与菜薹花青素基因连锁的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及与菜薹薹色基因连锁的snp分子标记及其应用。

背景技术：

花青素又称花青素苷，属于酚类化合物中的生物类黄酮化合物，是广泛存在于植物中，并且易溶于水的色素之一，花青素构成了水果、蔬菜、花卉等植物五彩缤纷的色彩，在自然的状态下，存在于液泡中的花青素是由花青素苷元与不同种类的单糖相结合形成的物质。花青素是一种强的氧化剂，蔬菜中存在的花青素苷不仅赋予其缤纷的色彩，使人们增进食欲，还具有很好的保健功能。研究表明，花青素在抗氧化、抗突变、保护血管动脉、增强免疫系统能力、增进视力等方面有极显著的效果。此外，花青素在化妆品及可食用食品的色素添加剂方面也有应用。

菜薹又称菜心，十字花科芸薹属，一、二年生草本。口感脆甜，富含微量元素，能周年栽培是我国南方地区常见的蔬菜品种。菜薹浅根较系，须根多，茎短缩肥大，一般为绿色。适宜栽培温度为15-20℃，于昼温20℃、夜温15℃时菜薹发育良好。温度过高或过低则薹纤细、品质差。现蕾前以叶片生长为主，现蕾后花薹生长迅速。菜薹现有的选育有单株育种，杂交子代群体定向选择育种；杂交子代单倍体培养选择优良株系，或用于杂交亲本材料等进行育种；雄性不育与性状优良植株回交，多代定向选择出遗传性状稳定的雄性不育系；染色体加倍多倍体杂交育种。

随着科学研究的深入，社会的需求，人们越来越重视食品的营养保健作用，因此，选育高花青素菜薹是未来菜薹品质育种的重要目标之一。传统育种方式选育高花青素品种虽然可行，但耗时耗力，不利于我国的菜薹育种事业。随着高通量测序技术的成熟，特别是大量的snp(单碱基扩增多态性)标记的开发，应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。利用高通量测序技术开发大量的snp标记，开发性状连锁的分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。因此，进行菜薹花青素含量的基因定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对花青素含量的遗传改良具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于与菜薹花青素含量主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其在育种方面的应用。

本发明所采取的技术方案是：

与菜薹花青素含量主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记，其为分子标记2276542或分子标记2385613，定位于中国菜薹7号染色体上，分别位于花青素基因两侧；

分子标记2276542包含seqidno.1所示的核苷酸序列，seqidno.1所示序列自5’端起第57位碱基是snp位点，其碱基为c或t；当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为c时，菜薹薹色表型为绿色，与分子标记2276542紧密连锁的菜薹花青素含量低；当该snp位点在两个等位基因只要中有一个碱基为t时，菜薹薹色表型为红色，与分子标记2276542紧密连锁的菜薹花青素含量高。

所述分子标记2385613包含seqidno.2所示的核苷酸序列，所述seqidno.2所示序列自5’端起第60位碱基是snp位点，其碱基为a或g；当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为a时，菜薹薹色表型为红色，与分子标记2385613紧密连锁的菜薹花青素含量高；，当该snp位点在两个等位基因中只要有一个碱基为g时，则菜薹薹色表型为绿色与分子标记2385613紧密连锁的菜薹花青素含量低。

用于扩增以上所述的snp分子标记的引物对。

作为优选的，所述引物对为dcaps引物对。

进一步优选的，用于检测分子标记2276542的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1：5’-ataagggtagcacccggtactcg-3’(seqidno.3)，

r1：5’-tataaacaagcgcacttgtgctaa-3’(seqidno.4)，

其对应的限制性核酸内切酶为hhal。

用于检测分子标记2385613的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1：5’-tcataccatcaacagacagcat-3’(seqidno.5)，

r1：5’-agcacattcctgagaaggctct-3’(seqidno.6)，

其对应的限制性核酸内切酶为niaiii。

识别或检测上述snp分子标记的分子探针或引物对在选育高花青素含量辅助育种中的应用。

一种用于菜薹花青素含量辅助育种的试剂盒，其包括识别或扩增上述snp分子标记的分子探针或引物对。

一种菜薹花青素辅助育种的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测菜薹基因组dna；

(2)利用特异性引物对进行pcr扩增；

(3)对pcr产物进行测序，确定snp位点的基因型，从而判断菜薹花青素含量；或者

使用对应的限制性核酸内切酶对pcr产物进行酶切，根据酶切结果判断菜薹花青素含量。

本发明的有益效果是：

本发明对菜薹花青素含量的数量性状位点进行了qtl定位，并筛选得到了与菜薹花青素含量qtl紧密连锁的分子标记2276542和分子标记2385613，两标记间的物理距离为0.3660mb，定位的qtl位点对该数量性状存在显著关联关系(p<0.05)，且贡献率较高，分子标记2276542的解释概率为25％，分子标记2385613的解释概率为24.8％。通过这两个分子标记可以预测菜薹花青素含量的高低，为实现菜薹花青素含量性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。

附图说明

图1为高花青素含量的母本(p1)，菜薹颜色为紫红色，和低花青素含量的父本(p2)，菜薹颜色为绿色；

图2为菜薹花青素基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示lod值；虚线标记的阈值是代表p<0.05的关联阈值，表示关联性显著；

图3为菜薹花青素基因所在的7号染色体的紧密连锁区间，左边为连锁群的物理距离(mb),右边为标记的编号，atcn为花青素基因所在位点；

图4为分子标记2276542的pcr扩增后酶切结果：p1、p2分别为紫红色母本湘红薹1号和绿色父本义农50天菜心的酶切带型；p1不能被酶切，仅有一条230bp片段，p2酶切完全，片段长度为204bp；f1部分酶切，存在230bp和204bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型；

图5为分子标记2385613的pcr扩增后酶切结果：p1、p2分别为紫红色母本湘红薹1号和绿色父本义农50天菜心的酶切带型；p1不能被酶切，片段长度为236bp，p2酶切完全，片段长度为212bp；f1部分酶切，存在236bp和212bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括dna提取、pcr扩增、page凝胶电泳、酶切、转化等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料植物材料：高花青素含量材料是从湖南引进的湘红薹1号经多代自交获得的高代自交系，而低花青素含量材料是广东本地引进的义农50天菜心经多代自交获得的高代自交系。图1为p1和p2的植株照片，高花青素含量的母本(p1)，菜薹颜色为紫红色；而低花青素含量的父本(p2)，菜薹颜色为绿色。湘红薹1号和义农50天菜心杂交获得f1，f1自交得f2，同时回交获得bc1，观察各世代的颜色，统计分离世代的颜色分离比，进行遗传分析，并对紫红色性状进行定位。

2、供试材料菜薹花青素遗传规律分析

田间性状统计结果显示，两亲本的正反交f1代植株均带有紫红色，但紫红色部分比红菜薹p1要弱很多；bc1(p1)代偏红色；f2代出现分离，但不是简单的分离成紫红色和绿色两个性状，而是呈现颜色的连续变化，整体符合正态分布，按0，1，3，5(其中0代表父本薹为绿色，5代表母本薹为紫红色，1和3介于两者之间)四个等级进行统计，结果如表1。综上所述，紫红色对绿色性状为不完全显性。

表1f2代群体颜色性状的调查

二、菜薹遗传图谱构建和花青素含量高低的初步定位

1、菜薹基因组dna的提取

使用ctab法提取菜薹亲本及150株f2群体基因组dna，提取的单株dna用于文库构建。

2、遗传图谱构建

本研究前期委托北京百迈客生物科技有限公司利用slaf-seq技术进行高通量测序，一共150个样本，采用rsai和haeⅲ进行酶切，对得到的酶切片段(slaf标签)进行3′端加a处理、连接dual-index测序接头、pcr扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用illuminahiseq进行pe125bp测序。利用dual-index对测序得到的原始数据进行识别，得到各个样品的reads。对过滤完接头的测序reads进行测序质量和数据量的评估。通过control数据的比对效率评估酶的酶切效率，判断实验过程的准确性和有效性。通过reads比对基因组的方法，在亲本和子代中开发slaf标签，寻找多态性的slaf标签。共开发130,525个slaf标签，slaf标签亲本平均测序深度为40.075，子代平均测序深度为9.89。

对初始snp集进行过滤，多态性slaf标签共有26,557个，多态性比例达到20.35％，为保证遗传图谱质量，将多态性slaf标签过滤，得到可用于作图的slaf标签4,253个，得10,940个上图snp标记，通过highmap作图软件，构建遗传图谱，进行图谱评估。通过qtl定位软件进行qtl关联分析获得与性状紧密关联的slaf标签和关联区域。图谱共分为10个连锁群，总图距1030.04cm，平均标记间图距0.27cm，最短连锁群73.12cm，最长140.03cm。

3、花青素基因atcn的精细定位

采用r/qtl进行qtl定位分析，对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算以获得性状相关的qtl，通过pt检验1000次设定阈值，考虑0.99置信度对应的阈值，图中以虚线表示。超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，虚线的lod值为6.155，一个chromosome代表一个连锁群，将花青素基因atcn精细定位在7号染色体上(图2)，定位在两个snp标记2276542和2385613之间，区间从20.12mb到20.49mb(图3)，其中snp标记2276542包括序列：

ttgaaactattcttttttttttttcagatagatataagggtagcacccggtactcacgcaactgaggctgcaggtatgtcaatttttatctatatcctttgtctgcgtctttgtttttttattaaatcgaccttagagtaacagagcaagtttcagttgattctaggaatagcaaatgaaacatgaattcgcacttgatgcggcaaaagagtagattcattttctgtttgaaaccccattagcacaagtgcgcttgtttatatagtttcttcctctggaaaatgcagtcactaaacaactaaacgacaaagagcgtgtggcggctgcactagagaatccaaaccttgtggagatggtcgatgaatgtctatctccatcatttgaatgatgccttgatgctctcaagatacactatcatatctatgcttctgcttgtctagcaaaggttttgatcaaacta(seqidno:1)，其中下划线标记的c具有c→t的变化(即自5’端起第57位碱基是snp位点，其碱基为c或t)。

snp标记2385613包括序列：

gaagcttgtttctccacttccttgagatctgttggtgtcataccatcaacagacagcacagttatcgagttaaccggttgtgacagaccaggtttgctgtctgaactgacagcagttctgacccacctcaaatgcagtgtcctaaacgccgaggtctggacacacaacacaagagcagctgctgtgatggaggtgacagatgacttaaccggttccgccgtttctgatccagagaggctctcacggatcaagagccttctcaggaatgtgctcaagggaagcaacacacccaaggaagccaaaacggttgtgtctctcggggaggtccacactgataggaggcttcatcagatgatgtttgaggatagagactatgagaacctggacgatgaatcctccaacgtccaagatgaaaggcaa(seqidno:2)，其中下划线标记的a具有a→g的变化(即自5’端起第60位碱基是snp位点，其碱基为a或g)。

三、dcaps分子标记开发、扩增、酶切验证

根据分子标记2276542和分子标记2385613的snps标记信息，使用dcapsfinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm)和genetool分别设计衍生的酶切多态性扩增序列(dcaps)引物的错配引物和另一侧的引物，完成从snps向dcaps标记的转化。2276542的错配碱基数为1个，2385613的错配碱基数量为1个。

用于扩增分子标记2276542的引物序列如下所示：

f1：5’-ataagggtagcacccggtactcg-3’(seqidno.3)，

r1：5’-tataaacaagcgcacttgtgctaa3’(seqidno.4)；

当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为c时，pcr产物可被限制性核酸内切酶hhal识别并切割，产生204bp的片段，菜薹在薹色中的表型为绿色，可以判断与分子标记2276542紧密连锁的菜薹花青素在菜薹中为低含量花青素；当该snp位点在两个等位基因中的碱基型全为tt时，pcr产物不能被限制性核酸内切酶hhal识别并切割，只有231bp的片段，菜薹在薹色中的表型为紫红色，可以判断与分子标记2276542紧密连锁的菜薹花青素在菜薹中为高含量花青素；当该snp位点的基因型为c/t时，则存在204bp和230bp的片段，菜薹薹色表型为紫红色，菜薹含有高花青素。

用于扩增分子标记2385613的引物序列如下所示：

f2：5’-tcataccatcaacagacagcat-3’(seqidno.5)；

r2：5’-agcacattcctgagaaggctct-3’(seqidno.6)。

若该snp位点的基因型碱基均为gg时，pcr产物可被限制性核酸内切酶niaiii识别并切割，产生212bp的片段，菜薹在薹色中的表型为绿色，可以判断与分子标记2385613紧密连锁的菜薹花青素在菜薹中为低含量花青素；当snp位点碱基基因型为aa时，其不能被限制性核酸内切酶niaiii识别并切割，只有236bp的片段，菜薹在薹色中的表型为紫红色，可以判断与分子标记2385613紧密连锁的菜薹花青素在菜薹中为高含量花青素；当snp位点的基因型碱基为g/a时，则存在212bp和236bp的片段，菜薹薹色表型为紫红色菜薹含有高花青素。

pcr扩增体系使用15μl的扩增体系，包含0.5μltaq酶，1μl模板dna，1μl的dntp，1.5μl引物，1.5μl的10×pcrbuffer，加ddh2o至15μl。pcr扩增程序为：94℃5min，循环过程为94℃30s、退火30s、72℃30s、30个循环，最后72℃延伸10min。2276542引物的退火温度为55℃，2385613引物的退火温度为54℃。

在两亲本间进行pcr扩增，分别经过限制性内切酶hhal和niaiii进行酶切后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳结果如图4和图5所示。可以看出：亲本间表现特异，鉴定f2群体单株25个，两个标记的结果一致，且菜薹薹色与双酶切结果一致，上述两个snp标记可以将菜薹薹色红色与绿色区分开。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院蔬菜研究所

<120>与菜薹花青素基因连锁的snp分子标记及其应用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>460

<212>dna

<213>菜薹

<220>

<221>allele

<222>(57)..(57)

<223>snp位点，碱基为c或t

<400>1

ttgaaactattcttttttttttttcagatagatataagggtagcacccggtactcacgca60

actgaggctgcaggtatgtcaatttttatctatatcctttgtctgcgtctttgttttttt120

attaaatcgaccttagagtaacagagcaagtttcagttgattctaggaatagcaaatgaa180

acatgaattcgcacttgatgcggcaaaagagtagattcattttctgtttgaaaccccatt240

agcacaagtgcgcttgtttatatagtttcttcctctggaaaatgcagtcactaaacaact300

aaacgacaaagagcgtgtggcggctgcactagagaatccaaaccttgtggagatggtcga360

tgaatgtctatctccatcatttgaatgatgccttgatgctctcaagatacactatcatat420

ctatgcttctgcttgtctagcaaaggttttgatcaaacta460

<210>2

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<212>dna

<213>菜薹

<220>

<221>allele

<222>(60)..(60)

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gaggatagagactatgagaacctggacgatgaatcctccaacgtccaagatgaaaggcaa420

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工引物

<400>3

ataagggtagcacccggtactcg23

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工引物

<400>4

tataaacaagcgcacttgtgctaa24

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工引物

<400>5

tcataccatcaacagacagcat22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工引物

<400>6

agcacattcctgagaaggctct22