检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组和检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测领域，具体涉及检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组和检测试剂盒。

背景技术：
：

目前，临床上用于耳聋基因检测的试剂盒都是基因芯片方法和pcr测序法，但遗传性耳聋基因检测试剂盒采用的arms-pcr和荧光凝胶电泳技术结合方法与芯片技术相比，具有检测位点数量多、灵敏性高、稳定性好、经济高效、耗时短和通量高等优点，其应用于临床耳聋基因筛查的优越性明显，如用于孕前预防、孕期干预和产后筛查等。

耳聋是世界范围内最常见的感觉障碍性疾病之一，先天性耳聋可引发言语障碍。据第二次全国残疾人抽样调查显示，我国听力残疾人数约2004万人，占残疾人总数的24.16％；耳聋导致的言语残疾约127万人，占残疾人总数的1.53％。先天性耳聋在新生儿中的发病率约为1/1000，其中一半以上的先天性耳聋与遗传基因有关。直到1993年prezant等首次发现线粒体12srrnaal555g突变与非综合征型耳聋有关，科学家们才开始对耳聋相关基因展开迅速的研究，至1995年第一个引起nshi的核基因pou3f4被鉴定。随着人类基因组计划的完成及后基因组计划的实施和分子生物学技术的发展，与耳聋相关的基因不断被定位和发现，目前已经确定140余个基因与非综合征型耳聋相关，其中包括dfna位点52个、dfnb位点79个、dfn位点5个、dfny位点1个；克隆致病基因58个：其中dfna相关基因24个、dfnb相关基因40个、dfn相关基因2个、另外2个线粒体基因与非综合征型耳聋相关。这就给非综合征型耳聋基因检测提供了有力的数据支持。

结合arms-pcr和荧光凝胶电泳技术的诸多检测优势，希望建立复合荧光检测遗传性耳聋基因筛查系统，具有广阔的应用前景。目前临床上对耳聋基因的检测主要集中在基因dna分子水平，具有很高的特异识别能力。近年来，随着研究人员对耳聋致病基因的深入研究发现，增加耳聋基因的特异性突变位点，扩大耳聋基因的检测范围，能大大提高耳聋基因的检测筛查能力。目前检测耳聋基因dna的方法主要基于芯片技术和测序技术，存在操作复杂，耗时长，成本高及对操作人员要求高等不足，因此本发明在gjb2、gjb3、slc26a4和线粒体基因上同时挑选一些在中国地区热点突变的多态性位点位点，构成复合扩增检测系统，具有操作简便和实用性强，且快速、耗时短、经济高效、直观等优点。

耳聋基因dna检测的专利几乎集中在gjb2和线粒体基因上的热点突变上，但总体涉及的特异性位点较少，当前国家认证的《一种检测遗传性耳聋的试剂盒》采用的是基因芯片的方法。本发明采用的是荧光标记引物和arms-pcr的方法，从全新的角度对耳聋基因dna进行发明，使耳聋基因检测识别能力大大提高。

为了提高鉴别能力，申请人对全国各地区的人耳聋基因热点突变位点的遗传多态性进行了深入的调查，选择了多态性位点较高的8个多态性位点，并以此为依据开发了遗传性耳聋基因检测试剂盒，此种试剂盒目前全球未见报道与使用，因此是本领域人员一直期望解决的问题，具有广阔的应用前景。

技术实现要素：
：

本发明的目的是之一提供检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组。

本发明的目的是之二提供利用上述检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组制备的检测试剂盒。

作为本发明第一方面的检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组，包含如下引物：

gjb2-f:gcaaaccgcccagagtagaa；

gjb2-r:cctcgatgtccttaaattcactc；

slc26a4-f:gctgctactatcatgtatgtatttc；

slc26a4-r:atagcataagccaccacagcg；

12srrna-f:ggtcgaaggtggatttagcag；

12srrna-r:tcagagcggtcaagttaagttg；

gjb3-f:ttcagcctcatcttcaagctcat；

gjb3-r:agatgaggtagcagagctcac。

作为本发明的利用上述检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组制备的检测试剂盒,包含上述引物组。

使用本发明上述引物可进行4个常见的耳聋相关基因8个位点的筛查，包括gjb2(35delg、176del16、235delc、299delat)、gjb3(538c>t)、slc26a4(ivs7-2a>g)和线粒体12srrna(1494c>t、1555a>g)共9个热点突变位点使用pcr直接测序的方法进行检测。

附图说明

图1为本发明gjb3(538c>t)检测结果示意图。

图2为本发明线粒体12srrna(1494c>t)检测结果示意图。

图3为本发明线粒体12srrna(1555a>g)检测结果示意图。

图4为本发明gjb2(35delg)检测结果示意图。

图5为本发明gjb2(176del16)检测结果示意图。

图6为本发明gjb2(235delc)检测结果示意图。

图7为本发明gjb2(299delat)检测结果示意图。

图8为本发明slc26a4(ivs7-2a>g)检测结果示意图。

具体实施方式

本发明的检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组包含如下引物：

gjb2-f:gcaaaccgcccagagtagaa；

gjb2-r:cctcgatgtccttaaattcactc；

slc26a4-f:gctgctactatcatgtatgtatttc；

slc26a4-r:atagcataagccaccacagcg；

12srrna-f:ggtcgaaggtggatttagcag；

12srrna-r:tcagagcggtcaagttaagttg；

gjb3-f:ttcagcctcatcttcaagctcat；

gjb3-r:agatgaggtagcagagctcac。

检测遗传性耳聋相关基因多态性的引物组制备的检测试剂盒,包含上述引物组。

上述引物的制备方法和检测方法以及检测结果如下：

一、基因组提取：提取人基因组dna(唾液样本为例)

1.该sop适用于用·l2p试剂提取由oragene及oracollect系列产品收集的唾液样本基因组dna。

1)将oragene·dna(og-500)唾液收集管中的样本轻轻颠倒混匀10s。

2)将唾液收集管于50℃水浴至少1h(空气浴至少2h)。

3)取500μl混合后的唾液样本于1.5ml离心管中，剩余样本于常温保存。

4)在500μl唾液中加入20μl(1/25唾液体积)pt-l2p，漩涡振荡10秒，短暂离心。

5)冰上孵育10min。

6)室温15,000×g离心5min(时间允许的话离心15min效果更好)。

7)将移液器量程调至200μl，小心地将干净的上清液转移到新的1.5ml离心管中，丢弃含有杂质沉淀的离心管。

注：转移上清的过程中枪头一定不要碰到杂质沉淀。若不小心碰到沉淀，则必须将微量离心管重新离心再转移上清。

8)在500ul上清中加入600ul室温放置的无水乙醇，轻轻颠倒混匀10次。

9)将上述混合物室温孵育10min，使dna充分沉淀。

10)将离心管按管盖开口朝向转子中心的方向放入离心机中，室温15,000×g离心2min。

11)用移液器小心地去除上清液并将其丢弃。

注：吸除上清的时候首先将移液器调至500μl，去除上清液一次。再将移液器调至200μl，尽可能彻底除去剩余的上清。这个过程中不要碰到dna沉淀。

12)在含有dna沉淀的离心管中小心地加入250μl70％的乙醇，室温放置1min。在不碰到dna沉淀的情况下彻底去除乙醇。

注：残留乙醇会影响dna质量，一定要彻底去除乙醇。如果沉淀分离，可以将样本于室温下15,000×g离心5min。

13)加入50-100ulte溶解dna沉淀，漩涡振荡至少5s。溶解后的dna在50℃放置1h以完全溶解dna，期间振荡几次。

2.dna质量检测

1)dna质量检测：取3μldna样品加入1μl6xloadingbuffer，用枪吸打混匀。调枪至4μl，吸取全部样品加入1％琼脂糖凝胶孔中，点3μldl15000marker，140v电泳15分钟。电泳结束后，将胶块放入凝胶成像系统中拍照，图片存入相应的文件夹。

2)取1μldna样品(可稀释10倍)，用te稀释30倍，加入30μlpicogreen荧光染料(te稀释200倍)，短暂震荡离心后转移50μl混合溶液至minicell中。若minicell中的液体有气泡或没有全部加到底部，可以通过用手甩几下的方式赶走气泡并将液体甩入minicell底部。将minicell放入tbs380，按下read键，记下读数。利用标准曲线，计算样品浓度，并记录。

二、引物设计与合成

在相应的snp位点上下400bp左右的序列上利用引物设计软件primer5设计相应的引物，由上海派森诺生物科技有限公司合成，采用page纯化法进行制备。page纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对dna片段进行分离，然后从凝胶中回收目的dna的方法。page纯化法也是一种非常有效的dna纯化方法，纯化后的dna纯度大于95％。

三、pcr扩增：对总dna进行扩增，得到相应的基因片段。

pcr扩增

①配制pcr反应液(50μl)：

其中，2×pcrmaster(1ml)为：

②pcr程序(touchdown)

98℃5min

98℃10s

62℃10s

15cycles(退火温度从第二个循环开始，每个循环72℃30s0.5℃)

目标片段检测

取3μldna样品加入0.5μl10xloadingbuffer，用枪吸打混匀。调枪至5μl，吸取全部样品加入2％琼脂糖凝胶孔中，点2μldl15000marker，140v电泳15分钟。电泳结束后，将胶块放入凝胶成像系统中拍照，图片存入相应的文件夹。

四、一代测序利用基于sanger双脱氧链终止法的技术进行一代测序，所用测序仪为abi3730xl。

胶图中目的片段大小正确且条带清晰，可将pcr产物直接送去测序并正确填写测序单。任意选取一端的引物作为测序引物，引物浓度10μm。

将对照序列与测序序列用bioedit或alignx软件进行比对，或直接将序列输入ncbi网站核酸比对，找到多态性位点，观察该位点是否发生突变或是峰图中出现杂合峰。

使用上述引物可进行4个常见的耳聋相关基因8个位点的筛查，包括gjb2(35delg、176del16、235delc、299delat)、gjb3(538c>t)、slc26a4(ivs7-2a>g)和线粒体12srrna(1494c>t、1555a>g)共9个热点突变位点使用pcr直接测序的方法进行检测(参见图1至图4)。