本发明涉及精细化工技术领域，更具体地，涉及一种具有ph响应的松香基磷酸酯类表面活性剂及其应用。
背景技术：
磷脂是脂类分子，是所有细胞膜的主要组成部分。磷脂具有两亲性，因此可以形成脂双层。磷脂分子是由两个疏水性脂肪酸“尾”组成亲水性磷酸盐“头”，由醇或甘油分子连接在一起组成的。磷脂类化合物，由于具有药物安全性高、生物相容性好、治疗效率高，药物活性高等优点，收到了广泛关注。此外，磷脂具有高度疏水性和超亲电性质，使其可以作为药物载体的核心，被广泛用作药物载体。
磷酸酯是类同磷脂结构的一类磷酸的酯化合物，由于其优异的乳化性、抗电性、生物降解性和分散性，被广泛用作纺织品、皮革、油漆等许多领域的表面活性剂。通过引入不同的疏水和亲水基团，赋予磷酸酯不同的表面性质，进而拓展了磷脂的应用。
树脂酸(枞酸，脱氢枞酸，海松酸，海草酸等)是松树和树皮渗出液获得的松香的主要成分树脂酸是富含烃的小分子生物质，具有特征的庞大的氢化菲环结构，使其独特于其他天然生物质。由于松香结构中含有不饱和的双键，通过加成反应可以接上不同的功能集团，赋予不同的性质，也可以通过松香中的羧基的酰氯化，增强松香的反应活性。松香基表面活性剂已经被广泛研究。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种松香基磷酸酯类表面活性剂，包括松香基官能团和磷酸酯官能团以及p-o-c化学键。
本发明的松香基磷酸酯类表面活性剂中的结构式中包括松香基官能团和磷酸酯官能团以及p-o-c化学键，得到了一类新的松香磷酸酯类表面活性剂，该类松香磷酸酯类表面活性剂由于引入了松香三元刚性骨架结构，同卵磷脂相比，改变了亲油基团的空间结构，在自组装过程中，三元环的刚性结构和强亲油性能使其拥有更优异的组装性能和稳定性，可形成多种结构组装体，该类表面活性剂对ph值智能响应性，在不同ph值下具有不同的自组装形态。由于引入的松香基团为天然产物，具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性，加上优异的自组装性能，较之其它表面活性剂，可以用作药物载体和实现药物靶向释放。
本发明的松香基磷酸酯类表面活性剂由多聚磷酸、三氯氧磷或螺旋磷脂与含有松香基的化合物发生酯化反应制得。
其中，含有松香基的化合物为松香酰氯或经三乙醇胺改性的松香胺酯。
所述松香酰氯优选以氯仿为溶剂，由松香与三氯化磷反应制得。
其中，松香与三氯化磷的摩尔比优选为1:(2-3)；反应温度优选为50-55℃，反应时间为3-4h，将三氯化磷缓慢滴加至松香中，反应结束后将混合物旋蒸，即得。
在本发明一个优选实施方式中，松香基磷酸酯类表面活性剂选自下式i、式ii、式iii、式iv四种结构化合物中的一种：
其中，n和m为正整数。
其中，式i化合物由松香酰氯经大豆卵磷脂改性得到，反应历程具体为：
在三乙胺存在的条件下，将大豆卵磷脂与松香酰氯反应得到所述式1化合物。
其中，反应中的溶剂可以为本领域中常用的溶剂，优选为二氧甲烷。
上述反应步骤具体为：向二氯甲烷的大豆卵磷脂溶液中加入预设量的三乙胺做催化剂和缚酸剂，当料温达到40-90℃时，用恒压滴液漏斗滴加松香酰氯的二氯甲烷溶液，控制温度在40-90℃，反应结束冷却至室温，除去二氯甲烷，即得。其中，温度优选为60℃。
其中，三乙胺与松香酰氯的摩尔比为1-3:1，大豆卵磷脂与松香酰氧的摩尔比为1:1-3。
在上述步骤中，可以在反应结束冷却至室温后将产物用10％氢氧化钠溶液洗涤，除去杂质。也可以在使用氢氧化钠溶液洗涤后再向其中加入乙醚用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水。
在本发明的一个优选实施方式中，式ii化合物由以松香酰氯原料，与三乙醇胺发生酯化反应生成ii-a，再与多聚磷酸反应生成ii-b，最后用硫酸二甲酯季铵化制得。
优选为：三乙醇胺
其中，ii-a的制备方法可以为：向松香酰氯的二甲苯溶液中，在抽真空匀速搅拌条件下，缓慢加入三乙醇胺，加热至140-150℃，反应2-6h，除杂，即得。
其中，松香酰氯与三乙醇胺的摩尔比值可以为1-3:1，优选为1.8:1。
其中，除杂步骤可以为：将上述合成出的三乙醇胺松香酯用10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，让不溶于水的松香酰氯皂化；再按饱和氯化钠水溶液与松香三乙醇胺脂的体积比2：8加入饱和氯化钠溶液。最后用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水，即为提纯产物松香胺酯，ii-a。
ii-b的制备方法可以为：将松香胺酯ii-a和多聚磷酸以4:1的比例混合，在二甲苯作为溶剂下反应，反应体系升温至150℃反应，直至基本无气体放出视为反应基本结束大约5-8h，除杂后即得。
其中，除杂步骤具体可以为：反应结束后用10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，除去多聚磷酸，再用乙醚萃取，保留油相，旋蒸除去乙醚。
式ii的制备方法可以为：在异丙醇作为溶剂下，将松香磷脂ii-b加热至全部熔化，在搅拌回流条件下，缓慢滴加硫酸二甲酯进行季铵化反应。滴加完毕后，加热到反应温度，在回流条件下进行反应8h。反应结束冷却后，旋转蒸发除去溶剂。
式ii化合物的制备方法的反应历程具体为：
在本发明一个优选实施方式中，式iii化合物可以由松香酰氯与三乙醇胺以及三氯氧磷反应制得。
反应历程具体可以为：
优选地，可以使用三乙醇胺
在一个优选实施方式中，iii-a的制备方法可以为：在抽真空匀速搅拌条件下，向三乙醇胺二甲苯溶液中缓慢加入松香酰氯二甲苯溶液，控制摩尔比为1-3:1，加热至110-180℃，反应2-10h，除杂，即得。其中，优选控制摩尔比2：0.95，加热至150℃，反应6h，除杂，即得。
除杂的步骤可以为：将合成出的三乙醇胺松香酯用适量左右的10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，让不溶于水的松香酰氯皂化；再按饱和氯化钠水溶液与松香三乙醇胺脂的体积比2：8加入饱和氯化钠溶液。最后用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水。
在一个优选实施方式中，iii的制备方法可以为：将松香胺酯iii-a和三氯氧磷以3:2的混合，加入二甲苯作为溶剂，加入三乙胺做催化剂，并用溶液吸收反应产生的气体。机械搅拌下，将体系升温至150℃反应5-8h，反应结束后用冷水冲洗，除去三氯氧磷，即得。
在一个优选实施方式中，式iv化合物可以由松香酰氯与三乙醇胺反应，再和三氯氧磷与季戊四醇的酯化反应产物反应制得。
式iv化合物的制备方法的反应历程可以为：
式iv化合物以三氯氧磷为原料，乙腈为溶剂，与季戊四醇发生酯化反应，生成中间产物iv-a
在一个优选实施方式中，iv-a的制备方法可以为：按配比将乙腈，季戊四醇和三氯氧磷混合搅拌，缓慢加热至50-90℃，反应1-3h，加入alcl3，当反应体系有白色沉淀生成时，再每隔半小时加入alcl3，温度逐渐恒定在60-90℃，搅拌5-7小时，除杂即得。
其中，除杂可以为：反应完成后旋转蒸发，待体系冷却后依次对产品进行冷水，无水乙醚，二氯甲烷，洗涤，抽滤使其干燥。得到白色沙状固体。
在一个优选实施方式中，iv的制备方法可以为：将松香胺酯iii-a和螺旋磷脂以1:1的比例混合，以二甲苯作为溶剂，机械搅拌下,将体系升温至150℃反应,直至基本无气体放出，反应结束后用冷水冲洗，除去三氯氧磷，即得。
本发明的第二个目的还提供了上述表面活性剂的制备方法，包括以含有松香基的化合物为原料，与多聚磷酸、三氯氧磷或螺旋磷脂发生酯化反应的步骤。
本发明还提供了上述表面活性剂在制备药物增溶剂或药物载体中的应用。
本发明提供的松香基磷酸酯表面活性剂，均含有磷酸酯和氨基亲水基团以及松香三元刚性骨架亲油基团，在自组装过程中，三元环的刚性结构和强亲油性，磷酸酯和氨基的亲水性使其拥有更优异的组装性能和稳定性，可形成多种结构组装体，且具有对ph值智能响应性，在不同ph值具有不同的自组装形态。由于所提供的化合物空间结构和亲水亲油性能类似，具有类似的自组装性能，均融合了松香和磷脂的优势，具有较好的生物相容性、生物降解性和较低的细胞毒性，可以作为药物载体，装载疏水的治癌药物，具有靶向载药效果，可应用于生物医药领域。
附图说明
图1为根据本发明实施例中i化合物的红外谱图；
图2为根据本发明实施例中i化合物的表面张力图；
图3为根据本发明实施例中i化合物(pc-r)的细胞活性图；
图4为根据本发明实施例中i化合物(pc-r)的细胞培养微观图；
图5为根据本发明实施例中i化合物浓度为2cmc的透射电镜图；
图6为根据本发明实施例中i化合物浓度为5cmc的透射电镜图；
图7为根据本发明实施例中i化合物浓度为10cmc的透射电镜图；
图8为根据本发明实施例中i化合物浓度为40cmc，ph＝3、6、9、12的透射电镜图；
图9为根据本发明实施例中i化合物浓度为40cmc时两种ph条件下的药物释放曲线；
图10为根据本发明实施例中iii-a化合物的红外谱图；
图11为根据本发明实施例中iv-a化合物的红外谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例中涉及到的改性松香酰氯制备如下：取100g去氢松香(由一级歧化松香采用乙醇重结晶3-5次)，溶于150ml氯仿中，将pcl3加入到四口瓶中，改性松香与pcl3的摩尔比为1:(2-3)缓慢滴加改性松香的氯仿溶液，反应温度控制在55℃，滴加完毕后继续反应3h，将反应混合物转入圆底烧瓶，旋蒸后得橘黄色粘稠状产品松香酰氯。
实施例1式ⅰ化合物的制备
先将10g大豆卵磷脂溶于30ml二氯甲烷中，再把大豆卵磷脂溶液倒入三口烧瓶中，加入3ml三乙胺做催化剂，当料温达到60℃时，用恒压滴液漏斗滴加30ml含有4.8g松香酰氯的二氯甲烷溶液，控制温度在60℃，反应5h，反应结束冷却至室温，得出的产物用10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，让不溶于水的松香酰氯皂化成盐；最后加入乙醚用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水，即为提纯产物。旋蒸得到黄色粘稠状的化合物式ⅰ。
实施例2式ⅱ-a化合物制备
将10g松香酰氯溶于140ml二甲苯中，加入四口烧瓶，在抽真空匀速搅拌条件下，缓慢加入三乙醇胺，控制摩尔比1.8：1，加热至150℃，反应6h。将合成出的三乙醇胺松香酯用适量的10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，让不溶于水的松香酰氯皂化；再按饱和氯化钠水溶液与松香三乙醇胺脂的体积比2：8加入饱和氯化钠溶液。最后用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水，即为提纯产物松香胺酯化合物ⅱ-a。
实施例3式ⅱ化合物的制备
将ii-a和多聚磷酸以4:1的比例投入带机械搅拌器、回流冷凝管、温度计的四口瓶中，加入二甲苯作为溶剂，并用溶液吸收反应产生的气体。机械搅拌下，将体系升温至150℃反应,直至基本无气体放出视为反应基本结束大约5-8h，用适量的10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，让不溶于水的松香酰氯皂化；再按饱和氯化钠水溶液与松香三乙醇胺脂的体积比2：8加入饱和氯化钠溶液。最后用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水，即为提纯产物ii-b。
取10g(精确到0.001g)酯胺ii-b加入到250ml三口烧瓶中，加入1g(总质量比为10％)的异丙醇作为溶剂，加热到75℃待其全部熔化后，在搅拌回流条件下，缓慢滴加1.715g(按摩尔比n(酯胺)：n(硫酸二甲酯)＝1:2.97)的硫酸二甲酯进行季铵化反应。滴加完毕后，加热到反应温度，在回流条件下进行反应8h。反应结束冷却后，旋转蒸发除去溶剂，得到产品酯季铵盐iii。
实施例4式ⅲ-a化合物的制备
将8.2ml三乙醇胺加入四口烧瓶，在抽真空匀速搅拌条件下，缓慢加入10g松香酰氯二甲苯溶液，控制摩尔比0.95：2，加热至150℃，反应6h。将合成出的三乙醇胺松香酯用适量的10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，让不溶于水的松香酰氯皂化；再按饱和氯化钠水溶液与松香三乙醇胺脂的体积比2：8加入饱和氯化钠溶液。最后用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水，即为提纯产物iii-a。
实施例5式ⅲ化合物的制备
将松香胺酯iii-a和三氯氧磷以3:2的比例投入带机械搅拌器、回流冷凝管、温度计的四口瓶中，加入二甲苯作为溶剂，并用溶液吸收反应产生的气体。机械搅拌下，将体系升温至150℃反应,直至基本无气体放出视为反应基本结束大约5-8h，用适量的10％氢氧化钠化钠溶液洗剂，让不溶于水的松香酰氯皂化；再按饱和氯化钠水溶液与松香三乙醇胺脂的体积比2：8加入饱和氯化钠溶液。最后用分液漏斗分离，弃掉水相，再在所得的油相中加入无水硫酸镁，除去剩余的水，即为提纯产物iii。
实施例6式iv-a化合物的制备
在装有冷凝管，温度计得500ml四口烧瓶中，一次加入370ml乙腈，20g季戊四醇，34ml三氯氧磷。搅拌缓慢加热，当温度升至50℃时，开始有hcl生成，当温度升至76℃时体系彻底澄清，反应1-2h，加入约0.125galcl3，体系逐渐有白色沉淀生成，然后每隔半小时加入0.125galcl3，共加8次，随着反应得进行，温度逐渐恒定在82℃，搅拌5-7小时，使其充分反应，反应完成后旋转蒸发，待体系冷却后依次对产品进行冷水，无水乙醚，二氯甲烷，洗剂，抽滤使其尽可能干燥。得到白色沙状固体。
实施例7式iv化合物的制备
在装有冷凝管，温度计得500ml四口烧瓶中，一次加入148ml乙腈，8g季戊四醇，13.6ml三氯氧磷。搅拌缓慢加热，当温度升至50℃时，开始有hcl生成，当温度升至76℃时体系彻底澄清，反应1-2h，加入约0.04galcl3，体系逐渐有白色沉淀生成，然后每隔半小时加入0.04galcl3，共加8次，随着反应得进行，温度逐渐恒定在82℃，搅拌5-7小时，使其充分反应，反应完成后旋转蒸发，待体系冷却后依次对产品进行冷水，无水乙醚，二氯甲烷，洗剂，抽滤使其尽可能干燥。得到白色沙状固体松香胺酯。
将上述步骤得到的松香胺酯和螺旋磷脂以1:1的比例投入带机械搅拌器、回流冷凝管、温度计的四口瓶中，加入150ml二甲苯作为溶剂，并用naoh溶液吸收反应产生的气体。机械搅拌下，将体系升温至150℃反应,直至基本无气体放出视为反应基本结束大约5-8h,反应结束后用冷水冲洗，除去三氯氧磷。
试验例表征和测试
jem-1010tem测试化合物在溶液中的自组装状态，操作电压120kv。
所制备样品通过傅里叶变换红外(thermonicolet380ftir)光谱记录在红外图谱中，波数范围为500-4000cm-1。
用mts法对材料的浸提液进行hela细胞毒性测试结构表征。
载药性能测试如下：取0.25mg/ml阿霉素盐酸盐溶解于去离子水中，超声使之全部溶解，后滴加到一定浓度的化合物胶束水分散液中，溶液体积共4ml，室温下避光超声搅拌0.5h，最终得到的胶束溶液通过0.15μm滤过器过滤去除阿霉素等残留物质。所得的过滤液用紫外分光光度计在485nm处测定吸光度，然后根据阿霉素标准曲线计算没有负载在胶束上的阿霉素的含量，最终计算出胶束负载的阿霉素的含量。阿霉素的包封率(ee)和载药量(lc)计算方法如下：
阿霉素的体外释放(磷酸缓冲溶液)合适浓度的释放：
采用ph＝7.4和ph＝5的磷酸缓冲溶液，对目标前药进行体外释放研究。将5ml的dox载药胶束用透析袋(3500da)封装在95ml缓冲溶液中透析，并保持体系温度为37℃，转速为100rpm，然后在预定时间间隔(0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12h)从95ml缓冲液中取出2ml用于阿霉素的含量测定，同时加入2ml新缓冲液。所得的缓冲液用紫外分光光度计在485nm处测定吸光度确定所释放出的阿霉素的含量。重复三次。其中，
其中，er：药物累计释放量；ve：pbs的置换体积；ci：第i次置换取样时释放液的浓度；v0：释放介质总体积；n：置换pbs的次数；mdrug：纳米粒子所载药物总质量。
其中，ci：第i次置换取样时释放液的浓度；v：释放介质总体积；n：置换pbs的次数；mdrug：纳米粒子所载药物总质量
式ⅰ化合物
ir谱图如图1所示，与大豆卵磷脂相比1738cm-1为酯的c＝o伸缩振动峰，1051cm-1、1063cm-1为p-o-c伸缩振动峰，1230cm-1为p＝o伸缩振动峰。1804cm-1处是o＝p-o-c＝o弯曲振动峰，说明化合物ⅰ的成功合成。
表面性能测试
图2为i化合物(pc-r)的表面张力图，大豆卵磷脂是一种天然的表面活性剂，临界表面张力为54.45mn/m。用松香酰氯改性之后，其表面张力图如图2所示:cmc＝0.4mmol/l，临界胶束浓度下的表面张力为41.98mn/m。表明改性后的表面性能更佳。
细胞毒性测试
通过使用细胞活力测定法检测被测化合物的细胞毒性。简言之，将hela细胞(atcc，usa)扩增并维持在补充有10％胎牛血清(invitrogen，carlsbad，ca，usa)和100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的dulbecco'smodifiedeagle培养基中(hyclone，logan，ut，usa)在37℃，5％co2下培养。在生长对数期收获细胞，并以最终浓度为3×103个细胞/孔接种到96孔板上。培养24小时后，用200mm浓度的药物处理细胞培养物。将细胞在[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2(4-磺基苯基)-2h-四唑/吩嗪甲硫酸盐(mts/pms；promega，madison，wi，usa)培养72h后，从中取出20μl加入到每个孔中，测量490nm处的吸光度。同时进行用5％乙醇处理的对照组。
图3和4分别为化合物ⅰ(pc-r)的细胞存活率图和在化合物ⅰ(pc-r)在浓度70510ug/ml时培养的细胞微观图，由图可以看出在浓度为3525和70510ug/ml时，细胞72小时后存活率均达到90％以上，表明化合物ⅰ细胞毒性较低，生物相容性优良，而图4中hella细胞均匀有序排列，也证明其存活率高，同图3结果一致。
不同浓度下的自组装能力
图5-7分别为化合物ⅰ分别在2、5、10cmc的透射电镜图。当表面活性剂浓度为2cmc时，胶束形态为球形，直径在100nm以下，当浓度增大到5cmc，为椭圆状，大小为10nm以内，而当浓度达到10mc时，出现囊泡结构。表明化合物ⅰ具有优异的自组装性能。
化合物i的ph值响应性
图8为化合物ⅰ分别在40cmcph＝3、6、9、12的透射电镜图；由电镜图可看出，化合物ⅰ在水溶液中，40cmc时分别自组装成片状、梭形、囊泡和纤维管结构，表明其对ph敏感，具有优异的ph响应性能。
药载和靶向作用
化合物ⅰ在40cmc时ph为7.4时包封率(ee)和载药量(lc)可达82.5％和20％，表明具有优异载药性能。
由图9的释放曲线可看出，在两种不同ph条件下，药载释放差别较大，表明可实现对ph的靶向释放作用。
式iii-a化合物
ir谱图如图10所示，1724cm-1为酯的c＝o伸缩振动峰，1642cm-1为c＝o伸缩振动峰，松香酸骨架中的c＝c伸缩振动峰在1462cm-1、1380cm-1和1170cm-1处出现，3405cm-1是-oh伸缩振动峰，说明化合物iii-a的成功合成。
式iv-a化合物的ir谱图
ir谱图如图11所示，1308cm-1为酯的p＝o伸缩振动峰，1020cm-1为p-o-c伸缩振动峰，922cm-1、850cm-1、782cm-1和688cm-1为螺旋振动峰，550cm-1是p-cl伸缩振动峰，说明化合物ⅳ-a的成功合成。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。