间充质干细胞的采集装置及采集方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种间充质干细胞的采集装置及采集方法。

背景技术：

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞，包括骨膜、松质骨、脂肪、骨骼肌、骨髓液和血液等。因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力，也可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

间充质干细胞采集的现有技术：

1)贴壁筛选法：最常用的骨髓基质干细胞筛选方法。利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除。但需要时间较长，涉及细胞的体外培养，临床使用有一定难度。

2)密度梯度离心法：利用一定的惰性梯度介质(如ficol溶液等)在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质顶部，通过重力或离心力的作用使细胞分层分离。但较长时间的高速离心，难免影响细胞活力，因此，原代细胞生长较慢，短期不能大量扩增。

3)流式细胞仪分离法：应用特异的荧光抗体与细胞表面的抗原标志相结合，然后应用流式细胞仪对其进行分选。虽然分离迅速纯度高，但是费用昂贵，对痕量细胞难以分离，不能处理大量的样品。

4)免疫磁珠分离法：基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞不能与连接磁珠而被排除，从而使细胞得以分离。但对细胞损伤大，回收率低，价格昂贵。

除上述常用技术外，近年出现了一些新方法。利用明胶溶液破坏红细胞表面电荷而加速红细胞沉积；利用密度梯度离心而使各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而分离出骨髓中的单个核细胞。还有采用人新鲜脐带经胶原酶消化后分离培养而成，适于冷冻保存。另外通过与细胞外基质粘附而从脐带血分离间充质干细胞。上述干细胞分离方法对快速、有效、简易和无污染的临床应用要求仍有很大距离。人体血液和骨髓液中含有丰富的间充质干细胞，如何采集和即时使用是急待决定的问题。

发明人研究发现人体血液和骨髓液中细胞分为有核细胞和无核细胞，而间充质干细胞属于有核细胞。红细胞为无核细胞，呈双凹圆盘状，直径6～9.5微米，平均7.2微米。血小板直径2～4微米，呈双凸扁盘状。白细胞直径6～20微米不等，呈无色有核细胞。研究发现机械应力干预下体外培养时，细胞形态、结构、功能和分化都会受到影响。akhouayri等发现动态载荷下细胞会变圆变大，而静态载荷下细胞被拉伸并沿拉伸轴排列。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的采集装置及采集方法，以解决间充质干细胞采集困难的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种间充质干细胞的采集装置，包括互相连通的储液装置和储物装置，所述储液装置用于容纳血液和/或骨髓液，所述储物装置用于容纳多孔生物陶瓷；

所述血液和/或骨髓液往复流动于所述储液装置和所述储物装置之间，并在所述储物装置中被所述多孔生物陶瓷过滤，以使血液和/或骨髓液中的间充质干细胞存留在所述多孔生物陶瓷上。

可选的，所述储液装置包括：储液腔体和第一推进器，所述储液腔体具有一储液腔，所述第一推进器的一端与所述储液腔的内壁密封贴合，并可沿所述储液腔内壁滑动。

可选的，所述第一推进器包括依次连接的第一推柄、第一推杆以及第一活塞，所述第一活塞与所述储液腔的内壁密封贴合，并可沿所述储液腔内壁滑动。

可选的，所述储物装置包括：储物腔体、隔物腔体以及第二推进器，所述储物腔体具有一储物腔，所述隔物腔体具有一隔物腔，所述隔物腔体的外壁与所述储物腔的内壁密封贴合，并可沿所述储物腔的内壁滑动，所述第二推进器的一端与所述隔物腔的内壁密封贴合，并可沿所述隔物腔的内壁滑动；所述隔物腔的底端具有若干过滤孔，所述储物腔体的底端设置有一可拆卸的密封盖。

可选的，所述第二推进器包括依次连接的第二推柄、第二推杆以及第二活塞，所述第二活塞与所述隔物腔的内壁密封贴合，并可沿所述隔物腔的内壁滑动。

可选的，所述隔物腔体包括依次连接的第三推柄、腔壁、以及腔底，所述腔壁与所述储物腔的内壁密封贴合，并可沿所述储物腔的内壁滑动；所述若干过滤孔开设在所述腔底上。

可选的，还包括连通装置，用于连通所述储液装置和所述储物装置，所述连通装置的一端与所述储液装置连通，所述连通装置的另一端与所述储物装置连通。

可选的，所述连通装置上设置有三通阀，所述三通阀具有互相连通的第一端口、第二端口以及第三端口；

所述第一端口通过所述连通装置与所述储液装置连通，所述第二端口通过所述连通装置与所述储物装置连通，所述第三端口，用于往所述储液装置注射血液或骨髓液。

可选的，所述连通装置为一u形管。

可选的，所述储液装置和/或所述储物装置采用petg材料制备。

可选的，所述多孔生物陶瓷由至少两层多孔结构叠加排列，所述至少两层多孔结构的孔径逐渐增大，且孔隙间相互连通。

为了解决上述问题，本发明明另一方面提供一种间充质干细胞的采集方法，包括以下步骤：

s1，在无菌条件下将多孔生物陶瓷载入储物腔体的储物腔内；

s2，将血液和/或骨髓液通过三通阀注入储液腔；

s3，推压第一推进器，使血液和/或骨髓液通过多孔生物陶瓷进入隔物腔内；

s4，推压第二推进器，使血液和/或骨髓液再次通过多孔生物陶瓷进入储液腔；

s5，重复循环执行步骤s3、s4若干次后，取出多孔生物陶瓷备用。

可选的，所述多孔生物陶瓷采用以下方法制备：

取五组直径范围分别为50μm-150μm、150μm-250μm、250μm-350μm、350μm-450μm、450μm-550μm的pmma球形颗粒；

每组pmma球形颗粒各取一定量分五层依次堆积在相应的模具内加模具栓，并在模具腔内加入丙酮；

预定时间后，对模具脱模，并取出由五层pmma球形颗粒堆积形成的有机构架；

将所形成的有机构架放入石膏模具内，并加入磷酸钙浆液，待干燥成形后，脱模并取出由有机构架形成的陶瓷坯体；

将陶瓷坯体在排胶炉内加温消除有机物后移入烧结炉内烧结成多孔生物陶瓷。

可选的，所述s1具体包括：打开密封盖，将多孔生物陶瓷较大孔径的一面置于储物腔底部，盖上密封塞后推动隔物腔体以固定多孔生物陶瓷。

在本发明提供的间充质干细胞的采集装置及方法中，利用多孔生物陶瓷从血液、骨髓液及体液中分离和采集充质干细胞，而且也可将采集的细胞连同多孔生物陶瓷即刻应用于临床治疗；另一方面，多孔生物陶瓷能够根据孔径的大小，小孔起到细胞过滤作用；大孔发挥过滤时细胞储留空间和细胞粘附场所，植入体内时组织长入，且空隙间相互连通以便细胞通过；另一方面，间充质干细胞复合到多孔生物陶瓷之中，达到治疗物质能简单快速和均匀高效地复合，提高材料生物效应；另一方面，该梯度多孔生物陶瓷能使间充质干细胞在过滤过程中贴附到材料内部结构表面，有效地避免梯度多孔生物陶瓷应用时由于出血和冲洗造成的细胞丢失；另一方面，该间充质干细胞的采集装置也可作为细胞培养装置，能使细胞在多孔材料内部增殖和分化；另一方面，该间充质干细胞的采集装置能使干细胞的分类和复合过程在密闭无菌环境内经行，可避免化学和生物污染的可能性，使分离后或复合后的产品能即刻用于临床；另一方面，该过滤采集方法能简单快速和均匀高效地将间充质干细胞分离或复合到梯度多孔生物陶瓷内，并能即刻临床应用，该方法及装置可用于生物、制药、医学和兽医领域。

附图说明

图1是本发明一实施例中多孔生物陶瓷的示意图；

图2是图1的局部放大图；

图3是本发明一实施例中间充质干细胞的采集装置的示意图；

图4是本发明一实施例中间充质干细胞的采集装置的剖视立体图；

图5是本发明一实施例中富集干细胞过滤分离的操作流程图。

图中：10-储液装置；11-储液腔体；12-第一推进器；121-第一推柄；122-第一推杆；123-第一活塞；

20-储物装置；21-储物腔体；211-密封盖；22-隔物腔体；221-第三推柄；222-腔壁；223-腔底；23-第二推进器；231-第二推柄；232-第二推杆；233-第二活塞；

30-连接装置；31-三通阀。

具体实施方式

本发明的核心思想在于提供一种间充质干细胞的采集装置及采集方法，从血液、骨髓液及体液中分离和采集间充质干细胞，而且可将采集的间充质干细胞连同多孔生物陶瓷即刻应用于临床治疗。该装置和方法可应用于生物、制药、医学和兽医等领域。

以下结合附图和具体实施例对本发明提出的间充质干细胞的采集装置及采集方法作进一步详细说明。根据权利要求书和下面说明，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

实施例一

参阅图3-4，本实施例提供一种间充质干细胞的采集装置，包括：

储液装置10，用于容纳血液和/或骨髓液，储液装置10包括：储液腔体11和第一推进器12，所述储液腔体11具有一储液腔，第一推进器12的一端与储液腔的内壁密封贴合，并可沿所述储液腔内壁滑动，以推动储液腔内的液体；

储物装置20，用于容纳多孔生物陶瓷(即过滤体)，储物装置20包括：储物腔体21、隔物腔体22以及第二推进器23，储物腔体21具有一储物腔，隔物腔体22具有一隔物腔，隔物腔体22的外壁与储物腔的内壁密封贴合，并可沿储物腔的内壁滑动，第二推进器23的一端与隔物腔的内壁密封贴合，并可沿隔物腔的内壁滑动；所述隔物腔的底端具有若干过滤孔，储物腔体21的底端设置有一可拆卸的密封盖211；

连通装置30，用于连通储液装置10和储物装置20，连通装置30的一端与储液装置10连通，连通装置30的另一端与储物装置20连通。从而血液和/或骨髓液可以通过连通装置30在储液装置10和储物装置20之间流动，其中，血液和/或骨髓液被储物装置20中的多孔生物陶瓷过滤，使血液和/或骨髓液中的间充质干细胞储存在多孔生物陶瓷中。根据人体不同种类细胞的直径和形态的不同，以及在动态载荷情况下会变圆变大的特征，采用筛网过滤法就可分离细胞。再加上干细胞本身的粘附性能来提高采集率。采集的骨髓液和血液中加入抗凝剂和/或稀释液后，多孔生物陶瓷将大于孔径的细胞滞留，去除小细胞(如红细胞)和无形成分，达到充质干细胞的采集目的。

进一步的，连通装置30上设置有三通阀31，三通阀31具有互相连通的第一端口、第二端口以及第三端口；第一端口通过连通装置3与储液装置10连通，第二端口通过连通装置30与储物装置20连通，所述第三端口，用于往储液装置10注射血液或骨髓液。

较佳的，连通装置30为一u形管，采用petg(英文名全称poly(ethyleneterephthalateco-1，4-cylclohexylenedimethyleneterephthalate)，是一种透明、非结晶型共聚酯)材料制备。

储液装置10和/或储物装置20采用petg材料制备。

进一步的，第一推进器12包括依次连接的第一推柄121、第一推杆122以及第一活塞123，第一活塞123与储液腔的内壁密封贴合，并可沿所述储液腔内壁滑动，推动第一推柄121，可使第一活塞123沿所述储液腔内壁滑动，从而使储液腔内的液体流入储物腔，本领域技术人员很容易理解其原理类似于注射器，在此不予赘述。

第二推进器23包括依次连接的第二推柄231、第二推杆232以及第二活塞233，第二活塞233与隔物腔的内壁密封贴合，并可沿隔物腔的内壁滑动，其工作原理与第一推进器12相似，在此不予赘述。

隔物腔体22包括依次连接的第三推柄221、腔壁222以及腔底223，腔壁222与储物腔的内壁密封贴合，并可沿所述储物腔的内壁滑动；所述若干过滤孔开设在腔底223上，当多孔生物陶瓷放入储物腔后，盖好密封盖211，然后推动第三推柄221，使腔底223紧紧压住多孔生物陶瓷，保证多孔生物陶瓷相对稳定。

本实施例所提供的生物多孔陶瓷的最底层的孔径被精确控制在10-12微米，使过滤时大部分有核细胞即间充质干细胞被保留。生物多孔陶瓷的其它层可为1-5层，孔径从50-1000微米(如图1所示)。它们的孔隙为细胞储留提供三维空间，为细胞粘附提供二维空间(如图2所示)。较佳的，多孔生物陶瓷由至少两层多孔结构叠加排列，所述至少两层多孔结构的孔径逐渐增大，且孔隙间相互连通。

实施例二

基于实施一提供的间充质干细胞的采集装置，本实施例提供一种间充质干细胞的采集方法，参阅图5，所述间充质干细胞的采集方法包括以下步骤：

s1，在无菌条件下将多孔生物陶瓷载入储物腔体的储物腔内；

s2，将血液和/或骨髓液通过三通阀注入储液腔；

s3，推压第一推进器，使血液和/或骨髓液通过多孔生物陶瓷进入隔物腔内；

s4，推压第二推进器，使血液和/或骨髓液再次通过多孔生物陶瓷进入储液腔；

s5，重复循环执行步骤s3、s4若干次后，取出多孔生物陶瓷备用。

采集的间充质干细胞能被脱洗下来进行体外培养或复合材料备用，也可将多孔生物陶瓷连同充质干细胞即刻临床使用。

为了更详细的描述上述5个步骤，更为具体一种方案如下：将直径10mm×30mm多孔生物陶瓷在无菌条件下载入储物腔中，拧紧密封盖211，用注射器将40ml自体骨髓液注入储液腔，使储液腔内第一推进器12顶之高位，关闭三通阀31。推动隔物腔体22将多孔生物陶瓷固定，同时缓慢推进储液腔的第一推进器12，使液体通过多孔生物陶瓷进入储物腔，并顶起第二推进器23。缓慢推进第二推进器23使液体再度通过多孔生物陶瓷进入储液腔，往而反复数十次，提高复合效率。将液体推入储液腔后，打开密封盖211，取出多孔生物陶瓷备用。

其中，所述多孔生物陶瓷采用以下方法制备：

取一定量的pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)球形颗粒，先后通过50um、150um、250um、350um、450um、550um孔径的标准筛进行筛选，得到50um-150um、150um-250um、250um-350um、350um-450um、450um-550um的pmma球形颗粒。将筛选出的pmma球形颗粒各取0.645g分5层依次堆积在相应的不锈钢模具腔内，加入丙酮并加模具栓，5分钟后用纯水冲固定，脱模取出有机构架。取13g磷酸钙粉体加入5.8ml纯化水搅拌2小时，形成磷酸钙浆液，将有机构架放置到长4cm宽1.5cm条形石膏模具内，向模具内倒入磷酸钙浆液，待干燥成形后脱模取坯。陶瓷坯体在排胶炉290℃加温消除有机物后移入烧结炉内1100℃烧结成可控微结构的5层直径10mm×30mm的梯度多孔生物陶瓷。

更为具体一种方案如下：

1)造孔剂选用pmma球形颗粒，通过标准筛筛选出相应粒径。过滤体(即生物多孔陶瓷)最底层所用造孔剂的粒径误差控制在1微米以内。

粒径计算公式：造孔剂粒径＝过滤体内孔径+过滤体内孔径×材料收缩率。

2)有机构架制备是将筛选出的pmma球形颗粒分层堆积在相应的不锈钢模具腔内，加入丙酮并加模具栓5分钟后用纯水冲固定，脱模取出有机构架备用。

层厚计算公式：堆积造孔剂厚度＝过滤体内层厚+过滤体内层厚×材料收缩率。

3)陶瓷浆液配置是将过滤体最底层孔径的相应造孔剂和粉体用纯水搅拌成浆液。

陶瓷浆液配比：1％-20％wt造孔剂+55％-65％wt粉体+25％-35％wt纯水

4)陶瓷坯体制备是将有机构架放置到相应的石膏模具内，为过滤体最底层的厚度预留空间并灌注浆液，待干燥成形后脱模取坯。

5)陶瓷坯体在排胶炉加温消除有机物后移入烧结炉内烧结成可控微结构的复层梯度多孔生物陶瓷。

多孔生物陶瓷为多孔状，孔隙分布可为均一，也为多层不同孔叠加梯度排列，孔径常常是从大到小，孔隙间相互连通以便细胞通过。小孔起到细胞过滤作用；大孔发挥过滤时细胞储留空间和细胞粘附场所，植入体内时组织长入。

进一步的，所述s1具体包括：打开密封盖，将多孔生物陶瓷较大孔径的一面置于储物腔底部，盖上密封塞后推动隔物腔体以固定多孔生物陶瓷。

综上所述，在本发明提供的间充质干细胞的采集装置及方法中，利用多孔生物陶瓷从血液、骨髓液及体液中分离和采集充质干细胞，而且也可将采集的细胞连同多孔生物陶瓷即刻应用于临床治疗；

另一方面，多孔生物陶瓷能够根据孔径的大小，小孔起到细胞过滤作用；大孔发挥过滤时细胞储留空间和细胞粘附场所，植入体内时组织长入，且空隙间相互连通以便细胞通过；

另一方面，间充质干细胞复合到多孔生物陶瓷之中，达到治疗物质能简单快速和均匀高效地复合，提高材料生物效应；

另一方面，该梯度多孔生物陶瓷能使间充质干细胞在过滤过程中贴附到材料内部结构表面，有效地避免梯度多孔生物陶瓷应用时由于出血和冲洗造成的细胞丢失；

另一方面，该间充质干细胞的采集装置也可作为细胞培养装置，能使细胞在多孔材料内部增殖和分化；

另一方面，该间充质干细胞的采集装置能使干细胞的分类和复合过程在密闭无菌环境内经行，可避免化学和生物污染的可能性，使分离后或复合后的产品能即刻用于临床；

另一方面，该过滤采集方法能简单快速和均匀高效地将间充质干细胞分离或复合到梯度多孔生物陶瓷内，并能即刻临床应用，该方法及装置可用于生物、制药、医学和兽医领域。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的系统而言，由于与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。