用于筛选ASICs作用蛋白的酵母双杂交诱饵载体的构建方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，涉及酸敏感离子通道(asics)中asic1a、asic2a亚基胞外环基因酵母双杂交诱饵载体pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a的构建与表达。
背景技术：
：酸敏感离子通道(acid-sensingionchannels，asics)是一类由胞外酸化所激活的阳离子通道，属于enac(na+channel)/deg(degener-in)通道家族的一员。enac/deg成员的共同特点是均为非电压门控的对na+有高通透性的离子通道，这些通道通常由数个亚基组成，而不同亚基却有着类似的拓朴学结构。到目前为止已克隆了由4个基因编码的7个asics亚基，分别是asic1a、1b、1b2、2a、2b、3和4。asics的亚基由500多个氨基酸组成，其结构包含2个疏水跨膜区，即跨膜1区(tm1)和跨膜2区(tm2)，另有一个巨大的富含半胱氨酸的胞外环和胞内的羧基(c)端和氨基(n)端。研究表明，asics在炎症引起的疼痛、伤害感觉、酸味觉及其他生理功能方面发挥重要作用，其分子结构与分布特点的研究已经比较充分，而对于其蛋白质之间相互作用及调控机制还缺乏了解。酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)是以真核生物酵母为模型，能够大规模筛选、发现与验证体内蛋白质间相互作用，具有高敏感性，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测到。自1989年初步建立以来，酵母双杂交系统得到了不断改进和完善，相应的诱饵蛋白载体也随之出现。对研究者来说选用合适的酵母双杂交系统和诱饵载体极其重要。本发明利用基因工程技术，将酸敏感离子通道(asics)中asic1a、asic2a亚基胞外环基因分别克隆到酵母双杂交诱饵载体pgbkt7上，成功构建了两种酵母双杂交诱饵载体pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a，并实现了所构建载体的表达及鉴定工作，证明了该重组诱饵载体可用于酵母双杂交体系，为应用酵母双杂交系统来筛选asics相互作用蛋白质研究及进一步asics调控机制研究建立了重要的实验基础，也为炎症疼痛治疗开拓了新的方向。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可用于筛选asics作用蛋白的酵母双杂交诱饵载体及其构建方法。该方法将酸敏感离子通道(asics)中asic1a、asic2a亚基胞外环基因分别克隆到酵母双杂交诱饵载体pgbkt7上，成功构建了两种酵母双杂交诱饵载体pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a，并对所构建载体进行鉴定及表达。本发明采用如下技术方案：1.pcr反应扩增目的基因片段根据genbank查询到的asic1a、asic2a亚基基因序列(asic1a胞外环序列为1086bp，asic2a胞外环序列为1086bp)，应用primerpremier5.0软件分析、设计pcr引物：asic1a上游引物：gggaattccatatgtactacttctgctatcaccac，asic1a下游引物：acgcgtcgacttaccctgcgatctcataggc，asic2a上游引物：gggaattccatatgtactatttctcttatcagcatg，asic2a下游引物：acgcgtcgacttaggcagcaacttcatacgcasic，引物由南京金思特生物技术有限公司合成，通过pcr扩增获取产物，所述的pcr反应体系为：5×primestartm缓冲液(mg2+plus)10μl，dntp混合物(各2.5mm)4μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，dna模板(100ng/μl)1μl，primestartmhsdna聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，ddh2o32.5μl。2.pcr产物鉴定与回收pcr反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测分析pcr扩增得到的产物。3.pcr产物的酶切取含asic1a、asic2a亚基片段序列的pcr产物进行ndei和sali双酶切，回收目的片段，双酶切反应体系为：dna10μl，buffertangowithbsa5μl，ndei1μl，sali1μl，ddh2o8μl。4.pgbkt7质粒dna的酶切、鉴定与回收pgbkt7质粒为美国takara公司matchmaker酵母双杂交系统dna结合结构域融合载体。对pgbkt7质粒同样进行ndei和sali双酶切并回收线性载体片段。5.连接与转化将回收的目的片段和线性载体定向匹配连接，完成pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a重组质粒的构建，转化大肠杆菌top10感受态细胞，接种至lb抗性平板培养；其中，转化大肠杆菌top10感受态细胞的具体转化操作如下：(1)从-70℃冰箱中取200μl大肠杆菌top10感受态细胞悬液，室温下解冻后立即置冰上；(2)加入含量不超过50ng、体积不超过10μl的pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a重组质粒dna溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min；(3)42℃水浴中热激90s，热激后迅速置于冰上冷却3-5min；(4)加入1ml不含氨苄青霉素的lb液体培养基，混匀，37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；(5)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含卡那霉素的lb筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。6.菌落pcr与测序鉴定挑取上述lb平板菌落做菌落pcr，根据菌落pcr结果分别摇菌，取菌液送南京金思特生物技术有限公司做测序鉴定。7.扩大培养与保藏对上述第6点鉴定阳性菌落挑取单个克隆进行扩大培养并用甘油管进行保藏。通过本发明的实施，构建了两种酵母双杂交诱饵载体pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a，可用于酵母双杂交体系，为应用酵母双杂交系统来筛选asics相互作用蛋白质研究及进一步asics调控机制研究建立了重要的实验基础，同时为炎症疼痛治疗开拓了新的方向。附图说明图1是pgbkt7质粒图谱。图2是目的基因片段pcr扩增与pgbkt7质粒双酶切鉴定结果图。图中，m为dnamarker；a、b分别为asic1a、asic2a的pcr产物；c为pgbkt7质粒双酶切产物。图3是菌落pcr结果图。图中，m为dnamarker；a、b、c为三个pgbkt7-asic1a菌落pcr结果；d、e、f为三个pgbkt7-asic2a菌落pcr结果。图4是pgbkt7-asic1a测序结果图。图5是pgbkt7-asic2a测序结果图。具体实施方式本发明实施例公开了酸敏感离子通道(asics)中asic1a、asic2a亚基胞外环基因酵母双杂交诱饵载体pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a的构建与表达。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关技术参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行给出了详细的实施方式和具体的操作过程。实施例步骤一，pcr反应扩增目的基因片段及产物鉴定、回收1.pcr反应扩增目的基因片段根据genbank查询到的asic1a、asic2a亚基基因序列(asic1a胞外环序列为1086bp，asic2a胞外环序列为1086bp)，应用primerpremier5.0软件分析、设计pcr引物，引物序列见表1，引物合成由南京金思特生物技术有限公司完成。pcr反应体系见表2，asic1a、asic2a亚基dna模板均为湖南师范大学蛋白质组学与发育生物学省部共建国家重点实验室培育基地提供，扩增条件为：起始变性98℃5min，然后执行如下反应条件：98℃10s，56℃15s，72℃1.5min，35个循环，最后72℃延伸5min。表1引物序列表asic1a上游引物gggaattccatatgtactacttctgctatcaccacasic1a上游引物acgcgtcgacttaccctgcgatctcataggcasic2a上游引物gggaattccatatgtactatttctcttatcagcatgasic2a上游引物acgcgtcgacttaggcagcaacttcatacgc表2pcr反应体系(50μl)5×primestartm缓冲液(mg2+plus)10μldntp混合物(各2.5mm)4μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μldna模板(100ng/μl)1μlprimestartmhsdna聚合酶(2.5u/μl)0.5μlddh2o32.5μl2.pcr产物鉴定与回收pcr反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测分析pcr扩增得到的产物。用tae热溶解2.0％琼脂糖凝胶，稍冷后加入eb，铺胶。dna溶液中加凝胶加样缓冲液(6:1)上样电泳，电泳缓冲液也用1×tae，电压为1～5v/cm。电泳结束后，凝胶内dna于紫外灯下观察并拍照(tanongis-1000凝胶成像系统，上海天能科技有限公司)。如图2所示，可见扩增出1080bp特异性的asic1a、asic2a亚基片段，采用ezspincolumndnagelextractionkit试剂盒(roche公司)进行胶回收。3.胶回收产物的酶切、鉴定与回收取含asic1a、asic2a亚基片段序列的胶回收产物进行ndei(takara公司)和sali(takara公司)双酶切，限制性内切酶酶切反应体系见表3，37℃水浴酶切16-18h，2.0％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段(同上)。表3限制性内切酶酶切反应体系(25μl)dna10μlbuffertangowithbsa5μlndei1μlsali1μlddh2o8μl步骤二，pgbkt7质粒dna的酶切、鉴定与回收pgbkt7质粒，全长大小7300bp，卡那霉素抗性，为美国takara公司matchmaker酵母双杂交系统dna结合结构域融合载体。对pgbkt7质粒同样进行ndei(takara公司)和sali(takara公司)双酶切(反应体系同表2)，2.0％琼脂糖凝胶电泳后(图2可见pgbkt7质粒双酶切产物)，回收线性载体片段(同上)。步骤三，连接与转化将回收的目的片段和线性载体定向匹配连接(dnaligationkit，takara公司)，完成pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a重组质粒的构建，转化大肠杆菌top10感受态细胞(湖南师范大学蛋白质组学与发育生物学省部共建国家重点实验室培育基地提供)，具体转化操作如下：1.从-70℃冰箱中取200μl大肠杆菌top10感受态细胞悬液，室温下解冻后立即置冰上；2.加入pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a重组质粒dna溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30min；3.42℃水浴(dk-98-1型电热恒温水温箱，天津泰斯特仪器有限公司)中热激90s，热激后迅速置于冰上冷却3-5min；4.加入1ml的lb液体培养基(不含氨苄霉素amp)，混匀，37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；5.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含卡那霉素kan的lb筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。步骤四，菌落pcr与测序鉴定挑取上述lb平板菌落做菌落pcr，图3为三个pgbkt7-asic1a菌落及三个pgbkt7-asic2a菌落pcr结果，根据菌落pcr结果分别摇菌，取菌液送南京金思特生物技术有限公司做测序鉴定。测序结果见图4、5，分析表明，asic1a和asic2a胞外环dna片段均正确插入克隆载体pgbkt7相应酶切位点中，其序列在dnaman软件上进行alignment序列比对分析，所要构建的基因序列完全一致，酵母双杂交诱饵载体pgbkt7-asic1a和pgbkt7-asic2a的构建与表达鉴定成功完成，为应用酵母双杂交系统来筛选asics相互作用蛋白质研究及进一步asics调控机制研究建立了重要的实验基础，也为炎症疼痛治疗开拓新的方向。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12