佛甲草耐盐基因SLLAZY1及其应用的制作方法

本发明涉及一种佛甲草(sedumlinearethunb,简称slt)耐盐基因及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术：

目前，土地盐碱化是城市园林绿地绿化中面临的严重问题，因此选择耐盐植物建设耐盐型绿地，有效发挥城市绿化的景观效益和生态效益，是实现节水、低成本园林绿地建设和养护目标的手段之一。佛甲草(sedumlineare)属景天科多年生肉质草本植物，适应性极强，具有耐热、耐旱、耐寒、耐瘠特性，主要生于山野水湿地及岩石上，是优良的地被植物，人工栽培于庭园、园林绿地中心。因此，选择佛甲草为研究对象，了解植物耐盐的生理基础和植物抗盐的途径，认识盐分胁迫的信号传递机制，弄清耐盐基因的功能与作用，探讨耐盐植物选育研究的进展，对于进一步推动耐盐植物选育研究，加快盐碱地植被恢复具有重要意义。同时为合理利用佛甲草进行园林绿地，美化环境，为建设城市绿地提供理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种佛甲草耐盐基因sllazy1。

本发明的第二个目的是提供含有佛甲草耐盐基因sllazy1的克隆载体。

本发明的第三个目的是提供含有上述克隆载体的宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供含有佛甲草耐盐基因sllazy1的表达载体。

本发明的第五个目的是提供含有上述表达载体的宿主细胞。

本发明的第六个目的是提供佛甲草耐盐基因sllazy1增强拟南芥或烟草耐盐性能的用途。

本发明的技术方案概述如下：

佛甲草耐盐基因sllazy1，是序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。

含佛甲草耐盐基因sllazy1的克隆载体pjet1.2_sllazy1。

含有克隆载体pjet1.2_sllazy1的宿主细胞。

含佛甲草耐盐基因sllazy1的表达载体pbi121_sllazy1。

含有表达载体pbi121_sllazy1的宿主细胞。

佛甲草耐盐基因sllazy1增强拟南芥或烟草耐盐性能的用途。

本发明的优点：

实验证明，佛甲草耐盐基因sllazy1增强拟南芥或烟草耐盐性能。

附图说明

图1为sllazy1基因克隆电泳示意图。

图2为sllazy1插入表达载体后示意图。

图3为pbi121_sllazy1转化拟南芥后，转化子基因组pcr筛选结果。

图4为pbi121_sllazy1转化拟南芥后，t3纯合体半定量pcr测定表达水平结果。

图5为sllazy1转基因拟南芥t3纯合体抗盐实验效果照片。

图6pbi121_sllazy1转化烟草后，转化子基因组pcr筛选结果。

图7pbi121_sllazy1转化烟草后，半定量pcr测定表达水平结果。

图8sllazy1转基因烟草抗盐实验效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

载体pjet1.2:thermo,clonejetpcrcloningkit#k1231

载体pbil21购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/实施例1

1.佛甲草(sedumlinearethunb,简称slt)sllazy1基因的克隆

从150mmnacl水溶液处理的佛甲草(取自天津市滨海新区)中，使用植物rneasyplantminikit(transgenecode#e101-0150rxns)提取总rna，并且利用easyscriptfrist-strandcdnasynsgesissupermix(transgenecode#ae301-03100rxns)反转录出cdna。对cdna进行高通量测序(诺禾致源公司进行高通量测序)获得sllazy1基因的3’端序列，使用race技术(takara-racekit)获得sllazy1基因的全长cdna序列将扩增得到的sllazy1基因进行测序分析，得到完整的sllazy1基因全长为921bp。构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端添加pbi121重组位点，上游5'–acgggggactctagaggatcc-3'(seqidno.3)，下游5'-cgatcggggaaattcgagctc-3'(seqidno.4)，以利于后期表达载体的构建。其具体步骤如下：

1).cdna第一链的合成

用反转录试剂盒takararnapcrkit(amv)ver.3.0，以总rna为模板，oligo(dt)为引物，在amv逆转录酶的作用下合成cdna第一链，反转录体系如下：

反应条件：42℃60min，99℃5min。

2).佛甲草sllazy1基因反转录质量pcr扩增检测

用佛甲草actin基因特异引物seqidno.5:5'-gaacttactagccgactg-3',seqidno.6：5'-cctcaagccttatacgcaa-3'，pcr扩增，以验证反转录反应及rna质量。

pcr反应体系如下：

反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。

3).佛甲草sllazy1基因片段pcr扩增

利用takararacekit扩增得到的sllazy1基因进行测序分析，得到完整的佛甲草sllazy1基因全长为921bp(seqidno.1)。由佛甲草sllazy1基因编码的蛋白质，是seqidno.2所示的氨基酸序列。根据已知cdna序列利用primer软件设计sllazy1基因上下游引物:

seqidno.7:5'-atgaagttactaggttggatgc-3'，

seqidno.8:5'-ttatgctgtgctctctggatg-3'，其pcr反应体系如下：

pcr反应条件为:95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，90s，35cycles；72℃，10min；4℃，∞。

pcr反应结束后，取1μlpcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测pcr产物的质量(见图1)，其余用作产物的纯化回收。

4).构建含有佛甲草sllazy1基因的克隆载体

构建含有佛甲草sllazy1基因的载体pjet1.2_sllazy1

胶回收纯化后的佛甲草sllazy1基因目的片段利用clonejetpcrcloningkit

(pjet1.2:thermo,clonejetpcrcloningkit#k1231)重组到载体pjet1.2上，得到载体pjet1.2_sllazy1。

其反应程序如下：

反应条件24℃,10min冰上静止30min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，

转入感受态细胞dh5α，37℃，180rpm，45min，此程序结束后将菌液涂到lb(添加抗生素amp100um)固体培养基中，37℃过夜培养。

分别利用目的片段的上下游引物(seqidno.7和seqidno.8)对不同的菌落进行菌落pcr验证，筛选阳性菌落测序，得到含有克隆载体pjet1.2_sllazy1的宿主细胞。

注：pjet1.2:thermo,clonejetpcrcloningkit#k1231载体购于invitrogen；所用大肠杆菌为dh5α感受态细胞，tiangen，cb101-2。

5).构建含有佛甲草sllazy1基因的表达载体

构建含有佛甲草sllazy1基因的表达载体pbi121_sllazy1

构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端和3’添加pbi121重组位点，

seqidno.3:5'–acgggggactctagaggatcc-3',

seqidno.4:5'-cgatcggggaaattcgagctc-3'

得到：

seqidno.9:5'-acgggggactctagaggatccatgaagttactaggttggatgc-3'

seqidno.10:5'-cgatcggggaaattcgagctcttatgctgtgctctctggatg-3'

提取测序正确的pjet1.2-基因的质粒，作为模版，利用含有重组位点seqidno.9，seqidno.10为引物进行pcr扩增，其反应体系如下

pcr反应条件为:95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，90s，35cycles；72℃，10min；4℃，∞。

pcr反应结束后，取1μlpcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测pcr产物的质量(见图1)，其余用作产物的纯化回收。

提取pbi121质粒，其载体图谱(见图2)，对其进行双酶切线性化，程序如下：

反应条件：37℃，12h，80℃20min失活。

将基因和线性化的pbi121质粒使用cloneexpressentryonestepcloningkit试剂盒进行重组构建，反应程序如下：

反应程序：37℃，30min，冰上5min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞dh5α，37℃，180r，45min，此程序结束后将菌液涂到lb(添加抗生素kan50um)固体培养基中，37℃过夜培养。

分别利用载体和目的片段的上下游引物(见seqidno.9和seqidno.10)对同一个菌落进行菌落pcr双重验证，筛选阳性菌落进行测序(见seqidno.11)，从而获得含佛甲草耐盐基因sllazy1的表达载体pbi121_sllazy1。

注：本步骤使用clonexpressentryonestepcloningkit购于vazyme，

6).含有佛甲草sllazy1基因的重组载体转化农杆菌感受态细胞

实验所用的农杆菌菌株为c58(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/)，c58具有利福平抗性(rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗性(gen)。

利用电击农杆菌转化法，将含有佛甲草sllazy1基因的大肠杆菌表达载体pbi121_sllazy1转化到农杆菌株c58(pmp90)感受态细胞中，28℃，培养36h，菌落pcr挑选阳性克隆菌落。

实施例2

1.转化拟南芥

(1)转化拟南芥。

转化拟南芥的具体操作步骤：

①实施例1获得的阳性克隆菌落活化与扩大培养

活化：挑保存的阳性克隆菌落置于3mlyeb液体培养基中(添加抗生素gen使浓度为30mg/l、添加抗生素rift使浓度为25mg/l以及抗生素sp使浓度为50mg/l)培养15小时左右(至od600＝0.8左右)，180rpm，28℃。

阳性克隆菌的扩大培养：新鲜的10ml的yeb液体培养基中加入适量的抗生素(添加抗生素gen浓度为30mg/l、抗生素rift浓度为25mg/l以及抗生素sp浓度为50mg/l)，然后接种适量阳性克隆菌液到yeb液体培养基中进行培养，180rpm，在28℃培养至od600＝0.6。

②转化

将菌液离心(3000rpm，15℃,10min)后弃上清，用体积两倍于所取菌液的质量浓度为5％的蔗糖水溶液重悬菌体(缓慢操作以保证菌体活力)，使菌体散开，调od600＝0.8。

选取培养3-4周抽苔5-7cm的野生型拟南芥，倒置于装有转化液的容器中，使整个花序浸泡在菌液中15秒，取出拟南芥横躺在托盘中，用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h，使拟南芥直立在温度25℃，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长，直到种子成熟。种子采集后放到37℃烘箱烘干两周，以备后续试验使用。

(2)转基因拟南芥阳性转化子纯合体的筛选

将收取的t1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃三天，然后在超净台上将转基因拟南芥种子均匀播种在含有50μg/ml卡那霉素的1/2ms固体筛选培养基上，在1800lux，光周期16h光照/8h黑暗，生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的t1代阳性转化子。当t1代阳性转化子植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤(德国进口泥炭土422#，购于klasmann-deilmanngmbh,德国，http://www.klasmann-deilmann.com)中，在温度25℃，1800lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下继续生长14天，先作阳性转化子的鉴定(见图3)，再通过半定量pcr先对其转基因的表达水平进行鉴定(见图4)，选取表达水平低的独立转化株系6号和表达水平高的独立转化株系7号。在上述条件下继续生长，约一个半月后收集种子即为t2代转化种子。重复上述步骤得到6号和7号的t3代纯合体种子。(3)对转基因拟南芥进行盐胁迫处理

将6号t3代纯合体种子、7号t3代纯合体种子、野生拟南芥种子分别种植在土壤中，在温度25℃，1800lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长21天，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分为三组平行实验，每组不同类型的植株各7株，均用盐分处理液(150mmnacl水溶液)进行浇灌处理。3天浇一次，每次浇灌量为土壤质量的0.5倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理15天后植物照相(见图5)。

实施例3

1.转化烟草

供阳性克隆菌转化的烟草为nc89(6855-2×6772)组培苗。

(1)转化烟草的具体操作步骤：

①实施例1获得的阳性克隆菌落活化与扩大培养

活化：挑保存的阳性克隆菌落置于3mlyeb液体培养基中(添加抗生素gen浓度为30mg/l、抗生素rift浓度为25mg/l以及抗生素sp浓度为50mg/l)培养15小时左右(至od600＝0.8左右)，180rpm，28℃。

阳性克隆菌的扩大培养：新鲜的10mlyeb液体培养基中加入适量的抗生素(添加抗生素gen浓度为30mg/l、抗生素rift浓度为25mg/l以及抗生素sp浓度为50mg/l)，然后接种适量阳性克隆菌液到yeb液体培养基中进行培养，180rpm，在28℃培养至od600＝0.6。

②转化

将菌液离心(3000rpm，15℃,10min)后弃上清，用体积两倍于所取菌液的质量浓度为5％的蔗糖水溶液重悬菌体(缓慢操作以保证菌体活力)，使菌体散开，调od600＝0.8。

选取生长30天状况良好的烟草组培苗，挑选厚实叶片，减去叶边缘，把叶片剪成1cm×1cm的外植体碎片。将剪好的叶片材料浸入含有农杆菌菌体的质量浓度5％的蔗糖水溶液中，24℃条件下震荡培养10min。侵染后，将外植体吸干后放在ms培养基上(ms盐4.4g，蔗糖30g，定容至1l，ph＝5.7，琼脂7.2g)，黑暗培养3天。将经过暗培养的外植体用灭过菌的蒸馏水清洗2-3次，用滤纸吸干后，外植体放在选择培养基上ms盐4.4g，蔗糖30g，生长素naa1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，卡那霉素500mg，头孢霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1l，ph＝5.7；培养条件：2000lux光下培养14天，光照/黑暗为16h/8h).

(2)经过选择培养基，外植体长出小苗子的时候，将整棵小苗子切下，将根原基竖直插到培养基中ms培养基上，诱导生根。待生根完成后，对每一棵独立转化子进行阳性鉴定(见图6)。

通过半定量pcr选取高表达水平的独立转化株系6号和低表达水平的独立转化株系8号进行抗盐实验(见图7)

(3)将烟草进行盐处理

将生长7天的长势均匀的转基因高表达烟草、低表达转基因烟草、野生型烟草移栽至土盆中，待土盆苗生长15天后，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分成三组，每组不同类型的植株各7株，用盐分处理液(150mmnacl水溶液水溶液)进行浇灌处理。3天浇一次，每次浇灌量为土壤质量的0.5倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理30天后观察植株并照相(见图8)。

sequencelisting

<110>天津大学

<120>佛甲草耐盐基因sllazy1及其应用

<130>

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

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