和甲基化的分子。表10.针对cgi137非甲基化形式的hme分析的引物序列。引物序列(5’至3’)(seqidno：)正向引物tgttataggtagggatatgttttgtttgacgt(3)反向引物tctctacctacaattctataaaaaacacttatcca(48)延伸引物atccccaacattttccc(49)将分别来自胎盘、母体血沉棕黄层样品和混合物的3μl亚硫酸氢盐转变的dna(相当于亚硫酸氢盐转变前的150ngdna)，以及10μl亚硫酸氢盐转变的血浆dna(相当于从1.6ml母体血浆提取的dna)分别进行25μlpcr反应扩增。每个反应包括含有2.0mmmgcl2(appliedbiosystems)的1×pcr缓冲液(appliedbiosystems,fostercity,ca)，200μmdatp、dgtp和dctp，400μmdutp(appliedbiosystems)，200nm正向和反向引物(integrateddnatechnologies,coralville,ia)以及1uamplitaqdna聚合酶(appliedbiosystems)。pcr反应起始于95℃10分钟，然后是40个循环：94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒；最后在72℃孵育5分钟。用虾碱性磷酸酶处理pcr产物，以将任何残留的dntp去磷酸化，并防止它们掺入后续的引物延伸分析。对于每个25μlpcr反应物，添加0.34μlhme缓冲液(sequenom)、0.6μl虾碱性磷酸酶(sequenom)和3.06μl水。将反应混合物在37℃孵育40分钟，然后在85℃热灭活5分钟。对于引物延伸反应，向10μlpcr产物中添加4μl碱基延伸反应混合物，所述混合物包含1500nm延伸引物(integrateddnatechnologies)、1.15u热测序酶(sequenom)和64μmddatp、ddctp、dttp和dgtp(sequenom)。反应条件是94℃2分钟，继之以75个循环：94℃5秒，52℃5秒，和72℃5秒。利用spectroclean(sequenom)树脂对最终的碱基延伸产物进行纯化，以去除可以干扰质谱分析的盐。向每个碱基延伸产物中添加24微升水和12mg树脂。在旋转器上将最终混合物混合20分钟。在以361g离心5分钟后，利用spectropointnanodispenser(sequenom)将大约10nl反应液点到384-formatspectrochip(sequenom)上，所述spectrochip已经用3-羟基吡啶甲酸基质预点样。利用massarraytmanalyzercompactmassspectrometer(sequenom)从spectrochip获取数据。质谱数据被自动输入spectrotyper(sequenom)数据库进行分析。结果和结论用于massarray分析的质谱显示于图13。在胎盘和分娩前血浆dna样品以及母体血沉棕黄层和胎盘dna的95:5混合物中均可检测到cgi137非甲基化形式的引物延伸产物。这些数据表明该分析对于检测母体血浆和部分浓度低至5％的dna混合物中胎盘来源的cgi137非甲基化形式是灵敏的。在分娩后的母体血浆样品中没有检测到信号，这证实了cgi137非甲基化形式的妊娠特异性。母体血沉棕黄层样品中信号的缺失也证实了该分析对于检测cgi137非甲基化形式的特异性。总之，由于cgi137的甲基化模式在胎盘组织和母体血细胞之间的差异，可以开发出针对在源自母体血细胞的cgi137甲基化分子背景中，检测cgi137胎盘来源形式的灵敏而特异性的分析。因为胎盘是释放入母体循环的胎儿dna的组织来源(chimetal.，上文)，其中母体循环包含高背景的源自母体血细胞的dna(liuetal.，上文)，所以针对胎盘特异性表观遗传标志物的分析可用于检测母体血液中的胎儿特异性核酸分子。实施例3组合亚硫酸氢盐限制性分析(cobra)(xiong和lairdnucleicacidsres25:2532-2534,1997)的替代方法被用于评估染色体21上3个基因组序列在胎盘和母体血细胞dna之间的差别甲基化的存在(表11)。表11.染色体21上被研究基因组序列的一致性、定位、引物序列和pcr反应条件。第二和第三栏分别显示美国生物技术信息中心genbank保存的基因组重叠群的各个区域(登录号，版本，起始和终止核苷酸编号)和ucsc基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编(genome.ucsc.edu)的染色体定位(染色体，起始和终止核苷酸编号)。材料和方法组合亚硫酸氢盐限制性分析(cobra)按照制造商的说明书，利用ezdnamethylationkit(zymoresearch,orange,ca)将1μgdna进行亚硫酸氢盐转变。然后按照实施例1的描述(有一些改变)，将40纳克亚硫酸氢盐转变的dna(根据初始未转变的dna信息)进行pcr扩增。使用hotstartaqdnapolymerasekit(qiagen,hilden,germany)提供的试剂。表11详细列出了每个pcr的试剂组合物。通常，在20μl的终反应体积中进行pcr，其包含mgcl2，引物，hotstartaq，1×pcr缓冲液，50μm各种dntp和2×pcrx增强剂(invitrogen,carlsbad,ca)。加热模式由以下组成：95℃初始变性步骤15分钟，然后是50-55个循环：95℃20秒，58℃或者60℃30秒(表11)，72℃1.5分钟；和72℃最后延伸3分钟。然后将pcr产物进行限制性酶消化。根据能够区别亚硫酸氢盐转变后甲基化和非甲基化序列的能力来选择用于各个位点的限制性酶。基本上，限制性位点只在甲基化或者非甲基化的序列中存在，但不在这两种序列中同时存在，这样的话只有一个序列被消化，而另一个序列仍将是完整的(表12)。在制造商推荐的温度下，利用5μlpcr产物、1×合适的缓冲液和10u限制性酶(或者不含限制性酶，用作模拟消化)，在20μl终反应体积中进行限制性酶消化2小时。所有的酶均购自newenglandbiolabs(beverly,ma)。然后通过凝胶电泳分析消化产物。表12.cobra分析的结果预测克隆和亚硫酸氢盐测序将来自上文“组合亚硫酸氢盐限制性分析(cobra)”中描述的相同pcr扩增反应的dna用于克隆和亚硫酸氢盐测序。为了在单分子解析度分析甲基化状态，利用pgem-teasyvectorsystem(promega,madison,wi)将pcr产物ta-克隆入质粒载体。按照制造商的说明书，利用bigdyeterminatorcyclesequencingv1.1kit(appliedbiosystems)通过循环测序分析阳性重组克隆的插入物。在通过乙醇沉淀纯化后，将样品在10μlhi-di甲酰胺中重悬，并在3100dnaanalyzer(appliedbiosystems)上进行分析。结果和结论羧化全酶合成酶(hlcs)将来自2例母体血细胞样品的hlcs推定启动子区的甲基化模式与2例妊娠头三个月和2例妊娠末三个月胎盘组织样品(从正常妊娠妇女采集)以及2例妊娠头三个月胎盘组织样品(来自怀有21三体胎儿的妊娠妇女)的上述甲基化模式进行比较。进行cobra分析，a区、b1区和b2区的凝胶电泳数据分别显示于图14a、图14b和图14c。通常，与母体血细胞相比，胎盘是高甲基化的。对b2区进行克隆和亚硫酸氢盐测序实验以进一步在单分子解析度分析甲基化状态，图17显示的结果证实了hlcs中的甲基化是胎盘特异性的。cgi009将来自2例母体血细胞样品的cgi009甲基化模式与2例妊娠头三个月和2例妊娠末三个月胎盘组织样品(从正常妊娠妇女采集)以及2例妊娠头三个月胎盘组织样品(来自怀有21三体胎儿的妊娠妇女)的cgi009甲基化模式进行比较。进行cobra分析，凝胶电泳数据显示于图15。通常，与母体血细胞相比，胎盘是高甲基化的。cgi132将来自2例母体血细胞样品的cgi132甲基化模式与2例妊娠头三个月和2例妊娠末三个月胎盘组织样品(从正常妊娠妇女采集)以及2例妊娠头三个月胎盘组织样品(来自怀有21三体胎儿的妊娠妇女)的cgi132甲基化模式进行比较。进行cobra分析，凝胶电泳数据显示于图16。通常，与母体血细胞相比，胎盘是高甲基化的。实施例4根据在胎盘组织和母体血细胞中鉴定的标志物的差别甲基化特征，开发出替代方法，该方法利用甲基化敏感的限制性酶消化继之以实时定量pcr，从而定量分析胎盘和母体血细胞dna之间hlcsb2区基因组序列的差别甲基化(表11)。材料和方法甲基化敏感的限制性酶消化利用qiaampdnaminikit(qiagen,hilden,germany)从胎盘组织提取dna。按照制造商的说明书，通过qiaampdnabloodminikit(qiagen,hilden,germany)提取来自母体血沉棕黄层和血浆的dna。对于每一胎盘和血沉棕黄层dna样品，将100ngdna用甲基化敏感的限制性酶进行消化。在制造商推荐的温度下，利用dna、1×合适的缓冲液以及25uhpaii和50ubstui(或者不含酶，用于模拟消化)，在50μl终反应体积中进行限制性酶消化至少16小时。对于每个母体血浆样品，从1.6ml血浆提取dna，并将其洗脱于50μl去离子水，其中的21μl被用于限制性酶消化。在制造商推荐的温度下，利用dna、1×合适的缓冲液以及20uhpaii和30ubstui(或者不含酶，用于模拟消化)，在30μl终反应体积中进行酶消化至少16小时。所有的酶均购自newenglandbiolabs(beverly,ma)。然后通过实时定量pcr分析消化产物。所选择的限制性酶只消化非甲基化的dna，但不消化甲基化的dna。因为实施例3的数据显示hlcs在胎盘组织中是高甲基化的，而在母体血细胞中是低甲基化的，所以我们预期来自胎盘组织的dna部分将仍然是可检测的，而来自母体血细胞的大部分dna将被消化，并因此在限制性酶处理后将不会被检测到。实时定量pcr开发实时pcr分析用于定量分析经过和没有经过限制性酶消化的hlcs基因组dna。在实时pcr分析中使用4μl限制性酶处理的dna或者模拟消化样品。每个反应包含1×taqmanuniversalpcrmastermix(appliedbiosystems,fostercity,ca)，300nm正向引物(5'-ccgtgtggccagaggtg-3'；seqidno:60)，300nm反向引物(5'-tgggagccggaacctacc-3'；seqidno:61)，和100nmtaqman探针(5'-6fam-tcccgacctggccctttgcc-tamra-3'；seqidno:62)。加热模式是50℃2分钟，95℃10分钟，50个循环：95℃15秒和60℃1分钟。全部反应都以一式两份进行，然后取平均量。最初通过光密度测量定量的系列稀释的人类基因组dna被用作分析的定量标准。因为限制性酶消化后可检测的hlcsdna代表甲基化部分，因而我们将实时定量pcr表示为甲基化指数。将酶消化后的hlcsdna浓度除以模拟消化获得的hlcsdna浓度计算出样品的甲基化指数。结果和结论将来自8例母体血细胞样品的hlcs推定启动子区的甲基化模式与2例妊娠头三个月和2例妊娠末三个月胎盘组织样品(从正常妊娠妇女采集)的上述甲基化模式进行比较。进行限制性酶消化继之以实时pcr分析,结果显示于图18。所有母体血细胞样品的dna的大部分都被限制性酶消化，造成甲基化指数接近0；而胎盘组织的dna只是被部分消化，造成甲基化指数范围是0.567-0.966。先前的数据提示胎盘是胎儿dna的主要组织来源，而母体血细胞是母体血浆中可检测的背景母体dna的主要来源。我们认为hlcsdna的胎盘特异性(相对于母体血细胞)部分，即甲基化或者不可消化部分可以在母体血浆中被检测，并且是妊娠特异性的。采集了来自25例正常怀孕个体的配对分娩前和分娩后妊娠末三个月血浆样品。进行限制性酶消化继之以实时pcr分析，结果显示于图19。在酶消化的分娩前妊娠末三个月血浆样品中检测到hlcs的阳性信号，而在分娩后该信号减弱。在酶消化后，分娩后血浆样品中的hlcs浓度中值是在酶消化后分娩前血浆样品中的hlcs浓度中值的8.1％(图19a)。酶处理分娩前和分娩后血浆的清除模式指示被检测的hlcs信号是妊娠特异性的。相反地，利用模拟限制性酶消化的分娩后母体血浆的hlcsdna浓度中值是模拟消化的分娩前样品所述中值的83.8％(图19b)。本申请引用的全部专利、专利申请和其他出版物，包括公开的氨基酸或者多核苷酸序列，为了所有目的通过完整引用而被并入。序列表<110>香港中文大学<120>用于产前诊断和监测的新的胎儿标志物<130>d17c12392cn<150>us60/797,456<151>2006-05-03<150>us11/784,499<151>2007-04-06<160>62<170>fastseqforwindowsversion4.0<210>1<211>180<212>dna<213>智人<220><223>cgi137扩增区域原始dna序列<221>修饰的碱基<222>(1)...(180)<223>n=甲基化胞嘧啶<400>1cttcacctgnggggacccnggngagcccctcaggtgccacaggcagggacangcctngct60ngatgngtcacaccatgtggccaccagagctgngggaaaatgctggggaccctgcatttc120ngtttcaggtggngaacaagngcccctcacagaactgcaggtagagangggccnggggca180<210>2<211>180<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi137扩增区域亚硫酸氢盐转变的dna序列<221>修饰的碱基<222>(1)...(180)<223>n=甲基化胞嘧啶<400>2ttttatttgnggggatttnggngagttttttaggtgttataggtagggatangtttngtt60ngatgngttatattatgtggttattagagttgngggaaaatgttggggattttgtatttt120ngttttaggtggngaataagngttttttatagaattgtaggtagagacgggttcggggta180<210>3<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>同质massextend实验步骤引物延伸分析甲基化特异性cgi137正向引物<400>3tgttataggtagggatatgttttgtttgacgt32<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>同质massextend实验步骤引物延伸分析甲基化特异性cgi137反向引物<400>4agagatggatgttaagatattttttgtgaataggt35<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>同质massextend实验步骤引物延伸分析甲基化特异性cgi137延伸引物<400>5gttttaggtggtggataagt20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi137a区f-引物<400>6ggttgggttggaggagggtagt22<210>7<211>25<212>dna<213>人工引物<220><223>cgi137a区r-引物<400>7accccraacccrtctctacctacaa25<210>8<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi137b区f-引物<400>8aaggggagttgagatattgtagggtttat29<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi137b区r-引物<400>9aacacctaaaaaactcrccraaa23<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>磷酸二酯酶9a(pde9a)a区f-引物<400>10gtttttagggagggggtatttygagt26<210>11<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>磷酸二酯酶9a(pde9a)a区r-引物<400>11aatctattttctatatttcactatttccaaataaaa36<210>12<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>磷酸二酯酶9a(pde9a)b区f-引物<400>12gtatgtattaattaaatgaaaagatgagtttgtgat36<210>13<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>磷酸二酯酶9a(pde9a)b区r-引物<400>13craaaaaccccttataaaaaaccra25<210>14<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>磷酸二酯酶9a(pde9a)c区f-引物<400>14ggtggttgtgtgtgtttggtttttagt27<210>15<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>磷酸二酯酶9a(pde9a)c区r-引物<400>15acccaaaaataccccaaaccataaa25<210>16<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>蛋白磷酸酶1,调节(抑制剂)亚单位2假基因2(ppp1r2p2)a区f-引物<400>16aggttttttagtggggaaaaaatggt26<210>17<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>蛋白磷酸酶1,调节(抑制剂)亚单位2假基因2(ppp1r2p2)a区r-引物<400>17craaacttccractcttaactcaaaataacta32<210>18<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>蛋白磷酸酶1,调节(抑制剂)亚单位2假基因2(ppp1r2p2)b区f-引物<400>18gattttaygtygagtagttattttgagttaag32<210>19<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>蛋白磷酸酶1,调节(抑制剂)亚单位2假基因2(ppp1r2p2)b区r-引物<400>19aactcctcrtccacactcccrta23<210>20<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>类fem1a(秀丽线虫)a区f-引物<400>20aggttaatgatttgtatatttaaaagtttttaggatattt40<210>21<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>类fem1a(秀丽线虫)a区r-引物<400>21accaaatactccaccacrtccaaataa27<210>22<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>类fem1a(秀丽线虫)b区f-引物<400>22ayggttatttggaygtggtggagtatt27<210>23<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>类fem1a(秀丽线虫)b区r-引物<400>23ccrattaaccacctccaaattaacctaata30<210>24<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi009f-引物<400>24aaaaaggygtttggtyggttatgagttat29<210>25<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi009r-引物<400>25aaactaaaatcracrtacctacaa24<210>26<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>羰基还原酶1(cbr1)f-引物<400>26gttaygtgggtagttaatagttagtagttagagattagtt40<210>27<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>羰基还原酶1(cbr1)r-引物<400>27caaaccratacccttattacctccaa26<210>28<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)f-引物<400>28ygygygttgygtttttgtatatttgtttt29<210>29<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>唐氏综合症细胞粘附分子(dscam)r-引物<400>29caaaaaaaattaacaaaaaaatccatataactaaaa36<210>30<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>染色体21开放阅读框29(c21orf29)f-引物<400>30agtttggtagttatttgaatagttaaatgagtt33<210>31<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>染色体21开放阅读框29(c21orf29)r-引物<400>31aactttctcatcctactccctaaatctata30<210>32<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi111f-引物<400>32tttttttaggtagttgaaagaaaagg26<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi111r-引物<400>33cctccctcctcaaaataaac20<210>34<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi121f-引物<400>34tttttagatattttttgggtttaaggtt28<210>35<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>cgi12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