本发明属于生物技术和化学领域，尤其涉及层生镰刀菌发酵提取物中抑制植物病源真菌倍半萜类化合物的制备方法。
背景技术：
植物病原真菌(plantpathogenicfungi)是指那些可以寄生在植物上并引起植物病害的真菌。由植物病原真菌引起的病害，约占植物病虫害的70～80％，一种作物上可发现几种甚至几十种真菌病害。农作物及经济作物病虫害是我国的主要农业灾害之一，它具有种类多、影响大、并时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度对我国国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。我国农作物和经济作物常见的有以下种类的病害：麦类赤霉病、玉米弯孢病、棉花枯萎病、苹果腐烂病和炭疽病、烟草赤霉病等，已成为严重影响我国农业生产的重大病害。
化学防治法是使用农药防治植物病害的方法。化学农药具有高效、速效、使用方便、经济效益高等优点。但使用不当可对植物产生药害、污染环境、引起人畜中毒、杀伤有益微生物、导致病原物产生抗药性。
生物农药是指利用生物活体或其代谢产物对有害生物进行防治的一类农药制剂，主要包括生物化学农药和微生物农药(微生物活体农药和微生物代谢产物农药)。但是，在我国农业生产实际应用中，生物农药一般主要泛指可以进行大规模工业化生产的微生物源农药。微生物农药凭借其无公害、无残留、安全高效的特点，将逐步取代传统的化学农药。在人们对农产品的品质要求不断提升的背景之下，微生物农药已经成为无公害农副产品必需的生产资料，针对于此我国需要提高对微生物农药研制和应用的重视程度，加速微生物农药的推广进程，促进我国现代化农业的发展。
微生物农药占我国农业农药总使用量的12％左右。微生物活体农药见效慢且对环境条件(包括温度、水分、光照和ph等)要求较高，而微生物代谢产物农药完全克服了以上化学农药和微生物活体农药的缺点，因此它的市场前景非常乐观。目前我国微生物农药以阿维霉菌、井冈霉菌、bt制剂等为主，种类稀少。因此，寻找新型微生物次生代谢产物，进而从根本上防治农作物病虫害迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一类能够抑制植物病源真菌的倍半萜类化合物及其制备方法，进而在农业上可用来防治农作物病害。
本发明所述的倍半萜类化合物结构式如下所示：
本发明还提供了层生镰刀菌(fusariumproliferatumaf-04)(genbankaccessionnumbermf426031)发酵提取物中倍半萜类化合物的制备方法：将pda(potatodextroseagar)培养基中的af-04菌株切成0.5～1cm×0.5～1cm小块后接种到大米固体培养基中，恒温培养箱25～27℃静置培养30～40天，获得发酵物；将该发酵物用乙酸乙酯超声提取30～35分钟，提取液经浓缩、分离得到无色油状物，即倍半萜类化合物。
上述提取液浓缩、分离的过程为：将乙酸乙酯提取液在低于45℃下减压浓缩得到发酵物浸膏，经正相硅胶、葡聚糖凝胶、反相硅胶柱层析分离纯化，获得无色油状物。
上述pda培养基的配比为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，去离子水1000ml。上述大米固体培养基的配比为：大米100～120克，去离子水120～150ml。
上述接种量为：每5个菌块对应100～120克大米。
上述萃取过程中的比例为：100～120ml乙酸乙酯，100～120克大米。
为了解决上述技术问题，本发明还包括层生镰刀菌(fusariumproliferatumaf-04)的发酵提取物的应用，所述提取物用于制备抑制植物病源真菌的制剂，从而用于农作物病害的防治。
本发明与现有技术相比，有一效果在于：本发明在植物内生真菌层生镰刀菌(fusariumproliferatumaf-04)的发酵提取物中首次分离出3个倍半萜类化合物，其中化合物i是新化合物。我们对所述倍半萜类化合物进行抗植物病源真菌、抗人病源细菌和细胞毒活性测定，其中化合物(i)，3β-羟基-β-菖蒲醇，分子式为c15h26o2明显具有很强的抗植物病源真菌活性，另外两个化合物具有较强的抗植物病源真菌活性。本发明的提取物可以用于制备防治农作物病害的农药。
具体实施例
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
据估计世界上仅有不到5％的真菌被人们所认识，尚有数以亿万计的微生物有待人们去发现和研究。微生物资源因其可再生、生长周期短、代谢易于控制、菌种易于选育等优势，成为天然药物研发领域关注的焦点。共生菌长期与宿主共进化，往往拥有特殊的代谢途径，有可能产生结构全新的活性次生代谢物，为研究与开发微生物药物提供宝贵的源头线索。
植物内生菌是指生活史的一定阶段，生活在活体植物组织内又不引起植物明显病害的微生物，包括真菌、细菌和放线菌等。在一种植物上可分离到数种至几百种内生菌。植物内生菌不仅参与植物次生成分的合成、转化，而且还能独立产生丰富的次生代谢产物，是天然药物的重要来源。据不完全统计，现在全世界已公开发表的微生物来源的生物活性物质已超过15000种，其中得到临床实际应用的约150种。从植物内生菌分离得到的生物活性物质51％是以前未发现的新化合物，并且绝大多数植物内生菌还没有被研究，因此，从植物内生菌中寻找具有生物活性的次生代谢产物已成为研发热点之一。加速共生菌资源的研究与利用兼具迫切性和战略意义。
本发明首先对分离自大葱的内生真菌af-04进行菌种鉴定，确定菌株名称为层生镰刀菌(fusariumproliferatumaf-04，genbankaccessionnumbermf426031)，然后利用大米固体培养基对该菌株进行了发酵，乙酸乙酯萃取发酵物得到提取物后，运用薄层色谱(tlc)、正相硅胶柱色谱、sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱色谱和反相硅胶柱色谱等现代色谱技术对发酵产生的次生代谢产物进行分离纯化，并对得到的化合物应用现代波谱技术(hr-esi-ms、1d&2dnmr等)和理化性质比较等确定其化学结构。对提取物进行了多种活性测定，包括抗植物病源真菌、抗人病源细菌和细胞毒活性。试图发现抗植物病源真菌化合物、抗人病源细菌化合物和抗肿瘤活性化合物，从而解决困扰人类和农作物健康的重大疾病。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1真菌培养物的提取物的制备和结构鉴定
一、提取物中倍半萜的制备
1、种子培养
(1)配制种子pda培养基：新鲜马铃薯200克去皮，切成2cm×2cm×2cm方块，加入1000ml去离子水，煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml，加葡萄糖20克，琼脂15克，121℃高压灭菌30分钟，获得灭菌的种子培养液。将该无菌培养液倒入无菌培养皿中，凝固后即成种子pda培养基。
(2)种子的培养：-80℃低温保存的层生镰刀菌(fusariumproliferatumaf-04)经复苏后，将此菌株接入上述种子pda培养基中，于25～27℃恒温培养48～72小时，得到菌种种子。
2、发酵培养
(1)配制发酵用大米固体培养基：称取100～120克大米，量取去离子水120～150ml，加入1000ml锥形瓶中，重复做100瓶，121℃高压灭菌30分钟，获得灭菌的发酵培养基。
(2)发酵培养：在超净工作台中，将5块0.5～1cm×0.5～1cm菌块接入装有100～120克大米的1000ml锥形瓶中，总共100瓶。恒温培养箱25～27℃静置培养30～40天，获得层生镰刀菌(fusariumproliferatumaf-04)的发酵培养物。
3、提取分离
将上述每瓶固体发酵物用100～120ml乙酸乙酯超声提取，提取液在低于45℃下减压浓缩得发酵物浸膏，反复提取4～6次，合并得到发酵物浸膏88.6克。该发酵物浸膏拌入200～300目硅胶88克，经硅胶柱层析分离，采用石油醚-丙酮梯度(体积比20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1)洗脱，经tlc分析，根据极性大小的不同，减压浓缩后得到6个馏分(af-01～af-06)。选取组分af-04-2、af-04-3、af-04-4分别进行葡聚糖凝胶sephadexlh-20柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇(体积比3:1)为溶剂进行洗脱，经tlc分析，分别得到组分af-04-2-1～af-04-2-4、af-04-3-1～af-04-3-3、af-04-4-1～af-04-4-7。其中组分af-04-2-3进行反相硅胶(rp-18，25～40μm)柱层析分离纯化，以甲醇-水(体积比6:4，5:5，4:6)梯度洗脱，收集可得到纯化的所述倍半萜类化合物iii，组分af-04-3-2和af-04-4-1用同样的方法进行反相硅胶柱层析分离纯化，分别得到倍半萜类化合物i和ii。
二、提取物中倍半萜的相对结构鉴定
对上述步骤中所得到的倍半萜类化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
式(i)化合物，3β-羟基-β-菖蒲醇(3β-hydroxy-β-acorenol)，无色油状物；[α]2d5-50.0(c0.1,meoh)；254nm和365nm紫外灯下无荧光，10％h2so4-乙醇显色剂tlc加热显红色；hr-esi-msm/z261.1828([m+na]+计算值261.1825)；分子式为c15h26o2，不饱和度为3。1hnmr(400mhz，cdcl3)、13cnmr(100mhz，cdcl3)、1h-1hcosy、hmbc和noe数据见表1。
表1.式(i)化合物的nmr数据(cdcl3，tms，j(hz)，δ(ppm))
根据以上理化数据分析可知，此化合物为菖蒲烷型倍半萜类化合物，其相对结构如式(i)所示：
式(ii)化合物(epicyclonerodioloxide)：无色油状物，hr-esi-msm/z279.1932([m+na]+计算值279.1936)；分子式为c15h28o3。254nm和365nm紫外灯下无荧光，10％h2so4-乙醇显色剂tlc加热显红色。1hnmr(400mhz,cdcl3)和13cnmr(100mhz,cdcl3)数据见表2。
表2.式(ii)化合物的nmr数据(cdcl3，tms，j(hz)，δ(ppm))
根据以上理化数据分析可知，此化合物为表环橙花烷型倍半萜类化合物，其相对结构如式(ii)所示：
式(iii)化合物((r)-5-((1r,2s,3r)-3-hydroxy-2,3-dimethylcyclopentyl)-5-methyldihydrofuran-2(3h)-one)：无色油状物，hr-esi-msm/z235.1310([m+na]+计算值235.1305)；分子式为c12h20o3。254nm和365nm紫外灯下无荧光，10％h2so4-乙醇显色剂tlc加热显红色。1hnmr(400mhz,cdcl3)和13cnmr(100mhz,cdcl3)数据见表3。
表3.式(iii)化合物的nmr数据(cdcl3，tms内标，j(hz)，δ(ppm))
根据以上理化数据分析可知，此化合物为降碳环橙花烷型倍半萜类化合物，其相对结构如式(iii)所示：
实施例2：对实施例1所得到的3个倍半萜类化合物的抑制植物病源真菌活性的筛选实验。
一、测试真菌：苹果腐烂病菌(valsamalimiyabeetyamada，简称为vm)，苹果炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides，简称为cg)，小麦赤星病菌(fusariumgraminearum，简称为fg)，烟草赤霉病菌(alternariaalternate(fr)keissler，简称为aa)，玉米弯孢病菌(curvularialunata，简称为cl)，棉花枯萎菌(fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(atk.)snyder&hansen，简称为fo)。
二、阳性对照：多菌灵(carbendazim)。
三、培养基：pda培养基(同上)。
四、实验方法
抑制植物病源真菌活性采用菌块法，具体实验步骤为：
1.活化菌株：将测试用6种病源真菌接种到新的pda培养基中，26℃恒温培养3～4天。
2.测试样品准备：精确称取测试样品，将其溶解在丙酮中，稀释至终浓度100ppm。
3.培养基制备：将pda培养基所用物质和培养皿高温灭菌30分钟，在超净工作台上将培养基倒入培养皿中，室温等待固化。
4.菌块法测试：用移液枪移取制备好的不同稀释度待测样品溶液2.5ml，加入到冷却至40℃左右的pda培养基中摇匀，使其最终体积为25ml。用打孔器切取5mm菌块放入含有待测样品的凝固后的pda培养皿正中间，每个培养皿接种一个菌饼，每个接种三个重复。以蒸馏水加入到培养基中作为对照，然后置于27℃的恒温培养箱内。培养2天后，拍照、测量直径，方法是按照十字交叉测量3次，以其平均值代表菌落直径的大小。抑制率的计算公式如下：
纯对生长量＝菌落平均直径－菌饼直径
抑制率＝[(对照纯生长量一处理纯生长量)/对照纯生长量]×100％。
表4化合物(i)～(iii)的抑制植物病源真菌活性结果
实施例3：对实施例1所得到的3个倍半萜类化合物的抑制人病源细菌活性的筛选实验。
一、测试细菌：巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterim，简称为bm)，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis，简称为bs)，产气荚膜杆菌(clostridiumperfringens，简称为cp)，四联球菌(micrococcustetragens，简称为mt)，大肠杆菌(escherichiacoli，简称为ec)和一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)，3种金黄色葡萄球菌newmanwt、mu50和rn4220。
二、阳性对照：左氧氟沙星、红霉素、氨苄青霉素、链霉素和四环素。
三、培养基：沙氏培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，蒸馏水1l，ph自然)。四、实验方法
抗菌活性采用微量稀释法，具体实验步骤为：
1.活化菌株：将测试用9种细菌用平板划线法接种到新的固体沙氏培养基中，30℃恒温培养12h。
2.菌悬液制备：用无菌蒸馏水挑取适量细菌接种到40ml沙氏培养基中，平行两次，恒温震荡摇床培养12h(菌株对数期)。用无菌沙氏培养基将测试菌株制成浓度适当的菌悬液，测量菌液od600值，当菌液的od600值为0.1时浓度即为106cfu/ml，确定出将od600值稀释至0.1的稀释倍数，最后再用沙氏培养基将上述菌悬液稀释到106cfu/ml。
3.二倍稀释法：将上述菌悬液加入到96孔板中，每孔50μl。待测试化合物初始浓度为200μg/ml，分别加50μl于第一孔，混合均匀，按照二倍稀释法从第一孔取50μl加入第二孔，混合均匀，接着取第二孔50μl至第三孔，如此反复类推到第十二孔。平行三次，30℃恒温培养24h。
表5化合物(i)～(iii)的抑制人病原细菌活性结果
实施例4：对实施例1所得到的3个倍半萜类化合物的细胞毒活性的筛选实验。
一、测试菌株：hela(人宫颈癌)、a549(人非小细胞肺癌)、hepg2(人肝癌)和mcf-7(人乳腺癌)细胞。
二、阳性对照：vp-16。
三、培养基：rpmi1640培养基。
四、实验方法
细胞毒活性测试采用mtt法，具体实验步骤为：
1.活化细胞株：将测试用4种肿瘤细胞株分别用rpmi1640培养液置于5％co2湿度饱和的培养箱中恒温37℃培养，每两天进行传代培养。
2.mtt法：取对数期生长的细胞，密度3.0×104个/ml接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养，24小时后分别加入含有不同测试物浓度(0～50μm，dmso溶解)的rpmi1640培养基至100μl，平行3次，然后置于培养箱中继续培养。给药48小时后，吸除培养基，加入100μl新培养基和10μlmtt(5mg/ml于pbs中)的混合液，于培养箱中放置4小时，吸除含mtt的培养基，并加入100μldmso溶解形成的甲臜，酶标细胞仪测定在570nm处的吸光值(od)。存活率(％)＝(药物组od–空白组od)/(参照组od–空白组od)×100％。以药物浓度为纵坐标，抑制率为横坐标，绘制生长曲线，计算ic50值。其中vp-16为阳性对照，dmso为空白对照。
表6化合物(i)～(iii)的细胞毒活性结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。