一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法与流程

本发明属于空气微生物鉴定与应用技术领域，具体涉及雾霾中微生物的收集和细菌基因组dna提取，以及雾霾中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌o157:h7、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和蜡样芽孢杆菌7种病原微生物的实时荧光快速筛查方法。

背景技术：

自2013年以来，我国空气污染形势严峻，大范围持续雾霾天气频发，呈现影响范围广、持续时间长、污染物浓度高等特征，雾霾已成为空气组成中备受关注的焦点，严重影响人民群众身体健康。2016年年底，世界卫生组织(who)与医学期刊《柳叶刀》(thelancet)发布的数据显示，仅2015年，空气污染就造成全球640万人死亡，其中约280万人死于室内空气污染，约420万人受害于环境空气污染。这组数字十分惊人，因为在同样时间范围内，烟草致死人数为700万、艾滋病120万、结核病110万、疟疾70万，而空气污染已远远超过了这些危害性极大的传染病。2017年初，雾霾席卷了大半个中国，空气中悬浮的固体颗粒pm10和pm2.5污染受到人们的前所未有的担忧和关注，已有的科学研究表明，它们已成为当前危害公众健康的首要污染物，且于2014年1月，国家首次将雾霾天气纳入2013年自然灾情进行通报。

北京清华大学朱听课题组在北京雾霾天的大气样本中，鉴定出1300多种微生物。顾为东等提出中国式雾霾与微生物密切相关，雾霾为微生物提供了大量可附着颗粒物，可引起近地面紫外线强度减弱，从而使杀菌效果减弱，这在很大程度上增加了大气中微生物的数量。且研究发现，雾霾频发会导致大量微生物种群滋生，且改变微生物种群结构和优势微生物群落丰度，数据显示，雾霾天气微生物群落丰度较非雾霾天气微生物群落丰度呈指数增长。

空气虽不是微生物繁殖的良好场所，但土壤、水体、各种腐烂的有机物以及人和动物、植物体上的微生物，都可以随着气流运动被携带到空气中，因此空气是微生物的重要传播载体，其污染程度与我们的衣食住行息息相关。

因此，亟需针对雾霾环境中的病原微生物展开调查及安全性评估，确定风险隐患和危害程度，为风险交流与管理、科普宣传与解答公众疑虑提供科学依据，并增加民众对病原微生物的认知、自觉采取安全的防护措施。

技术实现要素：

本发明的目的在于在筛查雾霾中的病原微生物时能够快速、简便的得到筛查结果，在第一时间控制病原微生物的蔓延，为食品安全突发事件争取有效的时间。本发明的快速筛查方法具有高效、快速、实时监测、操作简便等优势。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法，其特征在于它按如下步骤进行：

(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；

(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1ml洗脱菌苔于2ml离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μl去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为dna；

(3)采用实时荧光pcr扩增引物及探针引物，对7种食源性致病菌的dna进行扩增；

其中的实时荧光pcr反应体系为20μl，各成分含量为：2×mix预混液10μl，上下游引物各1μl，探针引物0.4μl，rox0.4μl，模板2μl，无菌超纯水补足20μl，混匀后离心，在实时荧光pcr仪上开始循环。循环参数为：95℃预变性10min，然后进行40个循环，每个循环为95℃变性15s，60℃退火1min。

本发明所述的快速鉴定方法，其中7种病原微生物指的是：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌o157:h7、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和蜡样芽孢杆菌。

为了能更加清楚的说明本发明的快速筛查方法，下面以雾霾为样本实例，对本发明的快速筛查方法加以说明。

一、材料和引物

(1)样品：雾霾1号样本，西青区红旗农贸批发市场定点采集。

(2)主要仪器：空气微生物采样器，实时荧光定量pcr扩增仪，恒温水浴锅。

(3)主要试剂：

pcr引物、探针由上海生工公司合成，引物序列见表1。

2×premixextaq(probeqpcr)试剂购自takara公司。

表1病原微生物鉴定定量pcr引物序列

二、雾霾中病原微生物的收集及dna提取

(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；

(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1ml洗脱菌苔于2ml离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μl去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为dna；

三、雾霾中病原微生物的实时荧光pcr扩增筛查试验：

1、pcr反应体系组成：

2×premixextaq(probeqpcr)10μl，上游和下游引物10μmol/l各1μl，探针10μmol/l，0.4μl，rox，0.4μl，供试黄瓜细菌基因组dna模板，2μl，双蒸水补足20μl；

2、pcr反应程序：

95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；

3、实时荧光pcr扩增结果：

通过扩增曲线的有无及ct值的大小，判断雾霾病原微生物的检出与否，结果见附图1。扩增结果为阳性的样品，再进行进一步的生化鉴定。

本发明具有的积极效果在于：

(1)采用分子生物学鉴定方法与传统培养方法相结合，有效的克服了因传统方法费时、费力、繁琐、且检测周期过长，难以满足应急预案处理的需要。

(2)本方法最大的优点在于其过程快速，简便，实时监测，充分提高了雾霾这一重要传播介质中病原微生物鉴定的检测效率。与传统的培养鉴定过程需要将近1周的时间相比，采用本方法，2天即可完成样本筛查的全过程。

(3)采用本发明方法对雾霾空气样品进行筛查，一次性可筛查的样本量相比传统培养法可大大提高。

附图说明:

图1为西青区红旗农贸批发市场雾霾样品中7种病原微生物筛查鉴定的实时荧光pcr扩增图谱；如图标注分别为病原微生物阳性对照样本；雾霾样本；空白对照样本；

图2为南开区华苑农贸市场雾霾空气样本、河西区纪庄子农贸市场雾霾空气样本、西青区津静公路收费站雾霾空气样本中7种病原微生物筛查鉴定的实时荧光pcr扩增图谱；如图标注分别为病原微生物阳性对照样本；雾霾样本；空白对照样本；

具体实施方式

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

以南开区华苑农贸市场雾霾空气为样本，采用本发明方法快速筛查7种病原微生物。制备方法如下：

(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；

(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1ml洗脱菌苔于2ml离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μl去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为dna；

实时荧光pcr检测：

1、对7种食源性致病菌进行实时荧光pcr扩增，引物序列为：

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2、反应体系：

2×premixextaq(probeqpcr)10μl，上游和下游引物10μmol/l各1μl，探针10μmol/l，0.4μl，rox，0.4μl，供试普通绿黄瓜细菌基因组dna模板，2μl，双蒸水补足20μl。

3、反应程序：

95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；

4、结果：南开区华苑农贸市场雾霾空气样本实时荧光pcr扩增结果见图2。

实施例2

以河西区纪庄子农贸市场雾霾空气为样本，采用本发明方法快速筛查7种病原微生物。制备方法如下：

(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；

(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1ml洗脱菌苔于2ml离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μl去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为dna；

实时荧光pcr检测：

1、对7种食源性致病菌进行实时荧光pcr扩增，引物序列为：

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2、反应体系：

2×premixextaq(probeqpcr)10μl，上游和下游引物10μmol/l各1μl，探针10μmol/l，0.4μl，rox，0.4μl，供试普通绿黄瓜细菌基因组dna模板，2μl，双蒸水补足20μl。

3、反应程序：

95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；

4、结果：河西区纪庄子农贸市场雾霾空气样本实时荧光pcr扩增结果见图2。

实施例3

以西青区津静公路收费站雾霾空气为样本，采用本发明方法快速筛查7种病原微生物。制备方法如下：

(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；

(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1ml洗脱菌苔于2ml离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μl去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为dna；

实时荧光pcr检测：

1、对7种食源性致病菌进行实时荧光pcr扩增，引物序列为：

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2、反应体系：

2×premixextaq(probeqpcr)10μl，上游和下游引物10μmol/l各1μl，探针10μmol/l，0.4μl，rox，0.4μl，供试普通绿黄瓜细菌基因组dna模板，2μl，双蒸水补足20μl。

3、反应程序：

95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；

4、结果：西青区津静公路收费站雾霾空气样本实时荧光pcr扩增结果见图2。

序列表

<110>天津市农业质量标准与检测技术研究所

<120>一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法

<160>21

<210>1

<211>19bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcggcgttggagagtgata19

<210>2

<211>21bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>28bp

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<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>25bp

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<210>6

<211>27bp

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<400>6

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<210>7

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<213>人工序列

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<210>8

<211>24bp

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<210>9

<211>30bp

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<213>人工序列

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<210>10

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<211>18bp

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<211>28bp

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<213>人工序列

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<400>17

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<211>21bp

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<400>21

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